申樹林梁季鴻**朱春暉張 迅劉 寧

陸慶華1劉德銘2唐石伏2楊文濤3李群生3

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性科（南寧 530021）;

2. 廣西柳州市中醫(yī)院; 3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院

免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜法篩選和鑒定TS-CBP86-IV相互作用蛋白*

申樹林1梁季鴻1**朱春暉1張 迅1劉 寧1

陸慶華1劉德銘2唐石伏2楊文濤3李群生3

1. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性科（南寧 530021）;

2. 廣西柳州市中醫(yī)院; 3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院

目的利用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析方法，分別從人精子總蛋白和重組BL21細(xì)胞總蛋白中篩選和鑒定與TS-CBP86-IV相互作用的蛋白質(zhì)。方法用克隆技術(shù)得到TS-CBP86-IV cDNA編碼基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)純化重組蛋白；另外收集人精子細(xì)胞，提取總蛋白，用特異抗體通過免疫共沉淀法分離出TS-CBP86-IV蛋白復(fù)合體，再用質(zhì)譜鑒定可能與其相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果利用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析篩選到16個(gè)與TS-CBP86相互作用的候選蛋白質(zhì)，數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)部分蛋白具有相同功能注釋，參與精子運(yùn)動(dòng)調(diào)控。結(jié)論 免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析方法成功篩選和鑒定出TS-CBP86-IV相互作用蛋白質(zhì), 為進(jìn)一步研究TS-CBP86-IV的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

睪丸特異性鈣結(jié)合蛋白; 免疫沉淀法; 質(zhì)譜分析法; 蛋白質(zhì)相互作用

睪丸特異性鈣結(jié)合蛋白CBP86-IV（Testis-specif c calcium-binding protein，TS-CBP86-IV）是我們研究弱精子癥精子差異表達(dá)蛋白組所鑒定出的蛋白質(zhì)之一。前期的研究采用基因克隆、原核表達(dá)和免疫學(xué)方法成功制備了TS-CBP86-IV多克隆抗體，并運(yùn)用該抗體對(duì)人精子細(xì)胞TS-CBP86-IV表達(dá)量進(jìn)行了檢測[1]，取得了階段性成果。

本文采用免疫共沉淀技術(shù)（Co-Immunoprecipitation, Co-IP），以TS-CBP86-IV蛋白特異性抗體為誘餌，分別在人精子蛋白和重組原核表達(dá)TS-CBP86-IV蛋白的大腸桿菌總蛋白中進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，釣取TSCBP86-IV蛋白復(fù)合體，然后使用高分辨率質(zhì)譜技術(shù)鑒定出可能與之相互作用的蛋白，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、主要試劑

Percoll 購自索萊寶生物有限公司, TS-CBP86-IV抗體由Invitrogen公司制備和純化；非變性蛋白裂解液購自碧云天生物科技有限公司；免疫共沉淀試劑盒購自Life公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。人精子標(biāo)本來自我院男性科門診患者。

二、精液標(biāo)本的收集和制備

精液標(biāo)本檢驗(yàn)依據(jù)WHO（第五版）人類精液和精子宮頸粘液相互作用檢查實(shí)驗(yàn)室手冊規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)[2]。收集正常精液標(biāo)本30份，待精液液化后用60% Percoll單層（800×g，20 min）離心, 去除精漿及圓形細(xì)胞, 然后用PBS緩沖液（pH 7.4）洗滌兩次后計(jì)數(shù)，棄掉上清后，細(xì)胞沉淀凍存于-80℃冰箱備用。

三、精子非變性總蛋白提取

使用碧云天生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液（使用前加入終濃度1 mM PMSF）提取精子總蛋白。從-80℃冰箱中取出細(xì)胞樣品, 按照1:10（m/v）的比例加入細(xì)胞裂解液, 上下顛倒混勻，室溫放置10min,充分裂解；10 000×g離心5 min，取上清，即為非變性精子總蛋白。

四、大腸桿菌非變性總蛋白提取

按照之前報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法和條件[1]，在大腸桿菌BL21菌株中中誘導(dǎo)表達(dá)TS-CBP86-IV重組蛋白，并使用Western及IP細(xì)胞裂解液提取非變性總蛋白樣品。

五、TS-CBP86-IV蛋白復(fù)合體免疫共沉淀

使用Novex Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein A（Life Technologies）試劑盒進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。取50μL磁珠于1.5 mL EP管中，磁力架吸附，棄上清待用。取10μg CBP86-IV抗體加入200μL漂洗緩沖液，輕輕混勻后加入處理好的磁珠中，振蕩混勻處理10 min，磁力架吸附去上清；再加入200μL Ab Binding＆Washing Buffer重懸磁珠并進(jìn)行清洗。200μL抗體結(jié)合緩沖液（500 mmol Na3PO4，5 mol NaCl）重懸磁珠，并加入250μl 5 mM BS3（Bis suberate）溶液，室溫放置30 min，不斷混勻；加入12.5μL終止緩沖液（1M Tris，pH7.5），室溫放置15 min，磁力架吸附去上清，漂洗緩沖液清洗3次。

將非變性精子總蛋白和大腸桿菌總蛋白分別加入處理好的磁珠中，室溫輕柔混勻10min，磁力架吸附，棄上清，200μL漂洗緩沖液清洗3次，加入20μL洗脫緩沖液混勻，常溫放置2 min，磁力架吸附，取上清置于清潔的EP管中，即為免疫共沉淀產(chǎn)物，-20℃保存或繼續(xù)質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)。

六、TS-CBP86-IV蛋白復(fù)合體質(zhì)譜鑒定

免疫共沉淀產(chǎn)物超濾離心置換buffer后，使用胰蛋白酶進(jìn)行酶解消化，37℃酶解過夜后，ZipTip微量層析柱（Millipore）脫鹽處理，Easy-nLC 1000 nanof ow（Thermo Scientif c）毛細(xì)管液相分離后，使用LTQ-Orbitrap Elite（Thermo Scientif c）組合式質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，液質(zhì)聯(lián)用程序?yàn)橄到y(tǒng)預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)程序，根據(jù)儀器實(shí)際運(yùn)行情況進(jìn)行微調(diào)。質(zhì)譜結(jié)果使用Proteome Discoverer 1.3（Thermo Fisher Scientif c）軟件與Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得與CBP86-IV可能存在相互作用關(guān)系的蛋白質(zhì)信息。

結(jié) 果

一、大腸桿菌非變性總蛋白免疫共沉淀鑒定結(jié)果

將從大腸桿菌總蛋白中獲得的蛋白復(fù)合體進(jìn)行酶解和質(zhì)譜鑒定，共有13個(gè)蛋白質(zhì)得到有效鑒定，其中包括TS-CBP86-IV重組表達(dá)蛋白（蛋白編號(hào)O75952），具體的鑒定結(jié)果，見表1。

二、人精子非變性總蛋白免疫共沉淀鑒定結(jié)果

將從人精子總蛋白中獲得的蛋白復(fù)合體進(jìn)行酶解和質(zhì)譜鑒定，共有3個(gè)蛋白質(zhì)得到有效鑒定，具體的鑒定結(jié)果，見表2。

討 論

相關(guān)研究報(bào)道[3]和我們的前期實(shí)驗(yàn)[1]均發(fā)現(xiàn)：TSCBP86-IV可能與精子的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，但具體的作用機(jī)制仍然不清楚。近年來，從蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（即蛋白質(zhì)復(fù)合體）中研究某種蛋白質(zhì)功能成為新熱點(diǎn)，與之相應(yīng)的技術(shù)方法也日趨成熟，如免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化技術(shù)、高分辨率質(zhì)譜術(shù)等為相互蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化和鑒定提供了有力工具[4-6]。

表1 大腸桿菌非變性重組TS-CBP86-IV蛋白復(fù)合體所鑒定的蛋白

表2 人精子總蛋白中TS-CBP86-IV復(fù)合體所鑒定的蛋白質(zhì)

根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道[7]，免疫共沉淀方法主要用于潛在相互作用蛋白的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即首先確定可能與目的蛋白存在相互作用的蛋白質(zhì)，通過原核表達(dá)、蛋白純化等方法，獲得高純度和質(zhì)量的該蛋白天然表達(dá)形式，然后通過免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合非變性蛋白質(zhì)電泳或SDS-PAGE確定目的蛋白與該蛋白之間的相互作用關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)則是使用免疫共沉淀技術(shù)從總蛋白中直接釣取可能的相互作用蛋白，該研究方法在以前應(yīng)用的并不多，究其原因，主要是由于總蛋白樣品中蛋白數(shù)量巨大，可能會(huì)有假陽性或非特異性吸附的蛋白質(zhì)存在；同時(shí)總蛋白提取中，樣品雜質(zhì)極有可能干擾免疫共沉淀的過程，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失??；而候選的相互作用蛋白也有可能由于表達(dá)量過低或存在修飾加工形式，增加后續(xù)質(zhì)譜鑒定的難度。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用了可靠的提取方法，獲得質(zhì)量較高的非變性精子總蛋白樣品，同時(shí)高效價(jià)和特異性的多克隆抗體也最大程度上降低了假陽性鑒定結(jié)果的出現(xiàn)，進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)的成功率。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析方法分別從人精子細(xì)胞和重組原核表達(dá)細(xì)胞中鑒定3種和13種蛋白。其中在兩種細(xì)胞總蛋白中均鑒定到了血清蛋白的存在，這也是由于多克隆抗體的制備是在動(dòng)物體內(nèi)完成的，從血清中純化抗體。雖然免疫共沉淀過程中使用BS3對(duì)抗體進(jìn)行固定，也不可避免有一部分抗體被洗脫和鑒定出來，屬于正常的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而在原核表達(dá)總蛋白中進(jìn)一步鑒定到了重組TS-CBP86-IV蛋白，說明我們制備的抗體能夠特異性吸附目的重組蛋白，這也是免疫共沉淀能夠成功進(jìn)行的關(guān)鍵，只有特異的吸附到目的重組蛋白才有可能鑒定到與之相互作用的蛋白質(zhì)。由于重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)量豐富，更容易在后續(xù)的質(zhì)譜鑒定中獲得可靠鑒定，同時(shí)使用異源總蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)獲得一些與TSCBP86-IV相互作用的異源蛋白質(zhì)信息，這些蛋白也有可能在后續(xù)的研究中提供TS-CBP86-IV與其他蛋白相互作用的識(shí)別位點(diǎn)和構(gòu)型信息，而進(jìn)一步解釋蛋白相互作用的具體機(jī)制。而在人精子細(xì)胞中，CBP86-IV表達(dá)量有限，獲得的信息相對(duì)有限，但由于是在目的蛋白執(zhí)行功能的細(xì)胞總蛋白中進(jìn)行篩選，更有可能得到重要的相互作用蛋白信息。

本實(shí)驗(yàn)所鑒定的可能與TS-CBP86-IV有相互作用的候選蛋白，目前還未見有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，還需要進(jìn)一步通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。而本實(shí)驗(yàn)采取的方法和策略、以及獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究TS-CBP86-IV的功能奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究精子蛋白復(fù)合體和相互作用關(guān)系提供了新的思路。

1 申樹林, 梁季鴻, 朱春暉, 等. 睪丸特異性鈣結(jié)合蛋白CBP86-IV表達(dá)水平變化及抗體制備. 中國男科學(xué)雜志2013; 27(10): 61-62, 66

2 陳振文, 谷龍杰. 精液分析標(biāo)準(zhǔn)化和精液質(zhì)量評(píng)估-WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》(第5版)出版. 中國計(jì)劃生育學(xué)雜志2012; 20(l): 58-62

3 Naaby-Hansen S, Mandal A, Wolkowicz MJ,et al. (2002) CABYR, a novel calcium-binding tyrosine phosphorylationregulated f brous sheath protein involved in capacitation.Dev Biol2002; 242(2): 236-254

4 江月, 叢浩龍, 王健, 等. 串聯(lián)親和純化技術(shù)篩選腸病毒71 型3D 聚合酶的相互作用蛋白. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)2012; 34(6): 526-529

5 王成, 趙曉蒙, 帥勇, 等. 免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析篩選HMGB4 相互作用蛋白. 湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)2012; 35(2): 71-75

6 孫婷婷, 宋麗娜, 于淼, 等. 免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜對(duì)肝細(xì)胞核因子3β蛋白復(fù)合體的分離鑒定. 生物技術(shù)通訊2011; 22(5): 662-666

7 涂占晗, 林旭. 蛋白質(zhì)相互作用研究的常用方法進(jìn)展及比較. 中國當(dāng)代醫(yī) 2012; 19(14): 18-20

8 范翠英, 馮利興, 樊金玲, 等. 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展. 生物技術(shù) 2012; 22(2): 76-80

（2014-08-14收稿）

Screening and identification of TS-CBP86-IV interacting proteins using co-immunoprecipitation combining with mass spectrometry*

Shen Shulin1, Liang Jihong1**, Zhu Chunhui1, Zhang Xun1, Liu Ning1, Lu Qinghua1, Liu Deming2,Tang Shifu2, Yang Wentao3, Li Qunsheng3
1. Department of Andrology, the First Aff lated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China; 2. Liuzhou Hospital of Trational Chinese Medicine; 3. The Ruikang Hospital of Guangxi University of Trational
Chinese Medicine

Liang Jihong, Email: jihongliang@126.com

ObjectiveTo screen and identify interactional proteins with TS-CBP86-IV from total protein of human sperm and Escherichia coli BL21 using co-immunoprecipitation and mass spectrometry.MethodsCoding gene of TSCBP86-IV was cloned and inserted into prokaryotic expression vector, then the recombinant vector was transducted into Escherichia coli for its expression and purif cation; Human sperm cells were collected and their total protein was extracted. TS-CBP86-IV protein complex was separated by co-immunoprecipitation and the isolated protein was identif ed by mass spectrometry.ResultsA total of 16 proteins were identif ed by co-immunaprecipitaion combining with mass spectrometry. Several proteins identif ed were associated withregulation of sperm motility.ConclusionInteractional proteins with TSCBP86-IV were successfully identif ed by co-immuniprecipitation and mass spectrometry,which establish a solid base for future study of TS-CBP86-IV function.

Testis-specific calcium-binding protein; immuniprecipitation; mass spectrometry; protein interaction

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.002

R 446.121.3

資助: 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào): 81260123); 廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào): 2012GXNSFAA053168)
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, Email: jihongliang@126.com