沈敏佳，陸筑鳳*，劉 穎，于建興

（嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）又名脲烷，是發(fā)酵食品和酒精飲品在發(fā)酵或貯存過程中天然產(chǎn)生的污染物，曾作為醫(yī)藥和獸藥使用，后因有毒且療效欠佳而被禁止用于人類醫(yī)藥領(lǐng)域。2007年世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）認(rèn)定氨基甲酸乙酯為2A級的多位點致癌物[1-2]，可導(dǎo)致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病，并且乙醇對氨基甲酸乙酯的致癌性有促進作用[3-4]。氨基甲酸乙酯是食品發(fā)酵和貯藏過程中的天然產(chǎn)生物[5-6]，廣泛存在于飲品酒類（葡萄酒、黃酒等）、酸乳酪、醬油等發(fā)酵制品中，不同食品中的含量不一，一般低于650μg/kg[7-9]。長期飲酒的消費者是氨基甲酸乙酯受害的高危人群[10-11]。目前食品中的氨基甲酸乙酯是繼黃曲霉毒素之后的又一重要問題[12-14]。本實驗以分子生物學(xué)方法鑒定氨基甲酸乙酯降解菌株菌種，構(gòu)建氨基甲酸乙酯降解菌基因組文庫，為研究分析氨基甲酸乙酯降解酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

氨基甲酸乙酯降解菌1216：嘉興黃酒廠土樣中篩選獲得；大腸桿菌菌株BL21：實驗室保藏；大腸桿菌表達質(zhì)粒pUC18：購自上海生工。

1.1.2 主要試劑和耗材

CTAB/NaCl溶液：5g十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）溶于100mL 0.5mol/L NaCl 中；TE緩沖液：pH 8.0，10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）；20mg/mL蛋白酶K：購自上海生工；50mg/mL溶菌酶：購自上海生工；

上游引物27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

下游引物1492r：GGTTACCTTGTTACGACTT

限制性內(nèi)切酶BamH I和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Mbo I：購自大連寶生物有限公司。

篩選培養(yǎng)基（pH=6.5）：NH4NO30.5%，KH2PO40.2%，MnSO40.016%，MgSO40.13%，NaCl 0.3%，蛋白胨0.1%，葡萄糖1%，氨基甲酸乙酯0.5%，溴麝香草酚藍（560mg/L）1%，瓊脂2%。

技術(shù)創(chuàng)新 （inn）用每萬人專利申請量表示。創(chuàng)新產(chǎn)出可以直觀體現(xiàn)創(chuàng)新能力，而專利數(shù)量與創(chuàng)新產(chǎn)出具有較強的關(guān)聯(lián)性，與專利申請量相比，專利授權(quán)量具有一定的滯后性，同時根據(jù)張玉明（2007）的研究，專利申請量與技術(shù)創(chuàng)新能力在空間分布上具有較好的匹配性［14］，因此選取專利申請量。

1.2 儀器與設(shè)備

VS-15000N高速離心機：韓國Vision公司；MG96+基因擴增儀、LG2020型凝膠成像系統(tǒng)：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；EPS-100電泳儀：上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 目的菌株基因組DNA的提取及過程優(yōu)化

無菌水（或Tris-EDTA緩沖液）懸浮菌體與蛋白酶K和溶菌酶液混勻，于37℃溫育2h。加入CTAB/NaCl溶液，混勻，于60℃溫育10min。離心取上清加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）混合液混勻，離心吸取上清液。加入0.6倍體積異丙醇，DNA沉淀，靜置10min，離心取沉淀，懸浮于TE緩沖液，用1%瓊脂糖凝膠電泳證實。

過程優(yōu)化實驗可適當(dāng)延長37℃溫育時間，使得細(xì)菌細(xì)胞充分裂解，提高DNA的得率。

1.3.2 基因組DNA的PCR擴增

以基因組DNA為模板，以27f、1492r為引物進行PCR擴增。PCR循環(huán)設(shè)定為：預(yù)變性94℃、10min；94℃、60s，53℃、60s，72℃、90s，共30個循環(huán)；72℃、10min；4℃，保存。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物以1%的凝膠電泳進行鑒定，并按SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒上的操作進行切膠回收。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的測序

上一步的膠回收產(chǎn)物由上海上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結(jié)果在GenBank上進行Blast比對，結(jié)合該菌形態(tài)學(xué)特征進行菌種鑒定。

（1）pUC18質(zhì)粒的提取

用1mL 75%vol 乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀2次，去上清、干燥。加20μL TE緩沖液，使質(zhì)粒DNA完全溶解，-20℃保存。質(zhì)粒DNA用1%的瓊脂糖電泳進行證實，并用切膠回收試劑盒對質(zhì)粒DNA進行回收。

（2）酶切

Mbo I的識別序列為：GATC，BamH I的識別序列為：GGATCC。2種內(nèi)切酶能夠產(chǎn)生相同的粘性末端。用Mbo I對基因組DNA進行酶切，BamH I對pUC18進行酶切，酶切產(chǎn)物以1%的凝膠電泳鑒定，并用試劑盒進行切膠回收?；厥债a(chǎn)物基因組DNA與載體在T4 DNA連接酶的作用下形成重組載體，再轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21，構(gòu)建重組菌。

1.3.5 陽性重組載體的篩選

將適當(dāng)體積采用上述方法轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含溴麝香草酚藍的篩選培養(yǎng)基上，調(diào)至最佳變色pH，37℃孵育12～16h。直接從選擇性平板上挑取四周明顯變藍色的菌落，加到0.5mL含氨基甲酸乙酯的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)液中37℃以120r/min搖育2h，平板放置4℃保存。抽提陽性重組菌的質(zhì)粒，并用BamH I對抽提產(chǎn)物進行酶切，通過電泳結(jié)果近一步判斷重組的質(zhì)粒是否含有插入的預(yù)期片段。對目的片段進行切膠回收。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA

采用上述方法獲取的基因組DNA，經(jīng)1%的瓊脂糖電泳證實，片段長度大于5 000bp，如圖1所示，條帶清晰，明亮。

圖1 基因組DNA的凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of genomic DNA

2.2 PCR產(chǎn)物

以27f、1492r為引物擴增基因組DNA，得到的16S rDNA片段產(chǎn)物，長度約為1500bp。如圖2所示。

圖2 PCR產(chǎn)物（16S rDNA片段）凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis of PCR product (16S rDNA)

2.3 菌種鑒定

16S rDNA PCR產(chǎn)物由上海生物工程有限公司進行測序（基因序列如圖3所示），并通過在GenBank上進行Blast對序列進行比對分析。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)所擴增的1 500bp的DNA片段與基因庫中臘樣芽孢桿菌的基因序列呈99%同源。并且通過形態(tài)學(xué)鑒定可知氨基甲酸乙酯脫氨酶菌株的菌體細(xì)胞成桿狀，末端方，成短或長鏈，（1.0～1.2）μm×（3.0～5.0）μm，如圖4所示。產(chǎn)芽胞，芽胞圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊無明顯膨大。革蘭氏陽性，無莢膜，運動。在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)24h，可形成圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、無色素、稍有光澤的白色菌落（似蠟燭樣顏色）直徑5～7mm。綜上所述，可初步判定氨基甲酸乙酯降解酶菌株屬于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖3 16S rDNA基因序列Fig.3 Gene sequences of 16S rDNA

圖4 固體培養(yǎng)菌落形態(tài)圖Fig.4 Bacillus cereus colonial morphology

2.4 酶切產(chǎn)物

基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mbo I酶切后的電泳圖如圖5所示，通過上述方法提取的pUC18質(zhì)粒的瓊脂糖電泳圖如圖6所示。

圖5 基因組DNA酶切的凝膠電泳Fig.5 Gel electrophoresis of genomic DNA digested

圖6 pUC18的凝膠電泳Fig.6 Gel electrophoresis of pUC18

2.5 陽性重組質(zhì)粒篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化

圖7 涂布有氨基甲酸乙酯降解酶菌株的篩選培養(yǎng)基(N2)和對照培養(yǎng)基(1)Fig.7 The screening medium with urethane degradation enzyme strains(N2)and control medium(1)

氨基甲酸乙酯降解酶能夠使培養(yǎng)基中的EC脫氨產(chǎn)生NH4+，使培養(yǎng)基的pH值上升，而溴麝香草酚藍的變色范圍為6.0～7.2（黃-綠-藍）。由于含有陽性重組質(zhì)粒的大腸桿菌能夠降解EC，涂布在含有1%（560mg/L）溴麝香草酚藍的培養(yǎng)基上能夠使培養(yǎng)基的顏色從黃色變?yōu)樗{色，而不含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能使培養(yǎng)基變色，所以可以通過顏色反應(yīng)將陽性重組菌株篩選出來，如圖7所示。

3 結(jié)論

實驗經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定氨基甲酸乙酯降解菌株1216為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），確定篩選培養(yǎng)基中加入1%（560mg/L）溴麝香草酚藍，調(diào)pH至6.5（最佳變色pH）可有效篩選氨基甲酸乙酯降解菌。利用Mbo I限制性內(nèi)切酶構(gòu)建了蠟樣芽孢桿菌1216的基因組文庫，為后期篩選含有氨基甲酸乙酯降解酶基因的重組菌，研究分析該基因及酶的特性等奠定基礎(chǔ)。

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