田童童，鞏子路，張 建*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832003）

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）又稱熱滯蛋白，具有防止生物有機體遭受凍害的特殊功能。據(jù)GRAETHER SP等[1]報道抗凍蛋白首次在極地環(huán)境中生活的魚體中發(fā)現(xiàn)，隨后經過科學家的研究，在植物體及微生物體內也發(fā)現(xiàn)不同種類的抗凍蛋白?？箖龅鞍拙哂蟹且罃?shù)性可以降低溶液的凝固點，但是不影響其熔點，二者之間的差值被稱為熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）[2]。

抗凍蛋白的抗凍活性定義為熱滯性，利用熱滯活性系數(shù)可以表示其抗凍活性。熔點越高（低）冰點越低（高），即二者差異越明顯，表示抗凍蛋白的活性越強[3]，所以通過THA可以評價一種抗凍蛋白的抗凍活性，亦可以確定是否存在抗凍蛋白。

抗凍蛋白的熱滯活性的檢測中，顯微鏡觀察法是最早使用也是使用最廣泛的一種方法，微量滲透壓計法和差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）是目前使用比較常見的方法[4]。因為DSC法對冰晶含量可以做到比較準確的控制，此外也可以測定其體系中的含量，所顯示出的結果精確度和重復性比較高，可以客觀的反應其抗凍活性。但是使用這種方法檢測抗凍活性的不足之處是耗時長，所需儀器設備的精度要高。

因此近年來諸多研究者將DSC法作為測定蛋白質功能性質的主要方法。GUERRERO P等[5]對不同pH值條件下壓縮處理大豆蛋白膜的熱血性質和機械性質進行了研究。實驗采用DSC法等技術來探討pH值對理化性質的影響同時也研究了機械性質與pH值和儲存時間的關系[5]。黃曉毅等[6]介紹了DSC在肌肉蛋白質熱穩(wěn)定性、壓力穩(wěn)定性、凝膠特性和持水性研究的應用進展并且對DSC在肉類研究中的應用進行了展望。

在本次實驗中，以胡蘿卜（Daucus carota，Dc）作為研究對象，使用DSC法測定胡蘿卜抗凍蛋白的THA。為了建立一種可行且準確的測定胡蘿卜抗凍蛋白的THA的方法，對樣品濃度、升降溫速率、冰晶含量等有可能影響其THA的主要因素作了考察并且對該測定方法的穩(wěn)定性、重復性和精確度進行詳細的討論分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡蘿卜（Daucus carota）：購買于石河子市友好超市；低分子量標準蛋白Marker：購于北京生物科技有限公司；丙烯酰胺（acrylic amide，Acr），三羥甲基氨基甲烷（Tris hydroxymethyl methyl aminomethane，Tris）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide，Bis）：購置于北京化學試劑公司；β-巰基乙醇、考馬斯亮藍R-250、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）：美國Sigma進口分裝；

1.2 儀器與設備

FA1004型電子天平：上海精科電子天平廠；Mini-protein III：美國Bio-Rad公司；鋁制坩堝、HSG-IIC4恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市儀器制造有限公司；差熱分析儀DSC-7：上海沃特世科技有限公司；PHS-3C精密酸度計、YXJ-2臺式離心機：上海安亭科技儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 DcAFP的純化

參照MEYER K等[7]報道的方法對DcAFP進行純化實驗。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗

聚丙烯酰胺凝膠電泳參照LAEMMLI UK等[8]報道的方法進行實驗。樣品與樣品緩沖液按照體積分數(shù)1∶1的比例混合，沸水浴5min，上樣量10μL，分離膠和濃縮膠的質量分數(shù)分別為12.0%和5%。樣品分別在80V和120V恒壓的條件下在凝膠中遷移，濃縮膠中遷移30min后進入分離膠直到指示劑距離凝膠板邊緣1cm左右處停止電泳，整個電泳實驗大概為5h。從凝膠板取下電泳膠片，將其置于染色缸中于搖床上染色40min，染色結束后于脫色液中脫色24h期間更換染色液4～5次。樣品分子質量的確定根據(jù)標準蛋白Marker的相對遷移率計算獲得。

1.3.3 DSC法測定樣品THA

分離純化的抗凍蛋白樣品溶解于0.01mol/L磷酸緩沖液（phosphatebuffer solution，PBS）緩沖液（KH2PO4-Na2HPO4，0.1%聚乙烯吡咯烷酮（poly vinyl pyrrolidone，PVP），pH 8.0中，將盛有10μg樣品的鋁制坩堝置于樣品池的中央，等待儀器穩(wěn)定后進行檢測。按照降溫（-25℃）、升溫（25℃）、降溫（-25℃）的程序進行測定，同時記錄數(shù)據(jù)ΔAm（體系結晶熱）和Tm（樣品熔點）。

然后按一定的升溫速率升溫使得樣品為固-液混合物，此時的溫度稱為保留溫度，用Th表示，該溫度條件下停留2min，再進行降溫至-25℃，反復上述過程，于相同的保留溫度（Th）條件下停留2min，記錄不同保留溫度下開始結晶的溫度（T0）和結晶熱（ΔAf）。

公式（1）和（2）分別用來計算樣品中的冰晶含量（Ф）和THA。

式中：Φ為樣品中冰晶含量質量分數(shù)，%；ΔAf為保留溫度停留后繼續(xù)降溫過程中體系的放熱焓，即冰晶從液相轉變?yōu)楣滔嗟倪^程中熔融物或溶液結晶時所放出的熱量，J/kg；ΔAm為樣品結晶的總放熱焓，J/kg；THA：物質熔點與冰點之間的差值，用來表示抗凍蛋白的熱滯活性，℃；Th為按一定的升溫速率升溫使得樣品為固-液混合物，此時的溫度稱為保留溫度，℃；T0為樣品溶液開始結晶的溫度，℃。

1.3.4 DSC法測定抗凍蛋白的熱滯活性的穩(wěn)定性、專一性和精密度的評價

穩(wěn)定性的評價：利用同樣的測定方法，在不同時段檢測會得到不同的結果，所得結果之間的相對差異越小表明其檢測方法的穩(wěn)定性越好。本實驗以相同的測定步驟（測定的樣品的蛋白濃度為1.0mg/mL左右，將升降溫速率控制在1℃/min）對同一個樣品進行重復多次的測定，每隔72h測定1次，每次重復3～4次，以xˉ±SD表示結果，比較其結果之間差異。

專一性的評價：將待測樣品平均分為3份，在10℃/min、5.0℃/min、2.5℃/min、1.0℃/min、0.5℃/min、0.1℃/min的條件下連續(xù)測定72h，平均24h檢測1次，每次進行3次重復。

置信區(qū)間（1-α）和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）按照公式（3）、（4）計算。

式中：1-α 為置信區(qū)間，xˉ為平均值，t 為隨機變量，SD 為標準偏差，n 為樣品數(shù)量，RSD 為相對標準偏差。

2 結果與討論

2.1 紅蘿卜抗凍蛋白的分離純化

利用SDS-PAGE測定DcAFP結果見圖1。

從圖1可以明顯看出，分離得到的樣品呈現(xiàn)單一條帶。根據(jù)相對遷移率計算得到其相對分子質量約為36ku，與文獻報導[9-10]的結果完全相符，并達到了電泳純程度，可以用于DSC法測定THA檢測方法的研究。

2.2 升降溫速率對THA的影響

研究了不同升降溫速率對THA的影響，結果分別見圖2、圖3。

從圖2可以明顯看出，升溫速率設定為10℃/min，THA大約為0.5℃，當升溫速率逐漸降低時，THA同時也會出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，升溫速率設定為0.1℃/min，THA沒有被檢出。

圖1 DcAFP的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of DcAFP

這可能是由于在升降溫速率分別為10℃/min、0.1℃/min的條件下使得吸、放熱過程短暫，換熱不夠充分，出現(xiàn)熱現(xiàn)象被放大的結果。從圖2A可知，在-15℃時，體系仍在繼續(xù)吸熱、結晶，同理，溫度大于5℃時，體系放熱熔化的現(xiàn)象仍然存在。據(jù)此可以推斷大約在0.5℃時，THA也會出現(xiàn)被放大的現(xiàn)象。

從圖2D可知，升降溫速率的降低至l℃/min時，體系的吸熱和放熱已經處于正常范圍（-3℃～0.5℃），THA固定在0.1℃左右。升降溫速率為0.1℃/min時，從圖2可以明顯看出，體系的吸熱和放熱過程，然而未能檢出THA，這可能是因為緩慢的升溫和降溫過程導致儀器檢測的靈敏度降低（本實驗所用設備的靈敏度為0.1℃/min），未能檢出THA。

由圖3可知，升降溫速率從0.1℃/min升為2.5℃/min時，THA變化不是很明顯且趨向于穩(wěn)定狀態(tài)，然而升溫速率增大至5℃/min、10℃/min時，THA出現(xiàn)迅速上升的現(xiàn)象，這可能是在此條件下檢測信號被擴大所出現(xiàn)的結果。所以將1℃/min作為一個合適的升降溫速率。LU M等[11-12]對THA的測定得出了同樣的結論。

圖2 不同升溫速度檢測條件下DcAFP的熱流圖Fig.2 Heat flow diagram of DcAFP in different heating rate

2.3 樣品液中抗凍蛋白的含量對THA的影響

樣品液中抗凍蛋白的含量對THA的影響結果見圖4。

由圖4可知，隨著原料質量濃度的升高，THA也逐漸的升高。當質量濃度大于0.5mg/mL時，其THA大約穩(wěn)定在0.1℃。DcAFP的溶解性較好，故其溶解度對其閾值的影響不是很大，然而本身引起的KelVin效應很有可能是影響其閾值的重要因素。通過研究發(fā)現(xiàn)要使得THA趨向于穩(wěn)定，其質量濃度應該大于0.5mg/mL，即當樣品質量濃度≥1mg/mL時，Kelvin效應最大。固本實驗以1mg/mL作為DcAFP的閾值。

2.4 樣品中冰晶含量對THA的影響

樣品中冰晶含量對THA的影響分別見圖5和圖6。

由圖5可知，當升降溫速率從10.0℃/min逐漸降低至1.0℃/min時，樣品的THA也隨之降低。當升降溫速率固定不變時，樣品中的冰晶含量對其THA幾乎沒有影響。因此樣品中冰晶含量的質量分數(shù)在10%～90%時，其THA幾乎不受冰晶含量的影響。然而有些學者持有不同的觀點，即THA會隨著冰晶含量的變化而變化，且給出了THA與冰晶含量的關系，并在天牛（Rhagium inquisitor）血清抗凍蛋白中進行了驗證實驗，實驗結果見圖6[12-13]。研究學者認為該結論說明了抗凍蛋白有阻礙冰晶向細胞外生長的能力，從而可以使生活在低溫惡劣的環(huán)境中生命有機體正常運轉以免受到凍害損傷。ZACHARIASSEN K E等[14]將圖6的曲線進一步分析推導得知，當冰晶含量小到接近0時，得出THA值為-25℃，這恰恰與水分子自由聚合的過冷冰點相吻合。上述現(xiàn)象在側紋南極魚屬（Pleuragramma）中也得到了類似的結果[15]。

圖3 升降溫速率對DcAFP的THA影響（n≥3）Fig.3 Effect of heating and cooling rate on the THA of DcAFP

圖4 DcAFP濃度對DcAFP的THA影響(n≥3)Fig.4 Effect of different DcAFP concentration on the THA of DcAFP

圖5 樣品中冰晶含量對THA的影響。Fig.5 Effect of ice crystal content on THA of DcAFP

圖6 Longhorn beetle血清AFP中冰晶含量對THA的影響Fig.6 Effect of ice crystal in serum AFP on the THA of Longhorn beetle

由圖5、圖6可知，冰晶含量的范圍主要位于10%～90%（質量分數(shù)），但是ZACHARIASSEN K E等[13]測定范圍選取了0.13%～10%（質量分數(shù)），冰晶含量位于10%～90%（質量分數(shù)）范圍內，只是通過曲線的擬合而判斷其趨勢。綜上所述，THA會隨著冰晶含量的變化而發(fā)生改變，當其值低于1%（質量分數(shù)）時，THA表現(xiàn)出冪指數(shù)函數(shù)的增長，而且隨著冰晶含量的增長，THA會慢慢趨向于一個比較穩(wěn)定的值。

2.5 DSC法測定DcAFP的THA穩(wěn)定性

DSC法對測定DcAFP的THA的穩(wěn)定性見圖7。

圖7 不同時間相同樣品的THA測定結果圖Fig.7 THA of the same sample determined at different time

由圖7可知，利用DSC法，隨機抽取時間測定同一份樣品時，樣品的THA在統(tǒng)計分析學上沒有表現(xiàn)出顯著性的差異，故可以作出判斷，DSC法檢測抗凍蛋白的抗凍活性具有一定的穩(wěn)定性。

2.6 DSC法測定DcAFP的THA的重復性

本實驗研究了不同升降溫速率下樣品的THA置信區(qū)間（95%）的測定結果，并且計算了相對標準偏差（RSD），其結果見表1。

表1 不同升降溫速率對樣品THA測定結果置信區(qū)間和相對標準偏差的影響Table 1 Effect of different warming and cooling rate on the confidence interval and relative standard deviation of different samples of THA determination results

由表1可知，在不同升降溫速率條件下，其相對標準偏差（RSD）均小于0.4%，最小值和最大值分別為0.137%、0.369%，這充分說明DSC法在不同的升降溫速率條件下檢測抗凍蛋白的抗凍活性具有一定的重現(xiàn)性。

2.7 DSC法測定DcAFP的THA的精密度

對DSC法測定DcAFP的THA的精密度的研究結果見圖8。

由圖8可知，在相同的方法中，同一個樣品連續(xù)測定的THA沒有顯示出明顯差異性變化，THA為（0.076 06±0.001 08）℃，RSD為1.42%，說明DSC法檢測抗凍蛋白的抗凍活性精密度較高。

圖8 同一個樣品連續(xù)測定的THA變化Fig.8 THA change of same sample measured continuously

3 結論

以DcAFP為研究對象，通過運用差示掃描量熱法確定了測定抗凍蛋白熱滯活性的升降溫速率為1℃/min。闡述了升降溫速率在0.1℃/min時檢測不出其THA的主要原因。即緩慢的升溫和降溫過程導致儀器檢測的靈敏度降低從而導致未能檢出THA。

對影響測定DcAFP的THA的冰晶含量也作了系統(tǒng)性的解釋，當樣品中冰晶含量的質量分數(shù)小于1%時，THA會以冪指函數(shù)的形式上升，進一步地增加樣品中的冰晶含量，THA將會穩(wěn)定在某一個數(shù)值，該結果與張超等[16-17]文獻中報道的實驗結果基本相同。

最后敘述了利用DSC法測定DcAFP的THA的穩(wěn)定性較高；在不同升降溫速率條件下其重復性相對標準偏差（RSD）均在0.4%以下；通過相同方法檢測同一個樣品沒有表現(xiàn)出明顯的差異性，相對標準偏差為1.42%，精密度高。因此差示掃描量熱法可以有效的測定抗凍蛋白的熱滯活性。

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