趙秀舉，劉志國(guó)

（武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430023）

洛伐他?。╨avostatin）也稱莫那可林K（Monacolin K，MK），可以有效降低冠心病和心肌梗塞的發(fā)病率和死亡率。洛伐他汀主要用土曲霉（Aspergillus terreus）和紅曲霉（Monascus rubber）經(jīng)深層發(fā)酵制取，紅曲霉（Monascus rubber）不僅產(chǎn)生洛伐他汀，而且產(chǎn)生據(jù)推測(cè)為洛伐他汀生物合成的中間產(chǎn)物的聚酮類物質(zhì)莫那可林J、L、X，具有很強(qiáng)的降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂的功能。功能紅曲是紅曲霉（Monascus）繁殖于大米等糧食作物上的制品，可藥食兼用。含有豐富的酶系和多種生理活性物質(zhì)如莫那可林K、麥角固醇、γ-氨基丁酸、天然植物激素等代謝產(chǎn)物，具有極高的營(yíng)養(yǎng)、保健藥用價(jià)值，是天然安全有效的保健食品、藥品原料。在膽固醇的合成途徑中，羥甲基戊二酰輔酶A（hydroxyl methyl glutaryl-coenzyme A，HMG-CoA）還原酶起限速性關(guān)鍵作用，而Monacolin類化合物（Monacolin J、K、L、M、X）是HMG-CoA還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以有效減少膽固醇的合成，其中Monacolin K的活性最為顯著[1-5]。研究結(jié)果表明，功能紅曲能有效降低體內(nèi)總膽固醇以及甘油三酯、低密度脂蛋白水平，同時(shí)升高高密度脂蛋白水平，從而具有顯著的降膽固醇及降血脂的作用；其中的Monacolin K多為酸式，其空間結(jié)構(gòu)與體內(nèi)羥甲基戊二酸輔酶A（HMG-CoA）還原酶更為接近，活性較內(nèi)酯式高約一倍，無需水解直接發(fā)揮抑制體內(nèi)膽固醇合成的作用[6-9]。

作為功能紅曲的主要成分，優(yōu)化Monacolin K的產(chǎn)量成為發(fā)酵過程的重要內(nèi)容。同時(shí)，功能紅曲中的其他成分，如紅曲色素是否參與及如何參與降血脂的機(jī)理還不清楚。本研究從培養(yǎng)溫度及持續(xù)時(shí)間入手，采用多變量分析的方法優(yōu)化MK產(chǎn)量。同時(shí)利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)考察MK、功能紅曲米的降脂效果及機(jī)理[10-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲（Monascus ruber）：中國(guó)科學(xué)院微生物所；洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；肝L02細(xì)胞：美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；早秈米：湖北武漢白沙洲農(nóng)副產(chǎn)品大市場(chǎng)；醋酸、葡萄糖、酵母膏、MgSO4、NaNO3、瓊脂：申試化工有限公司。

培養(yǎng)基：葡萄糖5%，酵母膏1%，MgSO40.1%，NaNO30.2%，pH 4～5，滅菌（123℃、30min）。

1.2 儀器與設(shè)備

HP1100高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；YPL-1回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速藥瓶柜、WJ恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械公司；TDL-40B離心機(jī)、YP600電子天平：上海安亭儀器廠；JNOEC XS-212-201生物顯微鏡：南京江南永新光學(xué)有限公司；7500 PCR儀：美國(guó)Rockwell Allen-Bradley公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲發(fā)酵產(chǎn)洛伐他汀工藝流程

原料（早秈米）預(yù)處理（蒸米102℃、3～5min，涼米至40～50℃）→菌種兩級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)（試管菌種→一級(jí)三角搖瓶菌種→二級(jí)三角搖瓶菌種）→接種（接種量20%）→高溫培養(yǎng)（28～39℃，3～6d）→低溫培養(yǎng)（17～25℃，10～18d）→烘干（60℃以下，水分≤6%）→包裝

1.3.2 MK含量測(cè)定方法

發(fā)酵所得紅曲米粉碎過60目篩后用甲醇萃取，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定莫那可林K（MK）含量。

色譜條件：色譜柱Zorbax SBC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈/磷酸水體積分?jǐn)?shù)為65∶35；柱溫25℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)238nm；流量1mL/min；進(jìn)樣量20μL；紅曲米甲醇萃取液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后用HPLC進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件

分別考察高溫持續(xù)時(shí)間，低溫持續(xù)時(shí)間，裝料量對(duì)MK產(chǎn)量的影響。在單個(gè)因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以MK產(chǎn)量為考察指標(biāo)，MK固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of solid fermentation conditions

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將人的肝L02細(xì)胞置于25cm2培養(yǎng)瓶中，并放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒掉，加入1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），潤(rùn)洗3次后倒掉PBS，加入1～2mL 0.25%胰酶，消化完畢后加入含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）高糖培養(yǎng)基3mL，輕輕吹打細(xì)胞使其脫落，將細(xì)胞懸液置于離心管中，低速離心5min，棄上清液，加入含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基3mL，重懸細(xì)胞。取出一半的細(xì)胞液轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，之后分別向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中添加飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）作為高脂模型及MK、功能紅曲米（functionalMonascusrice，F(xiàn)R）等干預(yù)物，正常組僅補(bǔ)足培養(yǎng)基，加入的培養(yǎng)基和干預(yù)物的總體積為3mL，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增條件

cDNA 使用oligo-（dT）15 引物根據(jù)Invitrogen公司使用手冊(cè)合成。PCR 引物使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，持家基因beta-actin 作為內(nèi)控基因。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋菏紫?5℃持續(xù)15min，接著94℃持續(xù)5s、58℃持續(xù)15s、72℃持續(xù)10s共40個(gè)循環(huán)。mRNA 相對(duì)含量使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。統(tǒng)計(jì)差異由參數(shù)方法one-way ANOVA multiple range test和非參數(shù)方法Mann-Whitney U test進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)差異按照P＜0.05執(zhí)行[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫溫度及持續(xù)時(shí)間

高溫發(fā)酵5d的條件下，溫度對(duì)MK產(chǎn)量的影響見表2。由表2可知，35℃的高溫是紅曲發(fā)酵產(chǎn)MK的最適溫度。

表2 高溫溫度對(duì)MK產(chǎn)量的影響Table 2 Effects of high temperature on MK yield

在35℃的高溫條件下，持續(xù)時(shí)間對(duì)MK產(chǎn)量的影響見表3。由表3可知，5d的發(fā)酵時(shí)間MK產(chǎn)量最高。

表3 高溫時(shí)長(zhǎng)對(duì)MK產(chǎn)量的影響Table 3 Effects of high temperature time on MK yield

2.2 低溫溫度及持續(xù)時(shí)間

低溫發(fā)酵15d的條件條件下，溫度對(duì)MK產(chǎn)量的影響見表4。由表4可知，22℃的低溫是紅曲發(fā)酵產(chǎn)MK的最適溫度。

表4 低溫溫度對(duì)MK產(chǎn)量的影響Table 4 Effects of low temperature on MK yield

在22℃的低溫下，持續(xù)時(shí)間對(duì)MK產(chǎn)量的影響見表5。由表5可知，18d的發(fā)酵時(shí)間MK產(chǎn)量最高20.8‰，但考慮到15d時(shí)的MK產(chǎn)量20‰與20.8‰相差甚微且減少3d的時(shí)間對(duì)于利用空間和減少能源消耗有利，所以選用15d的低溫發(fā)酵時(shí)間。

表5 低溫時(shí)長(zhǎng)對(duì)MK產(chǎn)量的影響Table 5 Effects of low temperature time on MK yield

2.3 容器體積

在裝料比均為36%的前提下，固體發(fā)酵容器體積對(duì)MK的影響見表6。由表6可知，1L三角瓶的MK產(chǎn)量最高。容器體積主要通過接觸面積、傳熱等因素對(duì)MK生成量產(chǎn)生影響。

表6 發(fā)酵容器體積對(duì)MK產(chǎn)量影響Table 6 Effects of the volume of fermentation container on MK yield

2.4 裝料量

在1L發(fā)酵體積的前提下，裝料量對(duì)MK產(chǎn)量影響見表7。由表7可知，36%的裝料量MK生成量最高。

表7 裝料量對(duì)MK產(chǎn)量影響Table 7 Effects of the loading volume on MK yield

2.5 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

高低溫持續(xù)時(shí)間及裝料量之間可能存在交互作用；在高溫35℃、低溫22℃的條件下，綜合考慮高溫溫度持續(xù)時(shí)間，低溫溫度持續(xù)時(shí)間，裝料量等因素的影響，以MK產(chǎn)量為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表8。

由表8結(jié)果表明，影響MK產(chǎn)量的因素順序?yàn)镃＞A＞B，即裝料量對(duì)MK產(chǎn)量的影響最大，高溫發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)最小。A2B2C2為最優(yōu)水平組合，即高溫發(fā)酵5d，高溫發(fā)酵15d，裝料量360g/L。在該最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，MK產(chǎn)量為24‰。

表8 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiments for optimization of solid fermentation conditions

表9 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表9可知，在0.05的顯著性水平下，裝料量對(duì)MK產(chǎn)量結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他兩個(gè)因素對(duì)MK產(chǎn)量結(jié)果影響均不顯著。

2.6 基因表達(dá)

進(jìn)行定量PCR（qPCR）測(cè)定所用引物見表10。ATF4、CHOP分別為活化轉(zhuǎn)錄因子4、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。

表10 引物序列Table 10 Primers sequences

MK、功能紅曲米（FR）等干預(yù)物對(duì)肝L02細(xì)胞的基因表達(dá)的影響見圖1。由圖1可知，MK和功能紅曲米（FR）均具有明顯的降脂效果，且功能紅曲略優(yōu)于MK（P＜0.05）。

圖1 基因定量PCR表達(dá)變化Fig.1 Expression levels of gene quantification PCR

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了功能紅曲固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK工藝條件優(yōu)化：高溫35℃持續(xù)5d，低溫22℃持續(xù)15d，裝料量360g/L；同時(shí)初步探討了MK降脂作用，發(fā)現(xiàn)功能紅曲與MK通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起降脂作用。

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