何保江，屈 展*，曾世通，霍現(xiàn)寬，張文娟

（中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南 鄭州 450001）

自然界植物合成和釋放的低分子質(zhì)量次生代謝物超過10萬種，其中揮發(fā)性物質(zhì)占很大比例[1]。植物揮發(fā)性成分大多有獨特香味，具有殺菌、刺激、放松等效應(yīng)，能使人適度興奮、減緩疲勞及產(chǎn)生松弛感等，而且細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生的損傷可以導(dǎo)致癌癥、心血管疾病和免疫系統(tǒng)衰退等多種退變性疾病，攝入外源性的抗氧化劑能有效地預(yù)防或抑制這些疾病的發(fā)生。提取植物揮發(fā)性成分不僅對香料、食品工業(yè)、日用化妝品工業(yè)和煙草工業(yè)的生產(chǎn)具有實用價值，而且對人類保健也有十分重要的意義[1]。另外，植物來源的天然抗氧化劑也受到越來越多的關(guān)注[2-3]。近年來，揮發(fā)性成分的抗氧化活性研究成為熱點，如對迭迷香精油[4]、鼠尾草精油[5]、香菜精油[6]、仙人掌精油[7]、辛夷揮發(fā)油[8]等的研究。

款冬花為菊科植物款冬（Tussilago farfaraL.）的干燥花蕾，具潤肺止咳、化痰平喘之功效[8-9]。決明子為豆科植物決明（Cassia obtusifoliaL.）或小決明（Cassia toraL.）的干燥成熟種子，異名為馬蹄子，為臨床常用中藥。其性味甘、苦、咸，微寒。現(xiàn)代藥理研究表明，決明子具有降血壓[10]、降血脂[11]、保肝、通便、明目等作用[12]。目前國內(nèi)對款冬花和決明子中揮發(fā)性成分的研究主要集中在揮發(fā)性成分的提取工藝及其成分分析等方面[13-14]，暫無對其中揮發(fā)性成分抗氧化活性的相關(guān)研究報道。本實驗運用水蒸氣蒸餾法提取2種中藥的揮發(fā)性成分，通過可見分光光度法對其1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）自由基、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）自由基清除能力及鐵離子還原能力實驗（ferric reducing ability of plasma，F(xiàn)RAP）值進(jìn)行測定，并對影響其抗氧化活性的主要物質(zhì)進(jìn)行分析，從而探討2種中藥中揮發(fā)性成分的抗氧化性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗原料

款冬花和決明子均購于當(dāng)?shù)刂兴幍辍?/p>

1.1.2 主要試劑

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TPTZ）、ABTS標(biāo)準(zhǔn)品購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。福林-肖卡試劑購于北京博奧星生物科技公司。無水乙醚、無水乙醇、95%vol乙醇、無水硫酸鈉、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、甲醇、鹽酸均為分析純。

1.2 實驗儀器

1.3 實驗方法

1.3.1 揮發(fā)性成分的提取

將干燥的款冬花和決明子粉碎，稱取200g粉末，蒸餾水浸泡1.5h，進(jìn)行水蒸氣蒸餾6h，重蒸乙醚萃取，萃取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥過夜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醚得黃色油狀物，置于進(jìn)樣瓶中低溫保存。

1.3.2 揮發(fā)性成分檢測

GC-MS條件：MSDB-5（30m×0.25mm×0.25μm）毛細(xì)管氣相色譜柱。程序升溫：40℃（2min），3℃/min升至205℃（1min），再以20℃/min升至300℃（5min），恒流模式：He氣，柱流速：1mL/min。MS條件：進(jìn)樣口290℃，離子源230℃，四級桿150℃，電子電離（electron ionization，EI）源。

揮發(fā)性成分檢測：在最優(yōu)條件下按照分流比（款冬花和決明子為5∶1）測定其揮發(fā)性成分。

1.3.3 揮發(fā)性成分中總多酚和總黃酮含量的測定

為了進(jìn)一步探討中草藥中揮發(fā)性成分抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，對揮發(fā)性成分中總黃酮和總多酚的含量進(jìn)行了測定，方法如下：

明確劃分各級護(hù)理人員的職責(zé)以及工作標(biāo)準(zhǔn),并將具體的職責(zé)層層分解具體到個人,術(shù)前完善器械以及儀器相關(guān)檢查,術(shù)前1d集中訪視患者,并于術(shù)日護(hù)理人員在手術(shù)室門口做好迎接、交接工作,根據(jù)手術(shù)內(nèi)容護(hù)理做好相應(yīng)的配合,術(shù)后常規(guī)管理,手術(shù)全程中需進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

（1）總多酚含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用移液管分別吸取0.0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、5.0mL、10.0mL的0.5%沒食子酸溶液，用水定容至100mL配制不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。從上述溶液中分別吸取1.0mL，加入水60mL、福林-肖卡顯色劑5.0mL，混勻，然后在0.5～8.0min內(nèi)各加入20%碳酸鈉溶液15.0mL，定容至100mL搖勻。于20℃水浴保溫2h后，在波長765nm處測定吸光度值。計算得到回歸方程：y=0.000 9x-0.012 1（線性范圍：0～500mg/L），相關(guān)系數(shù)R2=0.9981。

樣品測定：吸取1.0mL稀釋20倍的樣品溶液，按前面介紹的方法測定吸光度值，計算總多酚含量。平行3次實驗。

（2）總黃酮含量的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取105℃干燥的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.021g，用30%體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液定容至100mL，備用。取7支具塞試管，分別加入0.0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，用30%體積分?jǐn)?shù)乙醇補(bǔ)足至5mL，混勻，各加入0.3mL 5%NaNO2溶液，混勻靜置5min，加0.3mL 10%Al（NO3）3溶液，混勻后靜置6min，加入4mL 4%NaOH溶液，再加入0.4mL 30%體積分?jǐn)?shù)乙醇使總體積為10mL，混勻靜置10min，在波長510nm處測定吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.0758x-0.0783（線性范圍：0～0.063mg/mL），相關(guān)系數(shù)R2=0.999。

樣品測定：分別吸取2種中藥中的揮發(fā)性成分1.0mL按上述操作測定吸光度值，計算總黃酮含量，平行3次測定。

1.3.4 揮發(fā)性成分抗氧化能力的測定

（1）FRAP值測定

FRAP還原劑溶液的配制：稱取0.3213g TPTZ，用40mmol/L 鹽酸定容至50mL，則TPTZ 溶液的濃度為20mmol/L。向50mLTPTZ溶液中加入50mL濃度為20mmol/L的FeCl3·6H2O，再加入500mL濃度為0.3mol/L的醋酸鹽緩沖溶液（pH3.6），混勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取0.145 6g FeSO4·7H2O，用甲醇定容至100mL，配制成濃度為2 000μmol/L的母液。用上述母液配制濃度為100～2 000μmol/L濃度的已知Fe（Ⅱ），即FeSO4·7H2O的甲醇液體（0、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1 000μmol/L、1 200μmol/L、1 400μmol/L、1 600μmol/L、1 800μmol/L、2 000μmol/L）。各吸取0.3mL上述系列濃度液體，向其中加入9.0mL FRAP還原劑溶液和0.9mL蒸餾水在37℃條件下反應(yīng)30min，在波長593nm處測定各吸光度值，以液體濃度為橫坐標(biāo)（x），以吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得方程式：y=0.002 2x-0.057 6（R2=0.999 5）

樣品的測定：取提取液0.3mL，按上述步驟進(jìn)行操作，每一試樣重復(fù)測定3次，從上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的抗氧化濃度，樣品的抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP單位相當(dāng)于1μmol/L FeSO4，即樣品的抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的μmol/L數(shù)。

（2）ABTS 自由基抑制劑活性測定法

ABTS+試劑的配制：將14mmol/L 的ABTS原液與4.9mmol/L過硫酸鉀溶液按1∶1的體積比混合過夜，使用前用乙醇將混合液稀釋至吸光度值A(chǔ)734nm為0.700±0.020。

樣品的測定：向5.8mL的ABTS+試劑中加入0.2mL經(jīng)20倍稀釋的樣品提取液，待充分混勻在30℃條件下避光反應(yīng)5min，在波長734nm處測定吸光度值（Asample）；同時，5.8mL的ABTS+試劑與0.2mL乙醇在30℃條件下避光反應(yīng)，在波長734nm處測定吸光度值（Acontrol）。抗氧化能力用ABTS清除率表示，計算公式：

（3）DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.0780g DPPH，用95%vol乙醇定容于100mL棕色容量瓶中，獲得濃度為0.2mmol/L的溶液[15-16]。

樣品的測定取不同濃度的揮發(fā)性成分（0.02g/mL、0.04g/mL、0.05g/mL、0.1g/mL）各2mL，分別添加0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液各2mL，混合物用力振蕩并室溫避光反應(yīng)30min，在波長517nm處測吸光度值（Ai），同時測定DPPH乙醇溶液2mL+乙醇2mL的吸光度值（Ao）和溶液2mL+乙醇2mL的吸光度值（Aj）。所有測定平行進(jìn)行3次。計算公式[17]：

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性成分的成分分析

采用水蒸氣蒸餾法提取2種中藥中的揮發(fā)性成分，并且利用GC-MS分析揮發(fā)性成分的組成。款冬花中揮發(fā)油化學(xué)組分見圖1、表1。經(jīng)GC-MS測定，共檢出57種化合物，主要包括1，2，4A，5，6，8A-六氫-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）--酮（15.65%），1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）3環(huán)「2，2，1，0（2，6）」庚烷（13.46%），2，4，5，6，7，8-六氫-3，5，5，9-三甲基-1H-酮（8.42%）和1-乙氧基丙烷（8.02%）。

圖1 款冬花揮發(fā)性成分的GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS chromatograms of Tussilago farara volatile component

表1 款冬花揮發(fā)性成分分析Table 1 The volatile components of Tussilago farara

決明子中揮發(fā)油化學(xué)組分結(jié)果見圖2、表2。經(jīng)過GC-MS測定，共檢出28種化合物，其中主要包括2，4A，5，6，8A-六氫-4，7-二甲基-1-（1-甲基乙基）-萘（13.51%），1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三環(huán)「2，2，1，0（2，6）」庚烷（11.88%）和2，4，5，6，7，8-六氫-3，5，5，9-甲基-1H-酮（8.28%）。呂華軍等[14]采用超臨界二氧化碳萃取決明子中揮發(fā)油，共得到51種化合物。可能由于采用的萃取手段不同。

圖2 決明子揮發(fā)性成分的GC-MS圖譜Fig.2 GC-MS chromatograms of Cassia obtusigolia L.volatile component

2.2 揮發(fā)性成分的抗氧化實驗結(jié)果

2種中藥的FRAP值見表3。由表3可知，款冬花揮發(fā)性成分的FRAP值較大，其抗氧化能力較大；決明子揮發(fā)性成分的FRAP值較小，也具有一定程度的抗氧化性。

表3 兩種中藥揮發(fā)性成分的抗氧化性Table 3 The ABTS,DPPH,TPC,TFC and FRAP values of two Chinese medicine

2種中草藥揮發(fā)性成分對ABTS+自由基也有一定的清除能力，款冬花揮發(fā)性成分的清除率較大，抗氧化性較強(qiáng)，決明子的ABTS清除率相對較小，抗氧化能力較弱。

由表3可知，2種中草藥揮發(fā)性成分對DPPH自由基有一定的清除能力，決明子對DPPH自由基清除率較小，而款冬花對DPPH自由基清除率較大。不同中草藥揮發(fā)性成分對DPPH自由基清除能力相比，款冬花的抗氧化性較強(qiáng)，決明子的抗氧化能力較小。

2.3 揮發(fā)性成分總酚和總黃酮測定結(jié)果

從表3可知，決明子總酚含量為（70.1±6.2）μg/mg，總黃酮含量為（27.71±1.96）μg/mg；款冬花總酚含量為（83.4±9.89）μg/mg，總黃酮含量為（48.54±1.75）μg/mg。從這些可以說明，2種中草藥揮發(fā)性成分的抗氧化性可能來自含量較高的總酚和總黃酮，江慎華等[18]對丁香的抗氧化活性進(jìn)行研究時，也發(fā)現(xiàn)其主要的抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)由總多酚和總黃酮所貢獻(xiàn)。由此可見，2種中草藥中揮發(fā)性成分的抗氧化活性可能主要來自總多酚和總黃酮的假設(shè)得到了進(jìn)一步的驗證。

3 結(jié)論

本實驗通過水蒸氣蒸餾法分別提取了2種中草藥中的揮發(fā)性成分，并分析了揮發(fā)性成分的主要成分，同時分別通過測定揮發(fā)性成分對DPPH自由基清除能力、FRAP值、ABTS+自由基抑制活性，說明款冬花和決明子揮發(fā)性成分具有不同程度抗氧化能力，而且通過測定揮發(fā)性成分總多酚和總黃酮含量，說明揮發(fā)性成分抗氧化活性可能主要來自總多酚和總黃酮。

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