韓 銘，鄧子輝，薛 輝，李永明，顏光濤

解放軍總醫(yī)院 基礎(chǔ)所生化室，北京 100853

基礎(chǔ)研究

瘦素減輕6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷

韓 銘，鄧子輝，薛 輝，李永明，顏光濤

解放軍總醫(yī)院 基礎(chǔ)所生化室，北京 100853

目的探討瘦素對6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)所誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)凋亡的抑制作用。方法建立6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，用瘦素進(jìn)行干預(yù)，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測細(xì)胞活性，LDH法檢測細(xì)胞損傷，臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞死亡率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，并用免疫熒光檢測active caspase-3的熒光強度，Western blot檢測Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。結(jié)果成功建立了6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型。在模型的基礎(chǔ)上，瘦素干預(yù)后，細(xì)胞凋亡率降低約15%，細(xì)胞存活率提高約14%，細(xì)胞損傷降低率和死亡率，active caspase-3的濃度下降，Bcl-2/Bax的比值顯著提高(P＜0.05)。結(jié)論瘦素對6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有一定的抑制作用，這對瘦素可能參與帕金森病的保護(hù)作用提供了證據(jù)。

6-羥基多巴胺；SH-SY5Y細(xì)胞；細(xì)胞損傷；瘦素

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病人數(shù)僅次于阿爾茨海默病，55歲以上老年人發(fā)病率在1% ～ 2%。PD的主要發(fā)病原因是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性死亡、丟失，導(dǎo)致多巴胺(dopamine，DA)水平下降。因此，保護(hù)神經(jīng)元是目前眾多研究的重點[1-3]。瘦素(leptin)是由定位于染色體7q31的肥胖基因(obese gene，OB)編碼的一種蛋白類激素。帕金森患者血液中瘦素的濃度較低，多半患者都伴有體質(zhì)量減輕現(xiàn)象。國外有研究提示瘦素在阿爾茨海默病、腦缺血、癲癇等神經(jīng)疾病中發(fā)揮保護(hù)作用[4-9]。SH-SY5Y細(xì)胞系是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，具有許多多巴胺能神經(jīng)元的特點，包括合成多巴胺和去甲腎上腺素和表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運蛋白(dopamine transporter，DAT)。DAT通過特定的攝取和封存多巴胺的方式調(diào)節(jié)多巴胺的動態(tài)平衡，是近年來被用作PD研究的神經(jīng)元模型[2]。6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)通過自身及產(chǎn)生的氧自由基對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，引起神經(jīng)元的退行性變[10]。因此6-OHDA通常作為誘導(dǎo)帕金森模型的神經(jīng)毒素。但瘦素對于帕金森病的保護(hù)作用研究不多，本實驗擬在建立6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞PD模型的基礎(chǔ)上，觀察瘦素對該細(xì)胞損傷模型的保護(hù)。

材料和方法

1 材料 人神經(jīng)纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y (本實驗室保藏)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibico公司)；MTT、臺盼藍(lán)(sigma公司)；LDH試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(凱基公司)；人重組瘦素(peprotech公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris堿)(北京益利精細(xì)化學(xué)品公司)；Western blot超敏發(fā)光液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)公司)；一抗：active caspase-3和Bcl-2抗體(Cell signaling technology公司)，β-actin(Santa Cruz公司)，Bax(Epitomics公司)；二抗：山羊抗兔IgG/cy3標(biāo)記(武漢博士德生物工程公司)，山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶(北京中杉金橋公司)。

2 MTT檢測6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率 將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞(6×104/ml) 200 μl接種于96孔板，每組設(shè)12個平行孔，培養(yǎng)24 h后，加入6-OHDA，使終濃度達(dá)到0、25、50、100、200 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，其中濃度為0的為對照組，另設(shè)空白對照組繼續(xù)孵育24 h (6-OHDA用0.1% Vit c溶解，Vit c終濃度為0.002%，下同)。然后每孔加入20 μl MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μl DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)直至紫色化合物全部溶解，振蕩器上振蕩10 min后，酶標(biāo)儀570 nm，對比波長650 nm，測定吸光值，存活率均相對于空白對照組，之后的實驗，除MTT的相關(guān)實驗，其他均只設(shè)對照組。

3 LDH法檢測6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的損傷 將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞以2×105個/孔(1ml)種于24孔板中，設(shè)4個平行孔，處理同方法2。然后取細(xì)胞培養(yǎng)液，按照試劑盒要求處理，酶標(biāo)儀450 nm，測定吸光值，相對值均與對照組相比。

4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞豐度達(dá)到60%，倒掉原有培養(yǎng)基，然后加入含有6-OHDA(100 μmol/L)含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h，建立模型。在6-OHDA誘導(dǎo)前2 h加入濃度為2 μg/ml瘦素對SH-SY5Y進(jìn)行預(yù)保護(hù)。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×106個/孔種于6孔板中，待瘦素預(yù)處理和模型建立之后，置于倒置顯微鏡下觀察，100×倍數(shù)下拍照。

4.1 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率 待瘦素預(yù)處理和模型建立之后，采用MTT法檢測其存活率變化，方法同2。

4.2 LDH法檢測SH-SY5Y細(xì)胞損傷 待瘦素預(yù)處理和模型建立之后，采用LDH法檢測其損傷變化，方法同3。

5 臺盼藍(lán)法檢測細(xì)胞死亡率 以2×105個/孔將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞種于24孔板中，設(shè)8個平行孔，待瘦素預(yù)處理和模型建立之后，消化并制備單細(xì)胞懸液，適當(dāng)稀釋后，將細(xì)胞懸液與0.4%臺盼藍(lán)溶液以9∶1混合混勻(終濃度0.04%)。在3 min內(nèi)，分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。細(xì)胞死亡率=死活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率 將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以5×105個/孔種于6孔板中，設(shè)3個平行孔，待瘦素預(yù)處理和模型建立之后，參照凱基公司的細(xì)胞凋亡檢測試劑盒方法，測定早期凋亡率和晚期凋亡率，3次獨立實驗求平均值。

7 免疫熒光檢測凋亡分子active caspase-3 按照方法3分組，以2×105個/孔的密度接種SH-SY5Y細(xì)胞于Confocal專用小皿中，待瘦素預(yù)處理和模型建立之后，50%的羊血清封閉1 h，加入active caspase-3的一抗過夜，PBS洗3遍，每次5 min，然后加入cy3標(biāo)記的二抗孵育，PBS再洗3遍，每次5 min，置于熒光顯微鏡下觀察拍照，呈紅色熒光。

8 Western blot檢測Bcl-2和Bax 按照方法3分組，用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白上樣量為50 μg，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE上進(jìn)行垂直電泳，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(100 V，110 min)，5%脫脂奶粉(TBST溶解，下同)封閉1 h，然后一抗，Bcl-2(1∶1000)、Bax (1∶2 000)、β-actin(1∶500)。4℃封閉過夜，TBST漂洗膜3次，每次10 min，然后二抗(1∶4 000)，37℃孵育40 min，TBST漂洗3次，每次10 min，最后曝光顯影。掃描后，使用Image Plus 6.0軟件，分析其灰度值，3次獨立實驗求平均值。

9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Stata7.0軟件統(tǒng)計進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以-±s表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PD細(xì)胞模型的建立 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯示，6-OHDA誘導(dǎo)組在100 μmol/L、200 μmol/L存活率在50%以下，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(aP＜0.05)，見圖1A。LDH法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯示，6-OHDA誘導(dǎo)組在100 μmol/L、200 μmol/L損傷的相對活力明顯高于正常組(aP＜0.05)，見圖1B。因為200 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過于嚴(yán)重，PD細(xì)胞模型的建立采用100μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立。

圖 1 PD模型的建立(aP＜0.05， 與對照組比較)Fig. 1 Model of PD cells(aP＜0.05, vs control group)

2 瘦素對于PD模型細(xì)胞形態(tài)的影響 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(100×下觀察)，正常SH-SY5Y細(xì)胞在接種貼壁后呈梭形狀(圖2A)，100 μmol/L模型組細(xì)胞皺縮破損(圖2B)，在100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)之前加入2 μg/ml瘦素組(圖2C)，其細(xì)胞相對于不加瘦素組，狀態(tài)有所改善，皺縮的細(xì)胞減少。

圖 2 倒置顯微鏡下SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)(100×)A： 對照組； B： 6-OHDA組； C： 6-OHDA+瘦素組Fig. 2 Morphology of SH-SY5Y cells under inverted microscope(100×)A： Control group； B： 6-OHDA group； C：6-OHDA+leptingroup

3 瘦素減輕PD模型細(xì)胞損傷 MTT法檢測SHSY5Y細(xì)胞存活率，LDH法檢測SH-SY5Y損傷率，臺盼藍(lán)檢測SH-SY5Y死亡率，結(jié)果顯示，相對于100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)的模型組，2 μg/ml瘦素預(yù)處理SH-SY5Y的存活率提高了約14%(圖3A)，減輕了對細(xì)胞的損傷(圖3B)，死亡率降低了約13%(圖3C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖 3 瘦素減輕了PD模型的損傷(aP＜0.05，與對照組比較； bP＜0.05，與6-OHDA模型組比較)Fig. 3 Alleviated PD model damage after leptin treatment(aP＜0.05,vs control group; bP＜0.05, vs 6-OHDA group )

圖 4 瘦素降低了PD模型的凋亡(aP＜0.05，與對照組比較；bP＜0.05，與6-OHDA模型組比較)Fig. 4 Decreased apoptosis of PD model after leptin treatment(aP＜0.05, vs control group;bP＜0.05, vs 6-OHDA group )

圖 5 瘦素減弱了PD模型active caspase-3的激活A(yù)： 對照組； B： 6-OHDA組； C： 6-OHDA+瘦素組Fig. 5 Improved active caspa-se-3 activation in PD model afterleptin treatmentA： Control group； B： 6-OHDA group； C：6-OHDA+leptingroup

4 瘦素降低PD模型細(xì)胞的凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，相對于100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)的模型組，2 μg/ml瘦素預(yù)處理使早期凋亡率和晚期凋亡率都有所下降(圖4)，總凋亡率降低了約15%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(bP＜0.05)。

5 瘦素減弱了PD模型active caspase-3的激活 免疫熒光檢測，在模型建立之后，100 μmol/L 6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的模型組熒光強度強(圖5B)，正常組active caspase-3的熒光強度較弱(圖5A)，而瘦素預(yù)處理后，熒光減弱(圖5C)，從凋亡蛋白的角度進(jìn)一步證明了瘦素減輕了6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y的損傷。

6 瘦素預(yù)處理后Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)變化 Western blot結(jié)果顯示，6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的模型組Bcl-2/Bax相對于正常組顯著降低，瘦素預(yù)處理后，Bcl-2/Bax相對于模型組顯著升高(P＜0.05)，見圖6。

圖 6 瘦素提高了PD模型Bcl-2/Bax的比值(aP＜0.05，與對照組比較；bP＜0.05， 與6-OHDA模型組比較)Fig. 6 Increased Bcl-2/Bax ratio in PD model after leptin treatment(aP＜0.05, vs control group;bP＜0.05, vs 6-OHDA group)

討 論

帕金森病是多巴胺能神經(jīng)元退行性病變導(dǎo)致的疾病，其發(fā)病與多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的減少有關(guān)，這些神經(jīng)元細(xì)胞位于與控制運動相關(guān)的黑質(zhì)紋狀體內(nèi)。而瘦素是一種主要由脂肪組織分泌并釋放入血的多肽類激素，其可通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)體質(zhì)量和能量平衡。近年來隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明瘦素能夠促進(jìn)腦的發(fā)育和成熟，并且在腦損傷和神經(jīng)退行性病變過程中能夠?qū)ι窠?jīng)元細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡和保護(hù)作用，這些都突顯出瘦素在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域較好的應(yīng)用前景[11-12]。

先前已有研究證明瘦素缺陷性小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的多巴胺含量降低，導(dǎo)致神經(jīng)傳遞能力降低；肥胖者紋狀體中D2類型的多巴胺受體數(shù)量減少；另一方面較高體質(zhì)量指數(shù)往往與腦內(nèi)較低的瘦素生物學(xué)活性關(guān)聯(lián)，帕金森患者都伴有體質(zhì)量減輕和瘦素水平降低的現(xiàn)象。這些都提示了瘦素與帕金森疾病的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性[13-15]。

帕金森疾病自身發(fā)病的機(jī)制與凋亡密切相關(guān)，同時有研究顯示Bcl家族成員與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，是生理性或病理性神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵因子，而active caspase-3屬于凋亡分子，是由procaspase-3激活而成，它的增多預(yù)示著凋亡的發(fā)生?？沟蛲龅鞍譈cl-2可與促凋亡蛋白Bax拮抗，抑制細(xì)胞色素C自線粒體釋放至胞質(zhì)，阻止細(xì)胞色素C對Caspase蛋白酶(包括procaspase-3)的激活，從而抑制凋亡。Bcl-2和Bax比值(Bcl-2/Bax)能提示是否發(fā)生凋亡[16-17]。

本研究中，建立了6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y的PD模型，并在模型的基礎(chǔ)上從存活、凋亡、損傷、細(xì)胞形態(tài)以及凋亡分子的免疫熒光、Western blot等多個角度出發(fā)，外源性給予瘦素，降低了6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的損傷和凋亡，提高其存活率，細(xì)胞形態(tài)有了較大的改善，凋亡分子active caspase-3的熒光強度也有了相應(yīng)減弱，Bcl-2/Bax的比值顯著提高，證明了瘦素具有減輕6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的損傷的功能。其機(jī)制可能是瘦素通過升高Bcl-2/Bax的比值和降低active caspase-3活化發(fā)揮其抗損傷作用，提示瘦素可能作為帕金森病治療的新方向。

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Leptin alleviates damage of 6-OHDA-induced SH-SY5Y cells

HAN Ming, DENG Zi-hui, XUE Hui, LI Yong-ming, YAN Guang-tao
Biochemistry Laboratory, Basic Medical Institute, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

YAN Guang-tao. Email: yan301@263.net

ObjectiveTo study the inhibitory effect of leptin on 6-OHDA-induced apoptosis of SH-SY5Y cells.MethodsA 6-OHDA-induced SH-SY5Y cells damage model was established and treated with leptin. Morphology of SH-SY5Y cells was observed under inverted microscope, viability of SH-SY5Y cells was assayed by MTT, damage of SH-SY5Y cells was detected by LDH, death rate of SH-SY5Y cells was tested with trypan blue staining, apoptosis of SH-SY5Y cells was detected by flow cytometry, fuorescence intensity of active caspase-3 was measured by immunofuorescence and expression levels of Bcl-2 and Bax were measured by Western blot.ResultsThe 6-OHDA-induced SH-SY5Y cells damage model was successfully established. The apoptosis of SH-SY5Y cells was about 15% lower, the survival rate of SH-SY5Y cells was about 14% higher, the damage and death of SH-SY5Y cells and the active caspase-3 concentration were higher, and the Bcl-2/Bax ratio was signifcantly lower after leptin treatment than before leptin treatment (P＜0.05).ConclusionLeptin can inhibit 6-OHDA –induced apoptosis of SH-SY5Y cells, which provides the evidence for leptin in prevention of Parkinson's disease.

6-OHDA; SH-SY5Y cells; cell damage; leptin

R 34

A

2095-5227(2014)01-0070-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.01.023

時間：2013-09-10 14:57

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20130910.1457.002.html

2013-07-19

科技基礎(chǔ)性工作專項項目(2011FY130100)；國家科技支撐計劃項目(2012BAK25B01)

Supported by National Basic Research Development Program of the Ministry of Science and Technology of China (2011FY130100); Supported by the National Key Technology R&D Program (2012BAK25B01)

韓銘，男，在讀碩士。研究方向：神經(jīng)退行性疾病的治療。Email: hm299792458@126.com

顏光濤，男，副所長，主任，研究員，博士生導(dǎo)師。Email: yan301@263.net