王常蘇，孫曉彤，余 潔，高 冰*

（1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.武漢鑫宏食品釀造科研所，湖北 武漢 430051）

血栓性疾病可導(dǎo)致心肌梗塞、腦血栓中風(fēng)、急性肺原性心臟病等相關(guān)性疾病[1]，因其發(fā)病率高、復(fù)病率高，而且難以根治，已成為威脅人類健康的主要疾病。因此，近幾年來就如何有效的治愈血栓性疾病，引起了醫(yī)學(xué)界、科技界高度重視。納豆激酶（nattokinase，NK）已被證明具有高效的溶栓作用[2-4]，其不僅可以直接降低纖維蛋白原，而且可以促進(jìn)催化血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶，增加體內(nèi)血栓溶解因子的合成[5-7]。相比臨床上的溶栓藥物（尿激酶（urokinase，UK）、鏈激酶（streptokinase，SK）和組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogenactivator，t-PA），納豆激酶具有高效的溶纖活性、安全性好、生產(chǎn)成本低、無毒副作用、半衰期長(zhǎng)、在胃腸的穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[8-12]。

實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選的納豆激酶生產(chǎn)菌BN-05進(jìn)行了菌落形態(tài)觀察和分子鑒定；并采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)篩選菌株產(chǎn)納豆激酶的固體發(fā)態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，以期提高納豆激酶的含量，為該酶的進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus natto）BN-05，由本實(shí)驗(yàn)室保存。柱式細(xì)菌DNAout（細(xì)菌基因組抽提試劑盒）：北京天恩澤基因科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：酪蛋白培養(yǎng)基，其組成為5g/L酪素，1g/L葡糖糖，1g/L酵母膏，1g/L K2HPO4，0.5g/L KH2PO4，0.1g/L MgSO4，pH7.0～7.2。

斜面培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，其組成為10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，15g/L瓊脂，pH7.0。

液體種子培養(yǎng)基：10g/L葡糖糖，5g/L酵母提取物，10g/L牛肉膏，5g/L，pH7.4～7.6。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆洗凈，與水以1∶5（w/v）的比例混合。

1.1.3 主要試劑

纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)試劑（88mg可凝蛋白/支）、牛凝血酶（560U/支）和尿激酶生物標(biāo)準(zhǔn)品（1 240IU/瓶）均購于中國藥品生物制品檢定所；瓊脂糖購自Biowest公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AvcmJ-E冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司；FTGENE 5D PCR儀：英國Techne公司；Hitachi S-3000N 掃描電子顯微鏡（sanning electron microscope，SEM）：日本電子株式會(huì)社；UV-1800PC 紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；SLY-2112B立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床：金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；LHS-250SC 型智能型恒溫恒濕箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：LB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株BN-05，為更清楚的觀察菌體形態(tài)和表面結(jié)果，對(duì)菌株進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）觀察拍照。

16S rRNA菌株鑒定：用細(xì)菌DNA試劑盒（中國北京天恩澤基因科技有限公司）提取活性高菌株的基因組。PCR擴(kuò)增采用通用引物：16sf95（TGACGAGTGGCGGACGGGTG）和16sr394（CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG）由上海捷瑞生物工程有限公司合成。擴(kuò)增片段送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站利用Blast進(jìn)行比對(duì)，調(diào)出相似序列，用MEGA5.0軟件構(gòu)件系統(tǒng)發(fā)育樹[13-14]。

1.3.2 菌種生長(zhǎng)曲線

將保藏的菌種轉(zhuǎn)接于新鮮的LB平板培養(yǎng)基上，活化24h，接入液體種子培養(yǎng)基（裝液量100mL/250mL）中，37℃、180r/min條件下培養(yǎng)，每隔2h取樣，測(cè)定波長(zhǎng)660nm處的OD值，作出種子的生長(zhǎng)曲線，確定接入發(fā)酵培養(yǎng)基的種齡。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶酶的條件優(yōu)化

固態(tài)發(fā)酵工藝：將精選的大豆進(jìn)行清洗除雜，加入5倍的清水，20～25℃浸泡3～5h，瀝去水分，115℃滅菌30min，待其冷卻至35℃以下，按濕黃豆8%的接種量進(jìn)行接種發(fā)酵培養(yǎng)，37℃靜置發(fā)酵48h，每隔12h攪拌一次。發(fā)酵結(jié)束后，提取粗酶液，用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測(cè)定納豆激酶的活性。

產(chǎn)酶條件優(yōu)化：通過碳源、大豆破碎度、接種量、發(fā)酵溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳的發(fā)酵條件。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 酶活測(cè)定方法

瓊脂糖-纖維蛋白平板的配制：按照Atrup法制備纖維蛋白原平板[15]并進(jìn)行改進(jìn)：首先將1%的瓊脂糖溶于0.05mol/L的Tris-HCl（pH7.8）緩沖溶液中，加熱至完全溶解后，取出10mL置于大試管中，待其冷卻至50℃左右，迅速倒入10mL 1.5mg/L牛血纖維蛋白原溶液，不斷振蕩，使其完全混合均勻，注入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，再迅速加入300μL 20IU/mL的凝血酶溶液，不斷晃動(dòng)平皿使三者混合均勻，防止氣泡的產(chǎn)生，靜置1h后，用直徑為2mm的無菌膠頭吸管在平板上打孔。

粗酶液的提?。簩l(fā)酵好的納豆收集到離心管中（外粘物也一起收集），稱質(zhì)量，向離心管中加入生理鹽水，納豆質(zhì)量（g）∶生理鹽水（mL）=1∶2，4℃浸提4h后過濾，取濾液10000r/min離心15min，取上清液即所需要的粗酶液。

樣品測(cè)定：取粗酶液10μL點(diǎn)樣于瓊脂糖-纖維蛋白平板上，37℃恒溫培養(yǎng)16h，測(cè)量溶解圈的直徑，計(jì)算各溶解圈面積，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶的活力單位。

2 結(jié)果

2.1 BN-05菌種鑒定

2.1.1 形態(tài)特征

菌落特征：經(jīng)LB平板，37℃培養(yǎng)24h后，菌落圓形，邊緣不規(guī)則，白色，稍透明，中間凸起，表面皺褶，濕潤，用牙簽挑菌落有拉絲現(xiàn)象，菌落與培養(yǎng)結(jié)合緊密。

菌體形態(tài)：挑取單菌落革蘭氏染色后鏡檢，鏡下細(xì)胞形態(tài)為桿狀，革蘭氏染色呈陽性，產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生。菌的形態(tài)在SEM掃描電鏡下放大10 000倍的結(jié)果見圖1。

圖1 菌株BN-05的SEM形貌分析Fig.1 SEM analysis of strain BN-05

2.1.2 16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增所得BN-05菌株16S rRNA全長(zhǎng)1513bp，序列已提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫（序列號(hào)為KC703051）。BLAST分析結(jié)果顯示該基因同枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）的16S rRNA基因相似度達(dá)到99%。通過MEGA5.05軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，得到了系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖見圖2。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果表明，該系統(tǒng)樹以Paenibacillus borealis（AJ011322）作為一個(gè)單獨(dú)的外群種，其中BN-05菌株與Bacillus subtillis屬菌株在同一分支，結(jié)合菌株形態(tài)特征，初步鑒定BN-05為枯草芽孢桿菌屬。

2.2 種子生長(zhǎng)曲線

種子是發(fā)酵的基礎(chǔ)，直接影響著固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的含量。將BN-05接入種子培養(yǎng)基，于37℃、180r/min條件下培養(yǎng)，每隔2h取樣，測(cè)波長(zhǎng)660nm處的OD值，確定接入發(fā)酵培養(yǎng)基的種齡，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，0～8h為延滯期，8～16h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，16～28h為穩(wěn)定期，從28h開始進(jìn)入衰亡期。接種菌齡在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌株存活率高且繁殖能力強(qiáng)，因此最佳接種齡為16h。

圖2 MEGA 5.05用鄰近法基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree inferred by neighbor-joining method based on 16S rRNA gene sequence using MEGA version 5.05

圖3 BN-05 種子生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of the BN-05 seed

2.3 尿激酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]

配制不同的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（200IU/mL、400IU/mL、800IU/mL、1000IU/mL、1200IU/mL、1400IU/mL、1600IU/mL、1 800IU/mL、2 000IU/mL和2 400IU/mL）各10μL點(diǎn)樣于新配制的纖維蛋白原平板上，放置10min，37℃培養(yǎng)16h后取出，測(cè)定溶解圈的直徑，計(jì)算各溶解圈面積，得出尿激酶活力的對(duì)數(shù)值（y）與溶解圈面積（x）呈線性關(guān)系，結(jié)果見圖4。

圖4 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of urokinase activity

由圖4可知，尿激酶標(biāo)準(zhǔn)線性方程為y=0.005 1x，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。此標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于測(cè)定納豆激酶的活性，根據(jù)納豆激酶溶解圈的面積，可計(jì)算出納豆激酶的活力單位。

2.4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的條件優(yōu)化

2.4.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以黃豆為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)，在基質(zhì)黃豆滅菌冷卻后稱質(zhì)量，按2%的量分別添加甘油、葡糖糖、木糖、蔗糖、可溶性淀粉，接種納豆枯草芽孢桿菌發(fā)酵，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每隔12h攪拌一次，發(fā)酵完成后檢測(cè)納豆激酶的含量，結(jié)果見圖5。

圖5 不同碳源對(duì)納豆激酶的影響Fig.5 Effect of different carbon source on NK activity

以黃豆為單一的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，其蛋白質(zhì)的含量比較高而碳水化合物的含量并不高，因此在基質(zhì)中補(bǔ)加適量的碳源，可補(bǔ)充基質(zhì)中碳水化合物的不足，提高納豆激酶的活力。由圖5可知，葡糖糖的添加可使納豆激酶的活力達(dá)到最大值為（3 310±110.23）IU/g濕黃豆，因此相對(duì)最佳碳源為葡糖糖。

2.4.2 大豆的破碎度對(duì)產(chǎn)酶的影響

為研究大豆破碎度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，在其破碎度為0、2、4、6、8時(shí)，其他條件都相同的情況下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵完成后測(cè)定樣品中納豆激酶的活性，結(jié)果見圖6。

圖6 大豆破碎度對(duì)納豆激酶的影響Fig.6 Effect of fragmentation of fermented soybean on NK activity

圖6表明，納豆激酶的活性隨著原料的破碎度不同而變化，當(dāng)大豆的破碎度為4時(shí)，納豆激酶活性達(dá)到最大值，為（4 180±112.05）IU/g濕黃豆。

2.4.3 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

接種量的多少直接影響發(fā)酵過程菌株產(chǎn)酶的活力，研究其對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，在其他發(fā)酵條件不改變的情況下，分別按2%、4%、6%、8%、10%的接種量進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定納豆激酶的活力，結(jié)果見圖7。

圖7 接種量對(duì)納豆激酶的影響Fig.7 Effect of different inoculum size on NK activity

由圖7可以看出，接種量達(dá)到6%時(shí)，納豆激酶的含量較高，達(dá)到（3 560±105.43）IU/g濕黃豆。當(dāng)接種量為2%～6%時(shí)，NK的活力呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，當(dāng)增加為8%～10%時(shí)，NK的活力反而有所下降，這可能是接種量高容易造成前期消耗基質(zhì)過多和基質(zhì)缺氧，故選擇接種量為6%。

2.4.4 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

選取發(fā)酵溫度分別為29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、40℃，在其他發(fā)酵條件不改變的情況下，考察溫度對(duì)納豆枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 溫度對(duì)納豆激酶的影響Fig.8 Effect of different culture temperature on NK activity

溫度太低不利于菌株的生長(zhǎng)，過高又不利于產(chǎn)酶，且酶在過高的溫度下極易失活。由圖8可以看出，培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)，NK的活力相對(duì)較高，活力為（3 864±95.21）IU/g濕黃豆。因此菌株的適宜培養(yǎng)溫度為35℃。

2.4.5 發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

根據(jù)碳源、大豆破碎度、接種量和培養(yǎng)溫度這4個(gè)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳的發(fā)酵條件，因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析表分別見表2和表3。

表1 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶正交試驗(yàn)L9(34)因素水平Table 1 Factors and level of L9(34) solid fermentation producing NK orthogonal experiment

表2 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of solid fermentation producing NK orthogonal experiment

表3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of solid fermentation producing NK orthogonal experiment

從正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析表可以看出，4個(gè)影響因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶活力的影響因素主次為C＞D＞B＞A，其中C因素和D因素影響比較顯著，以黃豆為基質(zhì)發(fā)酵納豆產(chǎn)納豆激酶的最佳發(fā)酵條件為C1D3B1A3，即大豆破碎度為2，發(fā)酵溫度為36℃，接種量為5.5%，葡萄糖為2.5%。在最佳的發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，3次試驗(yàn)得納豆激酶活力的平均值為（4 715.26±103.23）IU/g濕黃豆，與之前相比（發(fā)酵條件優(yōu)化前BN-05納豆激酶的活力為（1 991±93.87）IU/g濕黃豆），酶活性提高了137%。

3 討論

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的納豆枯草芽孢桿菌BN-05進(jìn)行了形態(tài)特征和分子生物鑒定，確定為枯草芽孢桿菌屬。對(duì)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的條件進(jìn)行了探討和研究。單因素和正交試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)納豆激酶的最佳發(fā)酵條件：大豆破碎度為2，發(fā)酵溫度為36℃，接種量為5.5%，葡萄糖為2.5%。經(jīng)過多次試驗(yàn)驗(yàn)證，采用此優(yōu)化條件，BN-05的納豆激酶的活力為（4 715.26±103.23）IU/g濕黃豆，比之前提高了137%。本研究對(duì)納豆激酶的成品開發(fā)應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

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