林 汲，趙紅年*

（山西梁汾醋業(yè)有限公司，山西 太原 030032）

傳統(tǒng)山西老陳醋大曲原料為大麥和豌豆，制曲過程中微生物主要來源于原料和制曲環(huán)境，包括霉菌、酵母菌、醋酸菌、芽孢菌等，傳統(tǒng)制曲法主要依靠環(huán)境中的微生物自然選擇形成特定的群落，進而代謝產(chǎn)生酶系[1]。由大麥和豌豆所構成的大曲其營養(yǎng)成分不能滿足更多種類微生物的棲息、生長，且傳統(tǒng)方法所富集的微生物不具有定向選擇性，對原料的利用率不高，亦對食醋品質的穩(wěn)定性有一定的影響[2]。

本研究在傳統(tǒng)制曲原料的基礎上，加入一定比例的麩皮、蕎麥和綠豆，并分離出制曲過程中的優(yōu)勢菌種，經(jīng)誘變、擴培、接種至復合曲的制備過程中，經(jīng)多種微生物菌群的協(xié)同發(fā)酵，提高了復合曲中的特定酶活，為釀造高品質多香型食醋奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥、豌豆、蕎麥、綠豆（要求顆粒飽滿，無病變，無霉變）均購于山西三盟實業(yè)發(fā)展有限公司；麩皮（購于古船面粉（晉中）有限公司）；飲用純凈水：自制。

葡 萄 糖、NaNO3、K2HPO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4、瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、乙酸鈉、葡萄糖、硫酸鎂、硫酸錳均購自國藥集團化學試劑公司。

霉菌分離培養(yǎng)基—馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar medium，PDA）培養(yǎng)基[3]：馬鈴薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，瓊脂20.0g/L，自然pH值，121℃滅菌20min。

酵母菌分離培養(yǎng)基酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基[4]：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，瓊脂20.0g/L，115℃滅菌30min。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外分光光度計：日本島津公司；pHS-3C型精密酸度計：上海精密儀器有限公司；SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LHS-250SC恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；GZC-9140MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司；CX21顯微鏡：日本奧林巴斯公司；TE124S分析天平：德國賽多利斯；HZQ-A氣浴恒溫振蕩器：常州中誠儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

將曲塊研細成粉，稱取25.0g于225mL無菌生理鹽水中，用玻璃珠打散，浸泡30min。取1.0mL上清液加入9.0mL無菌生理鹽水中，配制成10-2菌懸液。依次類推，配制成10-3～10-7的菌懸液。分別吸取0.2mL稀釋度為10-3～10-7的菌懸液，均勻涂布于已冷卻至室溫的平板培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行樣。將接種好的平板置于36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d[5]。

1.3.2 菌種誘變

參照劉慶玉等[6]試驗方法，菌懸液先用30W紫外線照射60s，然后再用濃度為0.2mol/L的亞硝酸處理20min，誘變菌株經(jīng)培養(yǎng)后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號并接入試管斜面保藏，同時取對應的菌株活化后接種至250mL搖瓶中，30℃、180r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)48h，對發(fā)酵液進行分析并選取優(yōu)勢菌株。

1.3.3 菌種拮抗試驗

將各菌株做拮抗試驗，2種不同的菌在平板上劃線但不相交，觀察是否有拮抗，抑制孢子的生成等現(xiàn)象[7-9]。

1.3.4 種曲制備

5種原料混合、篩選、粉碎，然后加水，加水量為原料總重量的0.5～0.6倍。將不同高產(chǎn)菌種各取2～3環(huán)，接入裝有種曲原料的三角瓶中進行培養(yǎng)（pH6.0～7.0，溫度32～34℃，時間46～48h），之后繼續(xù)擴培，制得種曲。

1.3.5 多菌種復合曲制備工藝流程

（1）配料

根據(jù)本研究中主要微生物的產(chǎn)酶能力，大麥、豌豆、麩皮、蕎麥、綠豆按照特定比例進行組配，水的質量為上述原料總質量的0.5～0.6倍。

（2）接種

拌勻后的曲料接種預先培養(yǎng)好的種曲，充分翻拌。

（3）堆積

曲料堆積高度50cm，溫度33～34℃，時間24～36h，以使孢子吸水膨脹、發(fā)芽。

（4）發(fā)酵控制

根據(jù)復合曲的品溫來進行通風，以保持其品溫在32～34℃范圍內，并根據(jù)菌種生長的時期和特性對復合曲的水分進行補償或減少。

（5）復合曲成曲

菌絲生長衰退，呼吸已不旺盛，降低濕度，提高品溫至37～39℃，以排除水分，出房水分應控制在25%以下。

1.3.6 多菌種復合曲制備工藝優(yōu)化

通過制曲溫度、種曲接種量、復合曲相對濕度和制曲時間4個因素來研究，以酯化力為試驗指標，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗進行優(yōu)化。

1.3.7 質量鑒定方法

糖化力、液化力的測定方法依照文獻[10]方法進行；酯化力根據(jù)文獻[11]方法進行測定；蛋白酶活根據(jù)文獻[12]方法進行測定。

糖化酶活力（簡稱糖化力）定義：1.0g固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物在35℃、pH值為4.6的條件下，1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1.0mg葡萄糖，即為1個酶活力單位，U/g[13]。

液化酶活力（簡稱液化力）定義：1.0g固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物在60℃、pH值為6.0條件下，1h液化1.0g可溶性淀粉，定義為1個酶活力單位，U/g[13]。

酯化力（以乙酸乙酯計）定義：1.0g干曲在30～32℃反應100h所產(chǎn)生的乙酸乙酯毫克數(shù)，以mg/（g·100h）表示[14]。

蛋白酶活力定義：1.0g干曲在40℃、pH7.5的條件下，水解反應l.0min產(chǎn)生l.0μg 酪氨酸為1個酶活力單位，以U/g表示[14]。

2 結果與分析

2.1 制曲原料配比

山西老陳醋大曲的原料為大麥和豌豆，兩者的比例約為6∶4[15]，大麥含有較多的皮殼，纖維素含量高，淀粉含量約58%～65%[16]；豌豆蛋白質含量約21%～28%，淀粉含量低，黏稠性大，易黏結成塊[17]；麩皮碳水化合物含量約為61%，蛋白質含量16%[18]；蕎麥中氨基酸含量較為豐富，碳水化合物含量為73%[19]；綠豆中蛋白質含量約為干質量的22%，其微量元素亦較為豐富[20]，而且在制曲原料中添加綠豆，能夠賦予復合曲特殊的香氣。

根據(jù)山西老陳醋大曲、鎮(zhèn)江香醋小曲以及醬油曲中碳水化合物和蛋白質含量的比例，結合本研究多菌種生長代謝的基本要求，確定了復合曲原料最適配比為大麥30%、豌豆15%、麩皮10%、蕎麥20%、綠豆25%。

2.2 菌種選擇

經(jīng)分離、誘變，選擇高產(chǎn)酶菌種，見表1。

表1 菌種選擇Table 1 Selection of strains

2.3 菌種間拮抗

菌種間拮抗作用見表2。

表2 不同菌種拮抗作用Table 2 Antagonistic effect of different strains

表2結果表明，所選擇的菌種之間不具有拮抗關系，因此可以將其接入制曲原料中。

2.4 單因素試驗

2.4.1 制曲溫度

固定多菌種復合曲相對濕度65%，種曲接種量3.5%，在不同溫度條件下培養(yǎng)72h，測定其酯化力。

圖1 溫度對多菌種復合曲酯化力的影響Fig.1 Effect of temperatures on multi-strains complex koji esterifying power

由圖1可知，制曲溫度對多菌種復合曲的酯化力影響較大。28℃時，酯化力僅為0.58 mg/（g·100h）；隨著溫度的上升，酯化力提高。34℃時，酯化力達到最高1.09mg/（g·100h）；34～40℃，其酯化力有所降低。分析原因為曲醅中微生物在高于最適生長溫度條件下，其生長代謝受到抑制，大部分菌種隨著溫度的增高而死亡，其代謝產(chǎn)生的酶系總量也有所降低。上述結果表明，制曲溫度不能波動太大，34℃制曲溫度較為適宜。

2.4.2 種曲接種量

固定多菌種復合曲相對濕度65%，溫度34℃，培養(yǎng)時間72h，不同比例接種后分別培養(yǎng)，測定酯化力。

圖2 種曲接種量對多菌種復合曲酯化力的影響Fig.2 Effect of inoculum size on multi-strains complex koji esterifying power

由圖2可知，種曲接種量與多菌種復合曲的酯化力呈正相關。隨著接種量的增加，多菌種復合曲的酯化力有所提高；2.5%～4.0%接種區(qū)間，酯化力隨接種量的增加而增加，4.0%～5.0%接種區(qū)間，酯化力趨于穩(wěn)定。因此，4.0%的接種量較為適宜。

2.4.3 多菌種復合曲相對濕度

種曲接種量4.0%，多菌種復合曲相對濕度為50%、55%、60%、65%、70%、75%，34℃分別培養(yǎng)72h，測定其酯化力。

圖3 多菌種復合曲相對濕度對酯化力的影響Fig.3 Effect of multi-strains complex koji relative humidity on esterifying power

由圖3可知，多菌種復合曲的相對濕度對微生物的生長代謝也十分重要。接種后孢子發(fā)芽需吸水膨脹，隨著相對濕度的增加（50%～65%），其酯化力有所提高，但當相對濕度過高（大于65%）酯化力有所降低。分析其原因為多菌種復合曲相對濕度過高，嚴重破壞微生物胞內外滲透平衡，抑制了微生物的生長代謝，影響其產(chǎn)酶能力。因此，相對濕度65%較為適宜。

2.4.4 制曲時間

固定多菌種復合曲相對濕度65%，種曲接種量4.0%，在34℃條件下分別培養(yǎng)24h、36h、48h、60h、72h、84h、106h，測定其酯化力。

圖4 制曲時間對多菌種復合曲酯化力的影響Fig.4 Effect of preparation time on multi-strains complex koji esterifying power

由圖4可知，24～72h時，酯化力隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸提高；72～106h時多菌種復合曲酯化力趨于恒定，說明在該時間段微生物群落結構及其生物總量趨于穩(wěn)定，對原料的利用和代謝產(chǎn)生的酶系也趨于恒定。因此，制曲時間72h較為適宜。

2.4.5 多菌種復合曲制備條件優(yōu)化

表3 多菌種復合曲制備條件優(yōu)化正交試驗因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment for optimization of multi-strain complex preparation conditions

表4 多菌種復合曲制備條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiment for optimization of multi-strain complex preparation condition

表5 多種復合曲制備條件優(yōu)化正交試驗結果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment for optimization of multi-strain complex preparation condition

由表4可知，對酯化力值影響的因素主次順序為制曲時間＞種曲接種量＞相對濕度＞溫度，最佳制備條件為A2B3C2D2，即制曲溫度34℃，種曲接種量4.5%，相對濕度65%，制曲時間72h。按上述優(yōu)化條件制備多菌種復合曲，測得其酯化力平均值為1.14mg/（g·100h），高于正交試驗中各試驗組，為最佳制曲方案。由表5可知，影響多菌種復合曲酯化力的4個因素為D＞B＞C＞A，4個因素對結果均無顯著影響。

2.4.6 多菌種復合曲鑒定

表6 多菌種復合曲與大曲的理化性能比較Table 6 Comparison of physicochemical properties of multi-strain complex koji and Daqu

由表6可知，多菌種復合曲糖化力、液化力、酯化力及蛋白酶活均比大曲高。其中，糖化力提高14.63%，液化力提高15.09%，酯化力高23.91%，蛋白酶活性提高17.50%。說明多菌種的接入對復合曲糖化力、液化力、酯化力以及蛋白酶活力的提高起到直接的作用。

酯化力的提高將增加其發(fā)酵終產(chǎn)物食醋的香氣，蛋白酶活力提高將增加產(chǎn)品中氨基酸的含量，甘薯曲霉和黑曲霉分別具有高產(chǎn)纖維素酶和糖化酶的活性，能夠最大程度地將原料中的纖維素、淀粉分解為葡萄糖，為多群系多種類微生物的生長代謝提供了充足的能源。

3 結論

本研究將分離篩選到的發(fā)酵主體功能菌種進行了特定的高產(chǎn)酶誘變，并將其接種至復合曲的制備中，并根據(jù)特定微生物的代謝功能特點，在大曲制備原料的基礎上，加入麩皮、蕎麥和綠豆，進一步豐富了原料的營養(yǎng)成分，增加了多菌種復合曲的酶系。所得多菌種復合曲糖化力、液化力、酯化力以及蛋白酶活均有所提高，該研究為釀造高品質多香型食醋奠定了基礎。

[1]侯紅萍，郝 林.發(fā)酵食品工藝學[M].太原：山西高校聯(lián)合出版社，1994.

[2]武晉海，郝 林，白瑞華.山西老陳醋大曲微生物生態(tài)分布[J].山西農業(yè)大學學報，2004（3）：280-282.

[3]許青蓮，邢亞閣，車振明，等.川西高原冰酒發(fā)酵中Pichia anomala的鑒定與耐受性研究[J].中國釀造，2013，32（8）：39-42.

[4]張 磊，施 思，張文學，等.濃香型白酒大曲中酵母菌的分離和鑒定[J].釀酒科技，2010（5）：39-41.

[5]郝 林.食品微生物學實驗技術[M].北京：中國農業(yè)出版社，2001.

[6]劉慶玉，姚 影，張 敏，等.紫外誘變篩選高效木質素降解菌株的研究[J].可再生能源，2010，8（28）：58-59.

[7]周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1986.

[8]周慶紅，楊寅桂，范淑英，等.金針菇航天種菌絲誘變效應的研究[J].2010，29（5）：37-39.

[9]張 敏，劉慶玉，來世鵬，等.混合菌種對玉米秸稈降解作用的效果研究[J].沈陽農業(yè)大學學報，2011-12，42（6）：746-748.

[10]沈怡芳.白酒生產(chǎn)技術全書[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1998.

[11]沈才洪，應 鴻，許德富，等.大曲質量標準的研究第二報：大曲酯化力的探討[J].釀酒科技，2005（3）：17-20.

[12]倪海晴.提高醬油大曲酶活和改善醬油發(fā)酵效果的研究[D].無錫：江南大學碩士論文，2010.

[13]王福榮.釀酒分析與檢測[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005.

[14]李大和.濃香型大曲酒生產(chǎn)技術[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1997.

[15]黃仲華，殷小平.食醋生產(chǎn)問答[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

[16]陳海華，董海洲.大麥的營養(yǎng)價值及在食品業(yè)中的利用[J].西部糧油科技，2002（2）：34-36.

[17]張樹成，李玉林.制取豌豆分離蛋白及淀粉的工藝研究[J].農產(chǎn)品加工·學刊，2012（7）：77-80.

[18]林 琳.小麥麩皮的營養(yǎng)成分及其開發(fā)利用[J].農業(yè)科技與裝備，2010（3）：41-42

[19]朱錫義.蕎麥的營養(yǎng)價值與綜合利用[J].云南農業(yè)科技，1986（1）：40-41.

[20]王明海，徐 寧，包淑英，等.綠豆的營養(yǎng)成分及營養(yǎng)價值[J].現(xiàn)代農業(yè)科技，2012（6）：341-342.