黃瑩偲，鄧曉婷，李 冰，蔡春生，高永清，鐘南京*

（1.廣東藥學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山 528458；2.華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640）

0 前言

大量研究表明，臨床許多疾病與機體的自由基、活性氧有關(guān)[1].活性氧主要包括羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)和有機或無機過氧化物(ROO·)等，有較強的生物活性，機體過量的自由基會引起蛋白質(zhì)變性、多糖降解、DNA 鏈斷裂等[2].灰兜巴（又名閉口袋）是一種生長在四川峨眉山老茶樹上的菌科類植物，灰兜巴多糖被認(rèn)為具有降低血糖的重要生理功能[3-5].作者旨在研究經(jīng)過提取分離純化的灰兜巴多糖組分的抗氧化活性和清除自由基的能力，為進一步探索灰兜巴多糖的抗氧化能力與降血糖作用之間的關(guān)系提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰兜巴采購自四川省峨眉山；木瓜蛋白酶（美國Sigma 公司）；DEAE-Cellulose 52 (Whatman 產(chǎn)品) ；鄰苯三酚、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵、水楊酸等均為分析純.

HH-ZKS 型水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；R-1001N 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HC-3618R 高速冷凍離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；LGJ-25 型冷凍干燥機：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BS-100A自動部分收集器：上海青浦滬西儀器廠；HL-2 恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司.

1.2 方法

1.2.1 灰兜巴多糖的提取分離和純化[6-8]

采用水提醇沉法提取灰兜巴多糖，取適量灰兜巴加蒸餾水回流煎煮2 次，每次2 h，合并濾液離心，取上清液減壓濃縮至原來體積的1/15～1/10，濃縮液加入無水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)達到80%進行醇沉，離心后復(fù)溶沉淀物冷凍干燥得灰兜巴粗多糖；然后用木瓜蛋白酶-Sevag 法脫蛋白，配制10 mg/mL 粗多糖溶液，加入木瓜蛋白酶使其終濃度為1%，水浴3 h 酶解，經(jīng)過Sevag 法反復(fù)處理3 次直至無明顯沉淀，取上清液得到純化的灰兜巴多糖.用苯酚-硫酸法測得多糖含量為28.02%.

采用DEAE-52 纖維素柱層析(1.5 cm×40 cm)進一步純化，上樣濃度為10 mg/mL，上樣體積5 mL，依次用Tris-HCl 平衡緩沖液、0.1～0.3 mol/L NaCl 溶液進行洗脫，用恒流泵控制流速為1.0 mL/min，每10 min 收集一管.用苯酚-硫酸法跟蹤檢測各管多糖的含量，收集各洗脫組分，濃縮，透析(24 h)，冷凍干燥后得灰兜巴多糖各組分，并依次記為HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4.

1.2.2 灰兜巴多糖組分的體外抗氧化活性[9-11]

1.2.2.1 O2-·自由基清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法，取50 mmol/L（pH 8.2）Tris-HCl 緩沖液4.5 mL，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入1 mL 不同濃度樣品溶液（0.2～1.0 mg/mL）和0.4 mL 25 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，加入1.0 mL 8 mol/L HCl 終止反應(yīng)，以Tris-HCl 緩沖液（pH 8.2）為參比，在299 nm 處測吸光度，計算清除率.空白對照組以1 mL 蒸餾水代替樣品溶液，陽性對照以相同濃度的抗壞血酸代替樣品溶液.

1.2.2.2 DPPH 自由基清除能力的測定

分別取1 mL 不同濃度樣品溶液（0.2～1.0 mg/mL）和2 mL DPPH-乙醇溶液加入試管中，加入1 mL 無水乙醇使反應(yīng)總體積達到4 mL，搖勻后25 ℃水浴反應(yīng)30 min，以無水乙醇為參比，在517 nm 波長下測吸光度.空白對照組以蒸餾水代替樣品溶液，對照組以無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，陽性對照以相同濃度的抗壞血酸代替樣品溶液.

1.2.2.3 ·OH 清除能力的測定

樣品組試管中加入l mL 的0.15 mmol/L FeSO4，0.4 mL 的2 mmol/L 水楊酸，0.2 mL 不同濃度（0.2～1.0 mg/mL）的樣品溶液，再加入1 mL 的6 mmol/L H2O2和0.4 mL 蒸餾水.空白組用蒸餾水代替樣品溶液，對照組用蒸餾水代替水楊酸，以上3組試管放入水浴鍋中37 ℃恒溫1 h 后，取出冷卻，以蒸餾水為參比，在510 nm 波長下測吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 灰兜巴多糖的DEAE-52 洗脫曲線

經(jīng)過木瓜蛋白酶-Sevag 法脫蛋白的灰兜巴多糖，通過DEAE-52 纖維素離子交換柱進行層析，分別用緩沖液、0.1～0.3 mol/L NaCl 溶液進行洗脫后，根據(jù)峰值得到4 組多糖組分，洗脫曲線見圖1.多糖組分HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4 的回收率分別為20.85%、29.63%、23.25%和12.49%，總的回收率為86.22%，HDB-1、HDB-2、HDB-3 和HDB-4 經(jīng)紫外光譜掃描，在260 nm 及280 nm 處均無紫外吸收，可認(rèn)為它們是不含蛋白質(zhì)和核酸等雜質(zhì)的較純的樣品[12].

2.2 灰兜巴多糖及各組分DPPH 自由基清除能力

圖2 是灰兜巴多糖及各組分的DPPH 自由基清除率，可以看出，在所研究的濃度范圍之內(nèi)，灰兜巴多糖及各組分的DPPH 自由基清除率均隨著濃度的增加而增加，其中HDB-4 組分的清除能力最強.而其他3 個組分的DPPH 自由基清除率均低于灰兜巴粗多糖，其中HDB-2 組分的DPPH 自由基清除率最低.

圖1 灰兜巴多糖的DEAE-52 洗脫曲線

圖2 灰兜巴多糖及各組分的DPPH 自由基清除率

2.3 灰兜巴多糖及各組分·OH 自由基清除能力

圖3 是灰兜巴多糖及各組分的·OH 自由基清除率，可以看出，在所研究的濃度范圍之內(nèi)，灰兜巴多糖及各組分的·OH 自由基清除率均隨著濃度的增加而增加，其中HDB-3 和HDB-4 組分的清除能力較強.HDB-1 組分與灰兜巴粗多糖的·OH 自由基清除能力相當(dāng)，其中HDB-2 組分的·OH 自由基清除率最低.

圖3 灰兜巴多糖及各組分的·OH 自由基清除率

2.4 灰兜巴多糖及各組分超氧陰離子清除能力

圖4 是灰兜巴多糖及各組分的超氧陰離子清除率，可以看出，在所研究的濃度范圍之內(nèi)，灰兜巴多糖及各組分的超氧陰離子清除率均隨著濃度的增加而增加，其中HDB-3 組分的清除能力最強.灰兜巴粗多糖的超氧陰離子清除能力較低.

圖4 灰兜巴多糖及各組分的超氧陰離子清除率

3 結(jié)論

經(jīng)過木瓜蛋白酶-Sevag 法脫蛋白的灰兜巴多糖，通過DEAE-52 纖維素離子交換柱進行層析，得到了4 種較純組分.各組分的活性研究表明，HDB-4 組分的DPPH 自由基清除能力最強，HDB-2 組分的清除率最低；HDB-3 和HDB-4 組分的羥基自由基清除能力較強，HDB-2 組分的清除率最低；HDB-3 組分的超氧陰離子清除能力最強，灰兜巴粗多糖的清除能力較低.各組分的抗氧化活性側(cè)重點有所不同，其機理目前還不清楚，可能要結(jié)合各組分的分子結(jié)構(gòu)等信息才能作出解釋.

［1］Orivastava R，Kulshershtha D K.Bioactive polysaccharides from plants［J］.Phytochemistry，1989，28（11）:2877-2883.

［2］Marx J L.Oxygen free radicals linked to many diseases［J］.Science，1987，235:529-531.

［3］李知敏，彭亮.灰兜巴體外抑制α-葡萄糖苷酶的活性研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（6）:1379-1380.

［4］趙敏，宋靜靜，王貞佐，等.復(fù)方灰兜巴預(yù)防及治療糖尿病的實驗研究［J］.食品與藥品，2011，13（7）:254-257.

［5］孟凡欣，王立英，宋靜靜，等.灰兜巴多糖對糖尿病降糖作用的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23（6）:1557-1558.

［6］陳燕忠，符美燕，謝清春，等.灰兜巴粗多糖的提取及含量測定［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（6）:79-82.

［7］張巖，馬麗娜，王鵬，等.苦豆子多糖脫蛋白工藝比較［J］.中國新藥雜志，2012，21（8）:921-925.

［8］夏新奎，楊海霞，李純，等.薤白多糖的分離純化及組成分析［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（1）:244-247.

［9］劉春紅，馬宇，何忠梅，等.平貝母多糖的分離純化及抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2011，32（21）:29-33.

［10］孔凡利.荔枝果肉多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性研究［D］.廣州：華南理工大學(xué)，2010.

［11］鮑素華.鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性的研究［D］.合肥：合肥工業(yè)大學(xué)，2009.

［12］鄧曉婷，鐘南京，李冰，等.灰兜巴的提取分離純化研究［J］.食品科技，2014，已接收.