汪濤 趙雁平 胡衛(wèi)東 高永喜 劉輝 曾凡波

·實(shí)驗(yàn)研究·

益眠達(dá)片對(duì)失眠大鼠下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

汪濤 趙雁平 胡衛(wèi)東 高永喜 劉輝 曾凡波

目的觀察益眠達(dá)片對(duì)失眠大鼠下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響，探討其治療失眠的作用機(jī)制。方法

將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、益眠達(dá)片組，艾司唑侖組，每組10只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠均用對(duì)氯苯丙氨酸建立大鼠失眠模型。益眠達(dá)片組和艾司唑侖組分別給予益眠達(dá)片和艾司唑侖混懸液灌胃，其余2組給予生理鹽水灌胃。6 d后，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定下丘腦內(nèi)去甲腎上腺素（NE）及5-羥色氨（5-HT）、5-羥吲哚醋酸（5-HTAA）含量。結(jié)果與模型對(duì)照組比較，益眠達(dá)片組可以降低大鼠下丘腦內(nèi)NE含量、升高下丘腦內(nèi)5-HT、5-HTAA含量 （P＜0.01）。結(jié)論益眠達(dá)片改善失眠大鼠唾眠的機(jī)制與其影響大鼠下丘腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量有關(guān)。

益眠達(dá)片；失眠；大鼠；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

益眠達(dá)片為解放軍武漢療養(yǎng)院研制開發(fā)的純中藥制劑，具有益氣生津，安神補(bǔ)腦，鎮(zhèn)靜安眠作用。用于治療失眠、多夢(mèng)、神經(jīng)衰弱等癥。與傳統(tǒng)治療失眠的苯二氮艸卓類藥物相比，益眠達(dá)片的鎮(zhèn)靜催眠的作用機(jī)理可能有所區(qū)別，本研究以PCPA大鼠失眠模型為研究對(duì)象，觀察益眠達(dá)片對(duì)大鼠下丘腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（NE）及5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HTAA）含量的影響，探討其鎮(zhèn)靜催眠作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康W istar雄性大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（鄂）2010-0009。提前1周將大鼠飼養(yǎng)在12 h光照（7：00-19：00時(shí)）、12 h黑暗（19：00-7：00時(shí)）的安靜環(huán)境下，自由攝食飲水，室溫（24±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%。60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為4組各15只，分別為益眠達(dá)片組、空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、艾司唑侖組。

1.2 儀器與試劑 日本島津熒光分光光度計(jì)，RC5C低溫高速離心機(jī) （美國杜邦公司），F(xiàn)A2204B電子分析天平（上海臺(tái)衡電子衡器有限公司）。益眠達(dá)片由合歡皮、首烏藤、五味子等組成，由中國人民解放軍武漢療養(yǎng)院制劑室提供，生產(chǎn)批號(hào)131108，規(guī)格0.3 g／片，用前用蒸餾水配制成濃度為0.24 g／m L的混懸液。艾司唑侖片 （華中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20120805）。對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA，批號(hào)C6506）、5-羥色胺標(biāo)準(zhǔn)品、5-羥吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品、去甲腎上腺素標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國SIGMA公司；0.9%NaCl注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)130416804）；鄰苯二甲醛（OPT）購自北京舒伯偉化工儀器有限公司；其余試劑均為市售分析純。

1.3 失眠大鼠模型制備 除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠參照文獻(xiàn)［1］并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按300 mg／kg體質(zhì)量以10 m L／kg體積腹腔注射PCPA，于每日上午8：00-8：30點(diǎn)進(jìn)行，1次／d，連續(xù)2 d。于第1次腹腔注射28～30 h后，動(dòng)物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天活動(dòng)不停，整體觀察與正常對(duì)照組有明顯不同，表明模型復(fù)制成功［2］。

1.4 給藥方法 各組大鼠于造模第3日開始每日8：00灌胃給藥。益眠達(dá)片組大鼠每天按12.0 g／kg（為成人用量10倍）灌胃；艾司唑侖組大鼠每天按0.3mg／kg（為成人用量10倍）灌胃給予艾司唑侖；空白對(duì)照組、模型對(duì)照組予等量生理鹽水，1次／d，連續(xù)灌胃6 d。

1.5 大鼠下丘腦內(nèi)NE含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［3］方法將大鼠脫頸椎處死，取腦，放在預(yù)先冰冷的生理鹽水中，去除腦膜血管。在冰冷平皿上分離下丘腦，稱重；放在預(yù)先冰冷的玻璃勻漿器中，加5 m L酸性正丁醇，勻漿，1 500 r／m in離心10 m in，吸上層正丁醇2 m L加入含有1.5 m L磷酸0.1 mol／L緩沖液（pH 6.5）的具塞離心管中，振搖10 m in，NE被抽提到緩沖液中。取1.5 m L上述磷酸提取液按文獻(xiàn)方法與氧化碘試劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)液在熒光計(jì)上以385 nm激發(fā)、485 nm、狹縫5處測(cè)定熒光強(qiáng)度。試劑空白和組織空白是將氧化劑和還原劑加入次序顛倒，其他步驟不變。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將各組熒光讀數(shù)轉(zhuǎn)化為濃度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6 大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、5-HIAA含量測(cè)定下丘腦分離同上。參照文獻(xiàn)［4］方法，組織稱重后立即置于含有冷酸性正丁醇（100 mg組織／1 m L正丁醇）勻漿器中，在冰浴條件下勻漿后，離心（3 000 r／min，5 min），吸取5 m L×2上清液，分別加到兩支帶塞離心管中，分離5-HT、5-HTAA。被提取的5-HT、5-HTAA與OPT作用后，在激發(fā)光365 nm、發(fā)射光480 mim、狹縫5條件下測(cè)定樣品的熒火強(qiáng)度。按文獻(xiàn)同時(shí)制備標(biāo)準(zhǔn)管、樣品空白管。按公式計(jì)算5-HT、5-HTAA含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 （±s）表示，多組間比較采用方差分析，并進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組PCPA化失眠大鼠下丘腦內(nèi)NE含量比較 益眠達(dá)片組大鼠下丘腦內(nèi)NE含量明顯低于空白對(duì)照組及模型對(duì)照組 （P＜0.05或P＜0.01），說明益眠達(dá)片可以降低大鼠下丘腦內(nèi)NE含量。見表1。

2.2 各組PCPA化失眠大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、5-HIAA含量比較 模型對(duì)照組大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、5-HTAA含量明顯低于空白對(duì)照組，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；益眠達(dá)片組下丘腦內(nèi)5-HT、5-HTAA含量較模型對(duì)照組有顯著性升高（P＜0.01），與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 PCPA化失眠大鼠下丘腦內(nèi)NE、5-HT、5-HIAA含量比較（±s）

表1 PCPA化失眠大鼠下丘腦內(nèi)NE、5-HT、5-HIAA含量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型對(duì)照組比較，bP＜0.05

15 18.24±3.67 0.89±0.34 0.23±0.12模型對(duì)照組 15 19.56±2.93 0.71±0.29a0.17±0.09a益眠達(dá)片組 15 15.18±2.75ab1.05±0.31b0.24±0.11b艾司唑侖片組15 14.61±3.84ab1.10±0.42b0.25±0.23 -HIAA空白對(duì)照組組別 只數(shù) NE 5-H t 5 b

3 討論

失眠是人體最為常見的睡眠-覺醒節(jié)律紊亂［5］，NE與5-HT是公認(rèn)的參與睡眠-覺醒機(jī)制的經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)［6］，而5-HIAA是腦內(nèi)5-HT的主要代謝途徑。研究表明，腦內(nèi)5-HT有增加睡眠作用［7-9］，而NE在維持覺醒中起著重要作用。NE對(duì)中樞神經(jīng)元既有興奮又有抑制作用，在特定的部位有其特定的作用，常以興奮作用為主。5-HT多呈抑制效應(yīng)，腦干中的5-HT有利于維持慢波睡眠，而慢波睡眠又有利于疲勞的恢復(fù)［10］。本研究采用目前較公認(rèn)的失眠模型PCPA化大鼠，探索益眠達(dá)片對(duì)失眠大鼠下丘腦內(nèi)主要單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，以期明確該方在腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)方面的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，服藥6天后，益眠達(dá)片可降低大鼠下丘腦內(nèi)NE含量，恢復(fù)失眠大鼠下丘腦5-HT和5-HTAA含量。這可能是益眠達(dá)片治療失眠的內(nèi)在機(jī)制之一。

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Influence of Yimianda tablets on the contents of monoamines neurotrans mitters in hypothala-mus of insomniarats

Wang Tao，Zhao Yanping，Hu Weidong，Gao Yongxi，Liu Hui，Zen Fanbo.*People’s Liberation Army Wuhan Sanatorium 430074，China

ObjectiveThe influence of Yimianda tablets on the contents of monoam ines neurotransmitters in Hypothalamus of insomnia rats，to explore themechanism of curative effect of Yim ianda tablets.Methods40W istar ratswere randomized into the blank control group，model group，Yim ianda tablets group，and Estazolam group，each group had 10 rats.The experimentalmodelof insomnia ratswas induced by PCPA.The rats of Yim ianda tablets group give Yimianda Suspension gavaged，The rats of Estazolam group give Estazolam Suspension gavaged.The rats of blank control group and model group give NS gavaged.After 6 days，used fluorescence spectrophotometer determ ined the contents of NE、5-HT、5-HTAA in the hypothalamus of insomnia rats.ResultsCompare with themodel group’s rats，the Yim ianda tablets group’s rats’the contents of NE was reduced and the contents of 5-HT、5-HTAA was increased in the hypothalamus（P＜0.01）.ConclusionThe mechanism of Yimianda tablets’improve insomnia related to influence the contents ofmonoam ines neurotransm itters in hypothalamus of insomnia rats.

Yim ianda tablet；Insomnia；Rat；Monoam ines neurotransm itters

430074廣州軍區(qū)武漢療養(yǎng)院（汪濤、胡衛(wèi)東、高永喜、趙雁平）；430072廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院（劉輝）；430030華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 （曾凡波）