劉寶，范輝華，彭珠清，劉燕，陳存及

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省林業(yè)科學(xué)研究院，福建 福州 350012）

不同地理種源無(wú)患子的分子多態(tài)性分析

劉寶1，范輝華2，彭珠清1，劉燕1，陳存及1

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省林業(yè)科學(xué)研究院，福建 福州 350012）

利用篩選出的18對(duì)相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）引物對(duì)12個(gè)來(lái)自印度和中國(guó)不同種源的無(wú)患子進(jìn)行SRAP擴(kuò)增，計(jì)算Dice遺傳相似系數(shù)后用非加權(quán)組平均法（UPGMA）法進(jìn)行聚類，分析其親緣關(guān)系，以便為今后無(wú)患子Sapindus mukorossi優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保存、選育和后續(xù)研究提供參考。試驗(yàn)結(jié)果表明：12個(gè)樣本共擴(kuò)增出253個(gè)帶型，其中191條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率為75.16%，樣本的平均遺傳相似系數(shù)為0.739，顯示出無(wú)患子種內(nèi)的相似度較高，遺傳分化不明顯。聚類分析表明：印度南的種源與其他種源產(chǎn)生較大的遺傳分異，而印度北的種源由于地理緯度與中國(guó)國(guó)內(nèi)種源較為相近，因此，和中國(guó)國(guó)內(nèi)種源的遺傳距離沒(méi)有印度南種源相差那么大，各種源間的遺傳距離與地理距離基本服從正相關(guān)的關(guān)系。圖2表3參12

植物學(xué)；無(wú)患子；地理種源；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）；親緣關(guān)系；分子多態(tài)性

無(wú)患子Sapindus mukorossi主要分布于中國(guó)淮河以南各地，印度和日本也有分布，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的樹(shù)種，其果可以提取皂苷制作肥皂等清潔用品，同時(shí)也能用作生產(chǎn)農(nóng)藥的原料；其樹(shù)形優(yōu)美，可吸收汽車尾氣、二氧化硫等有害氣體，是一種良好的行道樹(shù)種；另外，它根系發(fā)達(dá)，在水土保持方面也有很大的利用價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)通過(guò)分子手段揭示無(wú)患子不同種源之間遺傳差異的研究，國(guó)外Mahar等［1］通過(guò)提取無(wú)患子DNA，采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）標(biāo)記、DAMD（directed amplification of minisatellite region DNA）、簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（inter-simple sequence repeat，ISSR）標(biāo)記分析了印度5個(gè)不同種源地的遺傳多樣性，但在相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子標(biāo)記的運(yùn)用上還存在著很大的空白。SRAP分子標(biāo)記技術(shù)具有操作方便快捷、預(yù)先不用知道DNA序列的優(yōu)點(diǎn)，并已在多種經(jīng)濟(jì)樹(shù)種的種質(zhì)資源研究中得到運(yùn)用［2-4］。因此，本研究運(yùn)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)的10個(gè)地理種源和印度的2個(gè)地理種源為對(duì)象進(jìn)行多態(tài)性和親緣關(guān)系的分析，為無(wú)患子優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的保存、親緣關(guān)系的判斷、育種方案的制定等提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料是采于福建省順昌縣無(wú)患子種源收集區(qū)的12個(gè)種源材料，取3株·種源-1，選擇剛展開(kāi)的幼葉，用硅膠干燥法保存帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱備用提取DNA。種源涵蓋了中國(guó)浙江省、江西省、廣西省和福建省，及印度南北。

表1 無(wú)患子種源地理位置Table 1 Geographic positions of Sapindus mukorossi provenances

1.2 總DNA的提取與測(cè)定

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA［5-6］，用核酸蛋白分析儀測(cè)定提取的DNA濃度和純度，用電泳法檢測(cè)DNA的完整性，放入-20℃下存儲(chǔ)備用。

1.3 PCR擴(kuò)增、條件優(yōu)化和檢測(cè)

SRAP的引物購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。擴(kuò)增反應(yīng)在德國(guó)Eppendorf PCR基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系，20 μL體積中，含2.0 mmol·L-1Mg2+，0.2 mmol·L-1dNTPs，0.4 mmol·L-1primers，0.5×16.67 nkat TaqDNA酶，50 ng DNA。

SRAP-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min共5個(gè)循環(huán)；再94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離后放入溴化乙錠（EB）中染色，然后用熒光/可見(jiàn)光數(shù)字成像分析系統(tǒng)（Alphalmager HP）拍照觀察并保存。

1.4 引物篩選

以印度北和浙江杭州的DNA為模板鏈進(jìn)行引物篩選，從88對(duì)SRAP引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、帶較多多態(tài)性較好的引物18對(duì)，用于12個(gè)無(wú)患子樣品的SRAP分析。引物組合擴(kuò)增情況見(jiàn)表2。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

根據(jù)SRAP擴(kuò)增產(chǎn)物相同位置清晰可辨的電泳帶的有無(wú)為統(tǒng)計(jì)對(duì)象，有記為“1”，無(wú)記為“0”，在Excel表格上建立0，1矩陣圖，用NTSYS-pc統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算Dice遺傳相似系數(shù)，并進(jìn)行非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析。相似性系數(shù)=（2×樣品a和b共有的相同位置數(shù)）/（a樣品的位置數(shù)+b樣品的位置數(shù)）。

表2 引物組合擴(kuò)增情況Table 2 Results of amplification

2 結(jié)果和分析

2.1 多態(tài)性分析

從88對(duì)SRAP引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、帶較多多態(tài)性較好的引物18對(duì)（表2），用于12個(gè)不同種源無(wú)患子樣品的SRAP分析，共擴(kuò)增出253條清晰可用的條帶，分子量為100～3 000 bp，個(gè)別超過(guò)3 000 bp（圖1）。其中多態(tài)性條帶191條，占總條帶的75.16%。每對(duì)引物擴(kuò)增出7～18條多態(tài)性譜帶，平均產(chǎn)生14.06條。條帶統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：對(duì)于同一個(gè)種源（以印度南為例），不同的引物組合擴(kuò)增出5（m6e10）～14（m7e5）條條帶，條帶數(shù)目不同，分子量不同，說(shuō)明不同引物組合在DNA模板鏈上的結(jié)合位點(diǎn)不同擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)短不一，顯示了多態(tài)性。同一對(duì)引物（以m6e1為例）對(duì)不同種源擴(kuò)增出的條帶為7（印度南）～11（清流）條，且條帶位點(diǎn)有很大差異，體現(xiàn)了各種源樣本的遺傳差別。此外，在所有引物組合顯示的條帶中，總有1～2個(gè)位點(diǎn)上有特別明亮的特征帶型是大部分種源共有的，顯示了種源間的相似性。

圖1 m6e1為引物的擴(kuò)增電泳圖Figure 1 SRAP map of Sapindus mukorossiprovenance genome amplified with primer pair m6e1

圖2 無(wú)患子12個(gè)種源地的聚類圖Figure 2 Dendrogram of 12 Sapindus mukorossi provenances

2.2 無(wú)患子地理種源間親緣關(guān)系的聚類分析

根據(jù)SRAP結(jié)果計(jì)算出Dice遺傳相似系數(shù)（表3），可以看出相似性最高的是福建順昌和福建順昌高陽(yáng)的2個(gè)種源，為0.881；最低的是印度南和浙江杭州及印度南和永安，都為0.585。無(wú)患子種源間的平均相似系數(shù)為0.739，顯示出無(wú)患子種源之間遺傳距離較近。運(yùn)用UPGMA法對(duì)12個(gè)種源進(jìn)行聚類分析，得到聚類圖（圖2）?？梢缘贸霎?dāng)相似系數(shù)以0.600為界時(shí)，印度南和其他種源地區(qū)分開(kāi)；以0.720為界時(shí)，印度北和其他的種源地區(qū)分開(kāi)；以0.735為界時(shí)，區(qū)分出福建漳州龍海和余下的種源；以0.760為界時(shí)又將福建清流種源分出來(lái)。而再往后，相似系數(shù)在0.780以后分為2類，第1組為廣西欽州、福建順昌高陽(yáng)和福建順昌，第2組為福建南平、福建永安、福建三明、浙江杭州、江西樟樹(shù)。第1組中，距離最接近的福建順昌和福建順昌高陽(yáng)聚為一類，與廣西欽州區(qū)分開(kāi)來(lái)。第2組中，地理位置最接近的福建三明和福建永安聚為一類后，與福建南平在0.810處相聚，然后此三者在0.795處和浙江杭州聚為一類，最終在0.788處和江西樟樹(shù)聚為一類。從聚類結(jié)果不難看出，印度南種源有明顯的遺傳分異，而印度北因與國(guó)內(nèi)的種源在緯度上較為接近，生長(zhǎng)的光照、熱量等條件較接近，因此，分化不太大。國(guó)內(nèi)的種源間的親緣關(guān)系也大致和地理距離呈正相關(guān)，但廣西欽州、浙江杭州2處種源的親緣關(guān)系規(guī)律就和以上趨勢(shì)有較大出入。

表3 各種源材料的相似系數(shù)Table 3 Similarity coefficient of 12 Sapindus mukorossi provenances

3 討論

3.1 無(wú)患子地理種源的遺傳多樣性水平

一部分植物種［4，7-9］使用SRAP標(biāo)記的材料出現(xiàn)了很高的多態(tài)性，多態(tài)條帶占90%以上，驗(yàn)證了SRAP標(biāo)記的高多態(tài)性；還有一部分如甘藍(lán)Brassica oleraceavar.capitata［8］，旱芹Apium graveolens［10］的多態(tài)性分別為51.7%，39.0%，則顯示的多態(tài)性較低。而本試驗(yàn)所研究的無(wú)患子不同引物組合擴(kuò)增結(jié)果的平均多態(tài)性為75.2%，多態(tài)性一般。由此可見(jiàn)，SRAP的擴(kuò)增多態(tài)性在不同種之間是有差異的。另外，根據(jù)Wang等［10］對(duì)旱芹的研究，在簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）和SRAP對(duì)比的情況下，SSR的平均多態(tài)性是49.2%，高于SRAP的39.0%也證明了SRAP標(biāo)記不是在任何情況下都能呈現(xiàn)最大的多態(tài)性。

在本試驗(yàn)中，不同引物擴(kuò)增出的多態(tài)率為50.00%～92.31%，顯示了不同引物組合的多態(tài)性，說(shuō)明無(wú)患子的遺傳多樣性在其DNA不同位置的片段上體現(xiàn)的程度有較大差異，這一點(diǎn)在Kamalesh等［1］對(duì)69個(gè)無(wú)患子材料所用的RAPD（不同引物的多態(tài)性為100%～46%），DAMD（100%～70%），ISSR（100%～60%）標(biāo)記上也有體現(xiàn)。因此可以對(duì)無(wú)患子分子標(biāo)記的引物選擇做更深入的探究。

3.2 無(wú)患子地理種源的遺傳相似性的聚類分析

種源間的平均相似系數(shù)為0.739，顯示出無(wú)患子的種內(nèi)變異很小，這與Kamalesh等［1］對(duì)印度的無(wú)患子種源進(jìn)行多樣性分析得到的結(jié)果相符。Kamalesh等推測(cè)原因是由于無(wú)患子樹(shù)為雌雄同株，并主要靠蟲媒傳粉，當(dāng)植株較大時(shí)，因?yàn)閭鞣劾ハx（主要為蜜蜂Apis）會(huì)在同一植株體上來(lái)回停留，使得雌雄配子均來(lái)自同一植株，造成子代遺傳分異小。

很多研究表明［10-12］遺傳距離與地理距離有一定的正相關(guān)性。從聚類圖來(lái)看，最初，種源地被很明顯的分為2支，印度南的種源單獨(dú)一支。因?yàn)橛《饶系姆N源是與所有種源地相隔最遠(yuǎn)的種源，與其他種源之間的異質(zhì)性最大，因而產(chǎn)生了最大的遺傳分異。而印度北的種源和印度南的種源相比，印度北種源和國(guó)內(nèi)種源的遺傳距離沒(méi)有印度南種源大，除了樹(shù)種本身的遺傳特性外，還有可能是印度北種源地和國(guó)內(nèi)種源地的緯度更為接近，如光照、溫度這些對(duì)植物生長(zhǎng)影響較大的生態(tài)因子差別不大。根據(jù)無(wú)患子種源地的聚類圖，可將除印度南之外的種源全都?xì)w為一群，而群內(nèi)的遺傳距離與地理距離基本服從正相關(guān)的關(guān)系。個(gè)別特殊，如漳州龍海和永安的聚類結(jié)果可能是歷史上曾發(fā)生過(guò)引種或地質(zhì)變遷等，或者是種源相似系數(shù)太接近，以至于微小的試驗(yàn)誤差就能引起聚類結(jié)果的不同。就后一種可能情況而言，在繪制聚類圖時(shí)，可以將每對(duì)引物擴(kuò)增得到的結(jié)果進(jìn)行逐步累積，直到聚類關(guān)系基本穩(wěn)定。但關(guān)于穩(wěn)定的范圍還有待進(jìn)一步研究確定。

從研究結(jié)果看，無(wú)患子的種內(nèi)分化較小，在進(jìn)行無(wú)患子的種質(zhì)資源保護(hù)和繁育時(shí)應(yīng)注意聚集隔離度較高的不同種源地的種源進(jìn)行繁殖，以獲得更具遺傳多樣性的無(wú)患子后代。

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Molecular polymorphic analysis with geographic provenances of Sapindus mukorossi

LIU Bao1，F(xiàn)AN Huihua2，PENG Zhuqing1，LIU Yan1，CHEN Cunji1
（Forestry College，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，F(xiàn)ujian，China；2.Fujian Research Institute of Forestry,Fuzhou 350012，F(xiàn)ujian，China）

To determine reference material for selective breeding ofSapindus mukorossi,genome DNA of 12 accessions,which were collected from different regions of India and China，were amplified with the sequencerelated amplified polymorphism（SRAP）method using 18 primer pairs.Then，the cumulative band data generated from SRAP was used to calculate the Dice genetic similarity coefficient which was analyzed by the Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean（UPGMA）to detect their mutual relationships.Genetic diversity was determined with a cluster analysis.Results showed that 191 of the total 253 generated bands were polymorphic（75.16%）with a mean coefficient of 0.739.The cluster analysis showed that the provenance in southern India had greater genetic diversity than other provenances.Compared to the provenance of southern India，less genetic diversity was noted for provenances of northern India and Chinese provenances where geographic latitudes were similar.Positive relationships occurred between genetic distance and geographic distance in 12 geographic provenances ofS.mukorossi.Overall，the results showed a low level of diversity in this species.［Ch，2 fig.3 tab.12 ref.］

botany；Sapindus mukorossi；geographic provenances；sequence-related amplified polymorphism（SRAP）；relationship；molecular polymorphism

S686；Q943

A

2095-0756（2014）01-0151-05

10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.023

2013-03-05；

2013-06-21

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201104100）

劉寶，講師，博士研究生，從事森林培育學(xué)研究。E-mail：40511779@qq.com