王曉丹，班世棟，胥思霞，王榮村，沈錫翠，邱樹毅*

（1.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州青酒集團(tuán)有限責(zé)任公司，貴州 鎮(zhèn)遠(yuǎn) 557702；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

大曲是釀酒中的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，是發(fā)酵過程中一些酶產(chǎn)生的必需物，所以有“曲為酒之母”的說法。不同香型的白酒的用曲量是不同的[1]，濃香型大曲用量為20%左右，而醬香型白酒的用曲量可以達(dá)到85%～95%[2]，不同品質(zhì)的大曲形成白酒香味成分也不同[3-6]，優(yōu)質(zhì)曲所釀造的酒中總酸、總酯和氨基酸的量比普通的大曲要多[7-9]。對(duì)于大曲來(lái)說，糖化力和液化力指標(biāo)比較重要[10-12]，因?yàn)殛P(guān)系到原料的糖化結(jié)果，與酒的出酒率有直接關(guān)系，所以對(duì)于液化淀粉酶和糖化淀粉酶的研究較多，其他水解酶則對(duì)白酒的香味物質(zhì)的生成或前體物質(zhì)的生成有重要的貢獻(xiàn)[13-16]。

研究了貴州某企業(yè)所生產(chǎn)的大曲中各種酶及酶活力與白酒品質(zhì)的關(guān)系，為后續(xù)改良大曲的質(zhì)量，提高酒品質(zhì)和減少大曲用量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型大曲：貴州某企業(yè)提供。豆餅粉、麩皮：河南省臺(tái)前縣興隆面粉有限公司提供。氣相色譜所用試劑均為色譜純，其他試劑和藥品均為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；6890N氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 酸度的測(cè)定

稱取5.0g絕干曲，置于250mL燒杯中。加水100mL，搖勻，于25℃浸泡30min，緩慢攪拌。經(jīng)過濾，得濾液備用。取濾液10mL，于250mL三角瓶中，再加水20mL，滴1%酚酞指示劑2滴，0.1mol/L NaOH溶液滴定至微紅色。酸度計(jì)算公式：

式中：C為NaOH溶液的摩爾濃度，mol/L；V為消耗NaOH溶液的體積，mL ；為100mL浸出液取10mL浸出液；10 5為5g曲換算成10g曲。

1.3.2 糖化力的測(cè)定

酶浸出液及糖化力測(cè)定試液制備：在250mL燒杯中加入蒸餾水90mL，再稱取5.0g絕干曲粉加入燒杯中，在30℃條件下水浴1h，每隔15min攪拌一次，之后用定性濾紙過濾，最初的5mL濾液棄去，剩下的濾液4℃保藏。

在100mL容量瓶中吸取2%可溶性淀粉溶液50mL，35℃水浴20min，再加入10mL酶浸出液，搖勻后準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)1h后加入1mol/L的NaOH溶液3mL，待其停止反應(yīng)，反應(yīng)液至室溫后用蒸餾水定容，此時(shí)的溶液為堿性。

空白試驗(yàn)液：在100mL容量瓶中吸取50mL 2%可溶性淀粉溶液，先加1mol/L NaOH溶液3mL，搖勻后加入10mL酶浸出液，之后用蒸餾水定容。

糖分測(cè)定：在250mL三角瓶中吸取5mL糖化液，再分別加入5mL費(fèi)林氏甲、乙液，再加適量0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，搖勻，之后在電爐上加熱至沸，立即用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定，直到藍(lán)色消失。滴定需要在1min內(nèi)完成，滴定所消耗葡萄糖的體積為V1。

空白試驗(yàn)液的測(cè)定：用5mL的空白液代替糖化試液，其他操作與樣品處理相同，葡萄糖消耗體積為V0。

糖化力的定義：1g絕干曲在35℃、pH4.6條件下反應(yīng)1h，將可溶性淀粉分解后葡萄糖的質(zhì)量（mg）數(shù)，U/g。糖化力計(jì)算公式：

式中：V0為5mL空白液消耗0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的體積，mL；V1為5mL糖化液消耗0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的體積，mL；ρ為標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度，g/mL；為5g干曲浸出后在100mL溶液中取出10mL進(jìn)行糖化試驗(yàn)；為100mL糖化液中取5mL定糖；1 000為換算系數(shù)。

1.3.3 液化力的測(cè)定

5%酶液的制備：取500mL燒杯，稱取10g絕干曲粉加入其中，將200mL磷酸緩沖液（pH 6.0）在40℃條件下預(yù)熱，然后加入燒杯中，并在水浴鍋中保溫1h，每隔15min攪拌1次，等浸泡時(shí)間結(jié)束后用定性濾紙過濾，最初的5mL濾液棄去，濾液即為供試酶液。

液化力的定義：1g絕干曲在60℃，1h液化可溶性淀粉的質(zhì)量（g）。

液化力測(cè)定：用移液管取2%可溶性淀粉溶液20mL于25mm×200mm的具賽試管中，再加入5mL磷酸緩沖液（pH 6.0），在60℃條件下水浴10min，之后吸取1mL酶浸出液加入試管中搖勻，立即計(jì)時(shí)。在白瓷板中加入1.5mL稀碘液，每隔一定時(shí)間吸取0.5mL反應(yīng)液于白磁板孔中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，白瓷板中的顏色逐漸由藍(lán)色變?yōu)榧t棕色，以最后一次呈藍(lán)色為終點(diǎn)，樣品做2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。最初取反應(yīng)液的間隔時(shí)間可長(zhǎng)些，當(dāng)顏色接近終點(diǎn)時(shí)須仔細(xì)檢查，至沒有藍(lán)色為反應(yīng)終點(diǎn)。要求樣品與酶液的反應(yīng)在2～3min內(nèi)完成為宜，否則需要調(diào)整酶液濃度后重新測(cè)定，酶液總體積以v表示，反應(yīng)時(shí)間為t。液化力計(jì)算公式：

式中：20為2%可溶性淀粉溶液的體積，mL；60為時(shí)間換算系數(shù)；v為測(cè)定時(shí)所用酶液總體積（1mL）；t為反應(yīng)時(shí)間（2min）。

1.3.4 酯化力的測(cè)定

酯化液制備：取0.1%己酸體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液100mL于250mL蒸餾燒瓶中，稱取5g干曲于燒瓶中，在32～35℃條件下酯化100h，之后再加入50mL蒸餾水，加熱蒸餾，當(dāng)蒸餾液為100mL時(shí)測(cè)定餾出液中己酸乙酯的含量。

酯含量測(cè)定：用移液管吸取餾出液50mL，之后用0.1mol/L NaOH中和至酚酞的終點(diǎn)，再吸取25mL 0.1mol/L NaOH溶液加入其中，沸水浴回流皂化30min，待其冷卻后用0.05mol/L H2SO4滴定，當(dāng)酚酞紅色消失時(shí)為滴定終點(diǎn)。酯化力計(jì)算公式：

式中：C1、C2分別為NaOH和H2SO4的濃度，mol/L；V1、V2分別為NaOH和H2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；m為干曲質(zhì)量，g ；為從蒸餾液100mL中取出50mL測(cè)酯含量；144為己酸乙酯的換算系數(shù)。

1.3.5 蛋白水解力的測(cè)定

0.5 %干酪素溶液液的制備：稱取干酪素0.5g（準(zhǔn)確至0.000 1g）放入燒杯中，加水50mL，NaOH溶液10mL，攪拌均勻，加熱至沸，溶解、冷卻，加入酚酞指示劑3滴，滴加鹽酸溶液中和至微紅色消失（約8mL），加檸檬酸鈉溶液7.5mL，移入1 000mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻；若隔日使用，加甲苯少許，放入冰箱中保存，以防微生物滋長(zhǎng)。

5%樣品溶液的制備：稱取相當(dāng)于5g絕干曲（稱準(zhǔn)至0.001g），移入100mL容量瓶中，搖勻，定容至刻度，在40℃水浴中，間斷攪拌1h，過濾備用。

測(cè)定：取試管10支，按順序編號(hào)，依照下表各試管規(guī)定量，分別加入0.5%干酪素溶液，5%樣品溶液和蒸餾水，混勻。各試管同置于40℃水浴中，保溫60min。取出各試管，分別加入硫酸鎂硝酸溶液0.5mL，混合均勻，放入試管架上靜置1h，觀察各試管以不生成沉淀者為蛋白質(zhì)分解已完全的標(biāo)志，即生成沉淀的試管前的一個(gè)沒有生成沉淀的試管為蛋白質(zhì)剛好完全分解的臨界值管，記錄臨界值管中5%樣品溶液的體積a。蛋白分解力計(jì)算公式：

式中：0.5/100×5為干酪素溶液的稀釋倍數(shù)；5/100為樣品溶液的濃度，%；a為臨界值試管中大曲浸出液的體積，mL。

1.3.6 白酒中各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)

按照GB/T10345—2007《白酒分析方法》進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒質(zhì)的測(cè)定

針對(duì)企業(yè)基酒酒質(zhì)發(fā)生變化，尤其是酒體中乳酸乙酯含量升高，己酸乙酯含量下降，高級(jí)醇含量減少的現(xiàn)況。對(duì)全年酒質(zhì)分析的結(jié)果表明（見表1），己酸乙酯與乳酸乙酯含量之比平均為0.65，主體香味不突出，酒體淡薄。

表1 酒體中己酸乙酯與乳酸乙酯的比值Table 1 Ratio of ethyl hexanoate and ethyl lactate in liquor

為了提高產(chǎn)率與產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本。對(duì)大曲的質(zhì)量，進(jìn)行檢測(cè)，并針對(duì)其質(zhì)量，采用酶制劑加以改良，從而達(dá)到保證質(zhì)量、提高產(chǎn)量的目的。

2.2 大曲中糖化酶的產(chǎn)生及其與酒質(zhì)的關(guān)系

白酒生產(chǎn)是以大曲為糖化發(fā)酵劑，名優(yōu)酒大曲的糖化力往往在250～500mg/（g·h），而某企業(yè)生產(chǎn)的大曲糖化力一般均在750mg/（g·h）左右，且酸度較大。制曲前期的曲塊中細(xì)菌和酵母的數(shù)量占優(yōu)勢(shì)，但是隨著品溫的升高，大量微生物的衰亡或生長(zhǎng)受到抑制，數(shù)量急劇下降，這種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)發(fā)生改變。與細(xì)菌和酵母不同的是，在制曲前期，霉菌的生長(zhǎng)速度比較緩慢，在培養(yǎng)5d后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，當(dāng)培養(yǎng)8d后到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，以后進(jìn)入穩(wěn)定期，而其中大量的霉菌為根霉。根霉的糖化酶活力最高，除此而外還有黑曲霉和紅曲霉也是糖化酶的產(chǎn)生菌。

根霉所產(chǎn)的酸主要有3種：即乳酸、延胡索酸和蘋果酸。有些根霉只產(chǎn)乳酸，有些只產(chǎn)延胡索酸，有些不僅產(chǎn)乳酸而且還產(chǎn)延胡索酸而有些則這3種酸都產(chǎn)。但在以往的研究中發(fā)現(xiàn)只產(chǎn)延胡索酸和蘋果酸的根霉對(duì)濃香型白酒的品質(zhì)無(wú)明顯的影響[17]。

在根霉的糖酵解途徑中產(chǎn)生延胡索酸，在細(xì)菌或酵母代謝中，由延胡索酸酶催化為L(zhǎng)-蘋果酸，但隨著蘋果酸的大量累積，并在乳酸菌存在的條件下，會(huì)進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，終產(chǎn)物中L-乳酸和CO2的含量較高，并含有少量的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH2）和丙酮酸。

表2 不同糖化力的大曲試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of different diastatic power of Daqu

大曲中的根霉在提供了高的糖化力的同時(shí)也產(chǎn)生了大量的乳酸，造成大曲pH值下降，當(dāng)發(fā)酵時(shí)乳酸和乙醇會(huì)發(fā)生酯化反應(yīng)，生成乳酸乙酯，使得白酒中的含量增加。

以下是用不同糖化力的大曲生產(chǎn)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可知，糖化力高的大曲應(yīng)用于生產(chǎn)，雖然出酒率略有升高，但由于乳酸乙酯含量過高，這使得酒體發(fā)悶，有強(qiáng)烈的青草味，從而影響了酒的品質(zhì)。

2.3 大曲中蛋白酶的作用與影響

蛋白水解酶是催化多肽或蛋白質(zhì)水解的酶的統(tǒng)稱，簡(jiǎn)稱蛋白酶。蛋白酶對(duì)機(jī)體的新陳代謝及生物調(diào)控起重要作用。蛋白酶可以將大分子的蛋白質(zhì)降解為小分子的多肽或者更小的分子氨基酸等物質(zhì)。如果在大曲中缺乏蛋白酶或者是酶活力較低，則對(duì)酒質(zhì)的影響比較明顯，造成酒體質(zhì)量偏低。

在白酒中雜醇油含量主要與支鏈氨基酸有關(guān)，蛋白質(zhì)分解成氨基酸再進(jìn)一步水解放出氨、脫羧基，生成醇。除異丁醇和異戊醇外，還有戊醇、丙醇、異丙醇、庚醇等。酵母在代謝途徑中能夠產(chǎn)生脫氨和脫酸酶類，這些酶可以使苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成β-苯乙醇，色氨酸轉(zhuǎn)化成色醇，酪氨酸轉(zhuǎn)化成酪醇等。因此大曲中的蛋白酶含量的多少或者活力的高低，決定了蛋白質(zhì)降解的程度，這也決定了高級(jí)醇含量的多少。

表3 窖泥中氨基酸含量與酒體中雜醇油、己酸乙酯含量關(guān)系Table 3 Relationship between amino acid content in pit soil and fusel oil,ethyl caproate content in liquor

氨基酸不僅與高級(jí)醇的生成有關(guān)，而且其含量與己酸乙酯生成的量呈正比，為考查窖泥中氨基酸含量與酒體中雜醇油、己酸乙酯含量關(guān)系，隨機(jī)抽取9個(gè)樣，結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果可知，窖泥中氨基酸含量越高，酒體中的雜醇油和己酸乙酯含量也越高。一些可溶性氨基酸滲入窖泥內(nèi)，為己酸菌繁殖生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)源，促進(jìn)了己酸菌的發(fā)酵，從而產(chǎn)生更多的己酸。

據(jù)此原理可以推斷，氨基酸含量的增加有利于酯的生成。

酒體中重要風(fēng)味組份包括含硫有機(jī)物，比如二甲基硫、二甲基二硫的生成與半胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸的存在有關(guān)。即使含硫有機(jī)物的含量很少，可是由于其閾值極小，從而對(duì)白酒風(fēng)味產(chǎn)生了一定的影響，特別是名優(yōu)酒中含量較高。

表4 大曲中蛋白水解酶活力高低與酒質(zhì)的關(guān)系Table 4 Relationship between proteolytic enzyme activity and liquor quality

大曲中蛋白水解活力不同對(duì)酒質(zhì)產(chǎn)生較大的影響見表4。

表4結(jié)果表明，大曲中蛋白水解酶活性高，酒體中的高級(jí)醇、己酸乙酯含量高，酒體醇厚，主體香味突出。

2.4 大曲中酯化酶活力對(duì)酒質(zhì)的影響

己酸乙酯含量的高低及與其他酯類物質(zhì)（乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯等）的比例關(guān)系決定酒質(zhì)的優(yōu)劣，這是判定濃香型白酒酒質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。根據(jù)酯化反應(yīng)的原理，在生產(chǎn)濃香型白酒時(shí)，為提高白酒中己酸乙酯的含量，一般采用的是分離并篩選產(chǎn)己酸含量較高的菌株，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化其培養(yǎng)工藝，提高在窖內(nèi)的己酸含量。并且有時(shí)在改造窖池時(shí)，為穩(wěn)定己酸的含量，在其中加入己酸菌液，以提高酒醅中己酸含量，從而達(dá)到提高酒體中己酸乙酯含量的目的。但酯化反應(yīng)速度較慢，所以在有限的時(shí)間內(nèi)，轉(zhuǎn)化成酯的速率比較低。目前一般利用酯化酶催化技術(shù)，就是將己酸和乙醇用酯化酶催化生成己酸乙酯，使其含量明顯升高。在形同的條件下，在大曲中加入2%酯化酶進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，此時(shí)酯化酶的活力為236mg/（g·100h），其結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)窖中的己酸乙酯含量比對(duì)照窖中的要高，其分別是5.37g/L和3.26g/L（底糟），表明增加酯化酶能提高己酸乙酯含量。

酯化酶能夠在水相中水解脂肪，可將酒醅中的脂肪水解為甘油和脂肪酸，脂肪酸能夠與乙醇酯化生成油酸乙酯、亞油酸乙酯和棕櫚酸乙酯等高級(jí)脂肪酸，同時(shí)，在固態(tài)發(fā)酵條件下，酯化酶催化己酸、乳酸等小分子酸與乙醇作用，生成己酸乙酯、乳酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)，所以酯化酶的存在，對(duì)酒的風(fēng)格的形成，起到舉足輕重的作用。

3 結(jié)論

綜上所述，大曲的生化性能，對(duì)酒質(zhì)的優(yōu)劣和白酒產(chǎn)量的高低有著決定作用。大曲糖化力高，而蛋白水解酶、酯化酶活力低，長(zhǎng)期使用，質(zhì)量和產(chǎn)量出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這是必然的結(jié)果。因此保證大曲的質(zhì)量，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大曲，是釀造優(yōu)質(zhì)的白酒的前提條件。

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