曾小波，劉 瀅，朱新貴，李 理*

（1.李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東 江門 529156；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

醬油釀造過程中，菌種的作用至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)醬油生產(chǎn)廠家所用的菌種為滬釀3.042及從該菌種誘變篩選而來的菌種。滬釀3.042具有生長(zhǎng)快、蛋白酶活力較高、產(chǎn)孢子量大、抗雜菌等優(yōu)點(diǎn)，但其蛋白酶活力仍然不夠高，且以中性和堿性蛋白酶為主，酸性蛋白性較弱，導(dǎo)致蛋白質(zhì)利用率保持在75%左右的水平。而日式醬油，由于其菌種技術(shù)的發(fā)展，其蛋白質(zhì)利用率已達(dá)到92%的水平[1]。因此菌種的選育和研究對(duì)醬油生產(chǎn)企業(yè)有極其重要的作用。

本企業(yè)在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐過程中，從最初的米曲霉3.042中不斷地誘變篩選，獲得了兩個(gè)各具優(yōu)點(diǎn)、性狀不同的菌株。為了對(duì)這兩株菌種有系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，從而為生產(chǎn)控制提供數(shù)據(jù)支持，并為進(jìn)一步篩選優(yōu)良菌種提供理論依據(jù)，研究比較了2株米曲霉的基本性狀，同時(shí)分析了成曲粗酶液中蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)，研究結(jié)果可用于企業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

米曲霉1號(hào)、米曲霉2號(hào)：生產(chǎn)用種，從滬釀3.042米曲霉中篩選獲得。

種曲、成曲：李錦記（新會(huì)）食品有限公司車間提供。

察氏培養(yǎng)基：購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

雙層酪蛋白培養(yǎng)基：底層：瓊脂粉15g，加蒸餾水1 000mL，煮沸溶解后于121℃滅菌20min，每個(gè)平皿加約8mL；上層：Na2HPO4·12H2O 1.07g，KH2PO40.36g，BaCl25.0g，酪蛋白4.0g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL。配制時(shí)，酪蛋白先用20mL溶解，再與900mL水及除BaCl2外的其他藥品混合。BaCl2則用100mL水單獨(dú)溶解，各自在121℃滅菌20min，使用前混合。上層培養(yǎng)基每個(gè)平皿定量8mL。

豆汁培養(yǎng)基：5°Bé豆汁1 000mL，硫酸鎂0.5g，可溶性淀粉20g，磷酸二氫鉀1g，硫酸銨0.5g，瓊脂20g，pH6.0，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

XSP-8C光學(xué)顯微鏡：上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器廠；UV-1100可見分光光度儀：北京萊博泰科儀器有限公司；SL1545恒溫培養(yǎng)箱：東南化學(xué)儀器有限公司；0～200mm游標(biāo)卡尺：中國(guó)機(jī)械進(jìn)出口公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌落形態(tài)觀察

察氏培養(yǎng)基和豆汁培養(yǎng)基倒平板后，將孢子稀釋涂布于平板，倒置于培養(yǎng)箱中31℃培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間觀察菌落形態(tài)，并測(cè)定菌落的直徑。

1.3.2 顯微鏡觀察

載玻片培養(yǎng)觀察法：將察氏培養(yǎng)基滅菌后冷卻至45℃左右，接入適量米曲霉孢子，搖勻后，迅速取培養(yǎng)基于無菌載玻片上，蓋上蓋玻片，將載玻片放入無菌平皿中，然后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間將載玻片取出，在顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)情況[2]。

1.3.3 產(chǎn)酶能力

將雙層酪蛋白培養(yǎng)基倒入平皿后，將稀釋后的孢子涂布于平皿，倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間測(cè)定菌落直徑d1和透明圈直徑d2，計(jì)算K值（K=d2/d1）。

1.3.4 酶學(xué)性質(zhì)研究

最適酶促反應(yīng)溫度：在pH7.2，不同溫度條件下（溫度分別為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）測(cè)定蛋白酶活力。

最適酶促反應(yīng)pH：配制不同pH值的磷酸鹽緩沖液和乳酸鹽緩沖液。在40℃，不同pH條件下（pH值為3、4、5、6、7、8、9、10）測(cè)定蛋白酶活力。

不同鹽含量條件下的粗酶蛋白酶活力：在40℃，pH7.2的條件下，測(cè)定粗酶酶液在不同鹽含量條件下（鹽含量分別為0、5%、10%、15%、20%、25%）的蛋白酶活力。

1.3.5 測(cè)定方法

樣品處理：將待測(cè)樣品混合均勻，稱取10g樣品于研缽內(nèi)，先加入蒸餾水20mL，靜止浸泡10min，然后小心將每顆成曲表皮磨下，倒入250mL三角瓶?jī)?nèi)，加入蒸餾水使三角瓶?jī)?nèi)樣品加水的質(zhì)量共100g，搖勻，置于40℃水浴間斷振搖1h，取出搖勻后過濾，此濾液用緩沖液稀釋5倍，即制得稀釋50倍的提取液，備用。

采用福林法蛋白酶活力測(cè)定，按SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》進(jìn)行測(cè)定，在40℃、pH7.2條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。淀粉酶活力測(cè)定參考3，5-二硝基水楊酸法[3]測(cè)定，在40℃條件下每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1mg麥芽糖，定義為一個(gè)淀粉酶活力單位。果膠酶活力測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法[4]測(cè)定，1mL酶液在50℃、pH3.5的條件下，1h分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個(gè)酶活力單位。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

2.1.1 菌落形態(tài)

將兩株米曲霉分別稀釋一定倍數(shù)涂布在察氏平板和豆汁平板上，置于31℃培養(yǎng)3～5d。米曲霉的菌落形態(tài)描述見表1。

表1 兩株米曲霉的菌落形態(tài)比較Table 1 Colony morphology of two strains of A.oryzae

由表1可知，兩株米曲霉的菌落在顏色以及形態(tài)上均有差異。

將兩株米曲霉孢子稀釋到一定倍數(shù)后分別涂布在豆汁平板培養(yǎng)基上，置于不同的溫度條件下培養(yǎng)，每天觀察米曲霉生長(zhǎng)情況，并測(cè)定菌落直徑，結(jié)果見表2。

由表2可知，在同一時(shí)間，米曲霉1號(hào)的菌落都比米曲霉2號(hào)的菌落大，由此可以推出米曲霉1號(hào)比米曲霉2號(hào)生長(zhǎng)得快。由表2還可以得知，兩株米曲霉均在31℃、36℃時(shí)生長(zhǎng)速度較快，溫度過高（41℃）時(shí)，米曲霉不生長(zhǎng)，而溫度較低時(shí)（26℃），米曲霉生長(zhǎng)緩慢。

2.1.2 細(xì)胞形態(tài)

利用載玻片培養(yǎng)法觀察米曲霉不同生長(zhǎng)階段的顯微形態(tài)，結(jié)果見表3。

由表3可知，米曲霉的生長(zhǎng)大致可分3個(gè)階段：孢子發(fā)芽期、菌絲生長(zhǎng)期和產(chǎn)孢子期。兩株米曲霉的孢子均近似圓形，頂囊呈燒瓶形，小梗單層，孢子穂呈掃帚形或半球形。兩者的區(qū)別是：米曲霉1號(hào)發(fā)芽較米曲霉2號(hào)快，產(chǎn)孢子也較早，這與2.1.1得到的結(jié)果相符。此外，米曲霉1號(hào)的孢子呈線狀排列，延伸較長(zhǎng)，表現(xiàn)為成曲時(shí)孢子較多，而米曲霉2號(hào)的孢子囊成簇?fù)頎?，孢子較少。

表2 不同溫度下兩株米曲霉的生長(zhǎng)情況比較Table 2 Growth states of two strains of A.oryzae under different temperature conditions

表3 米曲霉不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞形態(tài)Table 3 Cell morphology in different growth stages of two strains of A.oryzae

2.1.3 種曲形態(tài)

兩株米曲霉制成的種曲見圖1。

觀察種曲形態(tài)（圖1）可知，米曲霉1號(hào)種曲呈黃綠色（偏黃），菌絲較短，結(jié)塊較少，孢子多；米曲霉2號(hào)種曲呈黃綠色（偏綠），菌絲較長(zhǎng)，易結(jié)塊，孢子多。

2.1.4 成曲形態(tài)

兩株米曲霉制成的黃豆成曲見圖2。

觀察成曲形態(tài)（圖2）可知，米曲霉1號(hào)成曲黃綠色，孢子較多，菌絲較短；而米曲霉2號(hào)菌絲較長(zhǎng)，孢子較1號(hào)少，顏色比1號(hào)白。

圖1 兩株米曲霉的種曲形態(tài)Fig.1 Koji morphology of two strains of A.oryzae

圖2 兩株米曲霉的成曲形態(tài)Fig.2 Mature koji morphology of two strains of A.oryzae

2.2 平皿產(chǎn)酶能力的對(duì)比

兩株米曲霉在雙層酪蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h、60h、72h、84h時(shí)，分別測(cè)定菌落直徑d1及透明圈直徑d2，并計(jì)算菌種的K值（K=d2/d1），結(jié)果見表4。

表4 兩株米曲霉在酪蛋白平板上K值的比較Table 4 K values of two strains of A.oryzae in casein plate

由表4可知，米曲霉2號(hào)的菌落直徑遠(yuǎn)小于米曲霉1號(hào)，但其K值明顯大于米曲霉1號(hào)。根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]，K值和菌落直徑的大小共同決定了米曲霉蛋白酶活力的高低，當(dāng)菌落直徑相近時(shí)，K值大的產(chǎn)蛋白酶活力高；而當(dāng)K值相近時(shí)，菌落大的產(chǎn)蛋白酶活力高，但哪個(gè)因素對(duì)蛋白酶活力影響更大并未提及。張玉濤等[7]對(duì)多株米曲霉的菌落直徑（D）和K值對(duì)蛋白酶活（U）的影響進(jìn)行回歸分析，得出這樣一個(gè)關(guān)系：U=1.30K+0.032D-1.26。這個(gè)公式在一定程度上說明了K值對(duì)蛋白酶活力影響更大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定及生產(chǎn)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)米曲霉2號(hào)的蛋白酶活力始終大于米曲霉1號(hào)，這進(jìn)一步說明K值對(duì)蛋白酶活的影響更大。因此，在利用酪蛋白平板對(duì)菌種進(jìn)行初篩時(shí)，應(yīng)首先考慮K值大小，其次再考慮菌落大小。

2.3 不同酶的活力比較

表5 兩株米曲霉不同酶的活力比較Table 5 Different enzyme activity of two strains of A.oryzae

由表5可知，曲培養(yǎng)44h后，兩株米曲霉的淀粉酶酶活力差異較小，米曲霉2號(hào)要稍低于米曲霉1號(hào)，而果膠酶和蛋白酶活力則是米曲霉2號(hào)高于米曲霉1號(hào)，其中蛋白酶活力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于米曲霉1號(hào)。這說明，在酶活力方面，米曲霉2號(hào)更有優(yōu)勢(shì)。

2.4 成曲蛋白酶性質(zhì)對(duì)比

2.4.1 兩株米曲霉產(chǎn)酶活力的周期

在制成曲時(shí)，開始0～20h不取樣，在20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h時(shí)抽樣檢測(cè)中性蛋白酶活力，作出不同時(shí)間的酶活力關(guān)系曲線，找出最高中性蛋白酶酶活力的大致時(shí)間段，結(jié)果見圖3。

圖3 成曲制作過程中的蛋白酶活力變化Fig.3 Variation of protease activity in the process of mature koji production

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，成曲的蛋白酶活力呈逐漸上升的趨勢(shì)，到達(dá)一定值后趨于穩(wěn)定或略微下降。米曲霉1號(hào)和2號(hào)的成曲均在培養(yǎng)40h左右，蛋白酶活力達(dá)到最大值，但米曲霉2號(hào)的最大酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于米曲霉1號(hào)。

2.4.2 不同pH條件下成曲蛋白酶活力的曲線

配制pH3～10的磷酸鹽緩沖液或乳酸鹽緩沖液。按照福林法步驟測(cè)定酶活力，結(jié)果見圖4。

從圖4可知，米曲霉2號(hào)明顯比1號(hào)的蛋白酶活力高。在pH3～7的區(qū)間，米曲霉2號(hào)的酶活力上升較明顯，在pH7左右有一個(gè)酶活力峰，而后開始緩慢下降，至pH9時(shí)有最高酶活力峰，說明米曲霉2號(hào)成曲蛋白酶多為堿性蛋白酶。而米曲霉1號(hào)在大約pH6的時(shí)候有最高峰，pH9時(shí)也有一個(gè)酶活力峰，但較pH6低，說明米曲霉1號(hào)菌的最適反應(yīng)pH值為6，其堿性蛋白酶相對(duì)較弱。以上說明這兩個(gè)菌株是米曲霉的不同菌株，兩個(gè)菌株在蛋白酶活力的最高峰值的pH值不同，且蛋白酶活力的值相差較大。與前期觀察結(jié)果相符合。

圖4 成曲不同pH條件下測(cè)定的蛋白酶活力Fig.4 Protease activity of mature koji under different pH conditions

2.4.3 不同溫度條件下成曲蛋白酶活力的曲線

圖5 成曲在不同溫度下測(cè)定的蛋白酶活力Fig.5 Protease activity of mature koji under different temperature

由圖5可知，在35～60℃之間，隨著溫度的升高，兩株米曲霉的成曲蛋白酶活力均先升高后降低，但米曲霉1號(hào)的最適酶促反應(yīng)溫度為45℃，米曲霉2號(hào)的最適酶促反應(yīng)溫度為50℃，且2號(hào)的酶活遠(yuǎn)高于1號(hào)。

2.4.4 成曲蛋白酶的耐鹽曲線

圖6 成曲在不同氯化鈉濃度下測(cè)定的蛋白酶活力Fig.6 Protease activity of mature koji under different sodium chloride concentration

由圖6可知，隨著鹽分含量的增高，兩株米曲霉的成曲蛋白酶活力均逐漸降低，在20%氯化鈉條件下，蛋白酶活力均降至無鹽條件下的20%～30%。但米曲霉2號(hào)的蛋白酶活力在不同的鹽分含量下始終是米曲霉1號(hào)的2倍多。

3 結(jié)論

由米曲霉形態(tài)特征及蛋白酶性質(zhì)等方面的比較可知，2株米曲霉是不同的菌株，有著明顯的差異。米曲霉1號(hào)菌落較大、發(fā)芽和產(chǎn)孢子較快，種曲及成曲顏色偏黃，菌絲較短，孢子較多；而米曲霉2號(hào)菌落較小，孢子發(fā)芽時(shí)間及產(chǎn)孢子時(shí)間比1號(hào)晚，成曲孢子較1號(hào)少，但菌絲長(zhǎng)且粗壯，種曲顏色偏綠，成曲顏色偏白。米曲霉2號(hào)的產(chǎn)酶能力強(qiáng)。

蛋白酶性質(zhì)的研究結(jié)果顯示，成曲的蛋白酶性質(zhì)有差異，1號(hào)和2號(hào)的最適反應(yīng)溫度分別為45℃和50℃，最適反應(yīng)pH分別為6.0和9.0。在生產(chǎn)應(yīng)用過程中，兩菌株各有優(yōu)缺點(diǎn)，其生產(chǎn)性能同其形態(tài)和酶學(xué)性質(zhì)等有密切的相關(guān)性，因此對(duì)兩株菌種的基本性狀及酶的研究對(duì)企業(yè)生產(chǎn)極為重要。

本研究?jī)H從基本的微生物形態(tài)和酶活力等方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在分子生物學(xué)、基因?qū)用孢€有待進(jìn)一步研究。

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