呂立國白遵光**張 嫻吳巧玲陳志強(qiáng)王昭輝代睿欣王樹聲

1. 廣東省中醫(yī)院泌尿外科（廣州 510120）; 2. 廣東省中醫(yī)院中心實驗室; 3. 廣東省中醫(yī)院腫瘤科

蜂毒肽對前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的影響*

呂立國1白遵光1**張 嫻2吳巧玲3陳志強(qiáng)1王昭輝1代睿欣1王樹聲1

1. 廣東省中醫(yī)院泌尿外科（廣州 510120）; 2. 廣東省中醫(yī)院中心實驗室; 3. 廣東省中醫(yī)院腫瘤科

目的研究蜂毒肽（Melittin）對人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。方法實驗設(shè)立空白對照組和蜂毒肽不同濃度組，用MTT方法檢測細(xì)胞增殖，Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡，RT-PCR檢測p27、p53 mRNA表達(dá)，Western blot檢測蛋白表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，蜂毒肽作用24、48、72 h后，4、8、16、32μg/mL組MTT檢測OD值明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯增高（P＜0.05），作用48h后，p27、p53 mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05），p53和 Caspase3蛋白含量增高。結(jié)論 蜂毒肽對PC-3細(xì)胞有凋亡誘導(dǎo)作用，其作用機(jī)制可能與增高p27、p53、Caspase3表達(dá)相關(guān)。

蜂毒肽; 前列腺腫瘤; 細(xì)胞系, 腫瘤; 細(xì)胞凋亡

目前在世界范圍內(nèi)前列腺癌發(fā)病率正居男性惡性腫瘤的第二位[1]，在美國，發(fā)病率占男性惡性腫瘤的第一位。確診時多為晚期。內(nèi)分泌治療是晚期前列腺癌的主要治療方法，但經(jīng)過中位時間14～30個月后，幾乎都會發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC），中位生存期短。如何延緩?fù)砥谇傲邢侔┻M(jìn)展為CRPC、如何延長CRPC生存期，是世界范圍內(nèi)的治療難點。中醫(yī)藥治療CRPC逐漸成為研究的熱點。本研究擬結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，探討蜂毒肽對PC-3細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為CRPC的治療提供思路。

材料和方法

一、試驗藥物

蜂毒肽,購于美國Sigma公司, 純度91.8%，批號：060M4079V。用培養(yǎng)基稀釋至終濃度為：1、2、4、8、16、32μg/mL。

二、細(xì)胞

前列腺癌PC-3細(xì)胞，購于中山大學(xué)實驗動物中心細(xì)胞實驗室。

三、試劑

四氮甲基唑藍(lán)（MTT），美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液，美國Hyclone公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒,RNA提取試劑Trizol，美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，Takara公司。 所用化學(xué)試劑均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠。

四、儀器

酶標(biāo)儀(美國Perkin Elmer公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司，F(xiàn)C500），7500實時熒光定量基因擴(kuò)增系統(tǒng)（美國ABI公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

五、方法

前列腺癌PC-3細(xì)胞用含5%FBS的DMEM，37℃，5% CO2，飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。實驗設(shè)蜂毒肽1、2、4、8、16、32μg/ mL組和空白對照組，作用時間為24，48，72h。各實驗均重復(fù)3次。

（一）MTT實驗

細(xì)胞消化后計數(shù)，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，設(shè)5個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后加入作用藥物，培養(yǎng)24，48，72h后加入5%MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，后吸去上清，每孔加入100μL DMSO溶液，室溫振蕩溶解10min后，酶標(biāo)儀檢測570nm波長的OD值。細(xì)胞增殖抑制率=（對照組OD值-藥物組OD值）/對照組OD值×100%。

（二）Hoechst 33258染色檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞接種于6孔板中，按上述各組處理進(jìn)行培養(yǎng)。作用完成后，加入Hoechst 33258染液按照說明進(jìn)行細(xì)胞染色，用倒置熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡率。

（三）RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)

細(xì)胞分組處理后，收集細(xì)胞用Trizol提取總RNA，測定濃度后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR Green染料法熒光定量PCR（Real Time PCR）檢測，并用內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行校正分析p53 mRNA表達(dá)含量。引物序列如下：p53基因前向引物： 5’-ATGT GCTGTGACTGCTTGTAGATG-3’，逆向引物：5’-TCAACAAGATGTTTTGCCAACT-3’；GAPDH前向引物：5’-TCTTTTGCGTCGCCAGCC GA-3’，逆向引物：5’-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTG ACCA-3’； p27kip前向引物：5’- AGTGTCTAAC GGGAGCCCTA -3’，逆向引物：5’- CCGGGTT AACTCTTCGTGGT-3。

六、統(tǒng)計分析方法

結(jié) 果

一、MTT檢測結(jié)果

與對照組比較，蜂毒肽在4、8、16、32μg/mL濃度作用后，OD570nm明顯降低，提示蜂毒肽能抑制PC-3細(xì)胞增殖或能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中濃度8、16、32μg/mL組之間作用效果無明顯差異，故后續(xù)選用1、4、8μg/mL作為實驗濃度（見圖1）。

圖1 蜂毒肽對PC-3細(xì)胞增殖影響

二、Hoechst染色結(jié)果

蜂毒肽能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在作用48h后，與對照組比較，1μg/mL組無明顯凋亡，4μg/mL組細(xì)胞凋亡率明顯升高，濃度8μg/mL時，細(xì)胞凋亡率＞70%，（見圖2）。

三、RT-PCR實驗結(jié)果

發(fā)現(xiàn)蜂毒肽作用后，PC-3細(xì)胞p53和p27蛋白的相對表達(dá)量明顯增加（見圖3）。

四、 Western blot 實驗

在蜂毒肽作48h后， 1μg/mL、4μg/mL、8μg/ mL組細(xì)胞p53表達(dá)均增高， 4μg/mL、8μg/mL 組Procaspase3活化剪切增多，Caspase3含量增高，凋亡增加（見圖4）。

圖2 蜂毒肽對PC-3細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Mel誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞p27、p53 mRNA表達(dá)

圖4 蜂毒肽對PC-3細(xì)胞p53、Caspase蛋白表達(dá)的影響

討 論

蜂針療法是中醫(yī)傳統(tǒng)療法，具有抗腫瘤的作用，初步臨床研究顯示，蜂針療法在控制前列腺癌進(jìn)展方面有潛在的作用。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，具有多種抗腫瘤作用[2]，實驗研究證實，蜂毒肽對前列腺癌細(xì)胞具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用，并揭示了部分可能的作用機(jī)制[3,4]。目前研究已經(jīng)明確的前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控機(jī)制很多，包括Bcl-2/bax失衡[5]、P53蛋白過表達(dá)[6]、凋亡抑制基因Survivin過表達(dá)[7,8]、Caspase通路[9,10]等。為進(jìn)一步明確蜂毒肽對前列腺癌細(xì)胞的作用及機(jī)制，我們進(jìn)行了上述實驗。

實驗結(jié)果證實，與對照組比較，作用24、48、72 h后，蜂毒肽對PC-3細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用，在濃度4、8、16、32μg/mL作用48 h后，PC-3細(xì)胞凋亡和死亡細(xì)胞數(shù)量均明顯增多，表明蜂毒肽對前列腺癌PC-3細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽處理后的PC-3細(xì)胞p27、p53 mRNA的表達(dá)量明顯升高，推測p27、p53調(diào)控是其凋亡誘導(dǎo)作用途徑之一。

p27是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控因子，被認(rèn)為是抑癌基因。在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，p27通過抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶的活性負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制細(xì)胞增殖。也有研究發(fā)現(xiàn)p27參與細(xì)胞分化調(diào)控，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。由此推測，蜂毒肽可以通過調(diào)控p27表達(dá)誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡。

p53是一種抑癌基因，能夠通過多種機(jī)制阻止腫瘤發(fā)展它也是一種轉(zhuǎn)錄因子，一種生長抑制性蛋白，在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究[12]證實，p53蛋白可誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，PC-3細(xì)胞存在依賴p53的凋亡途徑。本實驗發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽處理后p53表達(dá)明顯升高，由此推測，通過調(diào)控p53表達(dá)誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡，是蜂毒肽誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的作用途徑之一。p53可以激活導(dǎo)致Procaspase3 的剪切生成有活性的Caspase3。

Caspases是在細(xì)胞凋亡中起重要作用的同源蛋白，是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，對細(xì)胞凋亡起著重要作用。其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中激活的關(guān)鍵激酶，也是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)因子，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分。Caspase-3蛋白與進(jìn)展性前列腺癌細(xì)胞的耐凋亡特征、惡性程度和復(fù)發(fā)性有關(guān)。Caspase-3的低陽性率與進(jìn)展性前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有密切聯(lián)系[13]。 Caspase-3活性下降，與激素非依賴性前列腺癌發(fā)生和進(jìn)展過程相關(guān)[14]。研究顯示，某些中藥提取物[15,16]可以通過上調(diào)Caspase-3表達(dá)，抑制PC-3細(xì)胞的增殖。本實驗顯示，蜂毒肽作用后Caspase-3含量增高，由此推測，Caspase-3通道也是蜂毒肽對PC-3細(xì)胞發(fā)揮凋亡誘導(dǎo)作用的途徑之一。

總之本實驗揭示了蜂毒肽對PC-3細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用及可能的機(jī)制，為蜂針療法進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，蜂毒肽對PC-3細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用是否存在其他途徑，如何在此基礎(chǔ)上開展結(jié)合蜂毒肽的前列腺癌生物治療，有待進(jìn)一步的深入研究。

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14 楊國勝, 陳昭典. 激素抵抗性前列腺癌細(xì)胞增殖凋亡及Caspase-3活性的觀察. 中國男科學(xué)雜志 2009; 23(9): 30-34

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（2014-07-23收稿）

Effects of Melittin on apoptosis of prostate cancer cell PC-3*

Lv Liguo1, Bai Zunguang1**, Zhang Xian2, Wu Qiaoling3, Chen Zhiqiang1, Wang Zhaohui1, Dai Ruixin1, Wang Shushing11. Department of Urology, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120,
Guangdong, China; 2.Central Laboratory, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine;
3. Department of Oncology, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine

Bai Zunguang, E-mail: zunguangbai@163.com

ObjectiveTo study the effects of Melittin (Mel) on apoptosis of prostate cancer cell PC-3 and explore its potential mechanism.MethodsBlank control Group and Mel groups of different concentrations were set up in this study. Cell proliferation was analyzed by MTT assay. Cell apoptosis was measured by Hoechst 33258 dying method. The expressions of p27and p53were detected by RT-qPCR, and their protein expressions were detected by Western blot.ResultsCompared with those of the controls, cell proliferation (OD value) decreased and apoptosis increased signif cantly in Mel groups of 4, 8, 16, 32μg/mL after 24, 48 and 72 h treatment. After 48h treatment, the expressions of p27 andp53 mRNA were increased signif cantly, and protein expression of p53 and caspase3 were also increased.ConclusionMel may induce PC-3 cell apoptosisby upregulation of p27, p53 and caspase3 expression.

melitten; prostatic neoplasms; cell line, tumor; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.003

R 737.25

資助: 廣東省科技計劃項目（2012B061700035）
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, E-mail: zunguangbai@163.com