李 瑩，于海明，楊俊蘭，焦順昌，司 文

1解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；2南開大學，天津 300071

白細胞介素-2在人早期乳腺癌組織中的表達及預后意義

李 瑩1，于海明1，楊俊蘭1，焦順昌1，司 文2

1解放軍總醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100853；2南開大學，天津 300071

目的探討白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)在乳腺癌患者腫瘤組織中的表達與臨床病理特征及預后的關(guān)系。方法回顧性收集2000年1月- 2002年12月在解放軍總醫(yī)院手術(shù)的130例Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者的臨床資料及石蠟切片，用免疫組織化學法檢測IL-2蛋白的表達，分析IL-2蛋白的表達與乳腺癌臨床病理特征及預后的關(guān)系。結(jié)果IL-2主要在乳腺癌間質(zhì)淋巴細胞中表達。IL-2間質(zhì)細胞密度與T分期呈負相關(guān)(P=0.025)。IL-2間質(zhì)細胞密度高表達組的無病生存期(disease free survival，DFS)(P=0.007)、無遠處轉(zhuǎn)移生存期(distant disease free survival，DDFS)(P=0.010)均優(yōu)于低表達組，IL-2間質(zhì)細胞密度分組是總生存期(overall survival，OS)(HR=0.301，P=0.059)、DFS(HR=0.156，P=0.012)、DDFS(HR=0.171，P=0.018)的獨立預后預測因素。結(jié)論IL-2在乳腺癌腫瘤組織中的表達情況具有預后預測價值。IL-2表達水平低的乳腺癌患者復發(fā)轉(zhuǎn)移風險與死亡風險較高。

乳腺腫瘤；白細胞介素-2；預后

白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)是分子量約為15.5 kU的α-螺旋結(jié)構(gòu)的細胞因子，在體內(nèi)主要由活化的CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌，前者所占比例較大[1]。它是具有免疫促進作用的Th1類細胞因子，可促進免疫細胞對腫瘤的殺傷作用。

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有1百萬例新診斷的乳腺癌患者[2]。乳腺癌的一些臨床病理特征，包括腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分級、病理類型、有無脈管癌栓、年齡、月經(jīng)情況等，已經(jīng)用于對預后的判斷并指導乳腺癌的全身治療[3]。但是臨床工作中仍然需要一些新的生物靶標，更全面地對乳腺癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移、預后進行預測，從而更有針對性地進行個體化治療。

腫瘤的發(fā)生與進展過程受到間質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞、炎癥與免疫細胞產(chǎn)生信號的影響并且與其微環(huán)境相互作用[4]。細胞因子是免疫應(yīng)答強有力的調(diào)節(jié)器，由腫瘤細胞或者腫瘤細胞浸潤淋巴細胞所引起的細胞因子異常表達一定程度上有利于腫瘤的生長，同時抑制浸潤淋巴細胞的細胞毒殺傷作用。對原發(fā)腫瘤微環(huán)境中生物標記物，特別是一些細胞因子表達狀態(tài)的檢測結(jié)果，可以真實反映在疾病初期時腫瘤的免疫抑制能力和免疫系統(tǒng)抗腫瘤能力之間的對比，因此分析腫瘤免疫微環(huán)境中的細胞因子表達水平，有利于觀察、理解腫瘤的生物行為，并可能作為預后指標指導腫瘤患者的診斷、治療[5]。

IL-2在臨床中已用于乳腺癌的治療[6]，但是關(guān)于IL-2在早期乳腺癌組織中的表達及其與乳腺癌預后的關(guān)系尚鮮有報道。本研究旨在探討IL-2蛋白在乳腺癌腫瘤組織中的表達對乳腺癌預后的影響。

對象和方法

1 研究對象 收集2000年1月- 2002年12月在解放軍總醫(yī)院接受手術(shù)的具有完整臨床資料、隨訪資料及病理標本的Ⅰ～Ⅲ期女性乳腺癌患者手術(shù)切除的組織樣本。剔除病理證實為淋巴瘤的患者1例；剔除在本院進行手術(shù)前已在外院將原發(fā)腫瘤切除活檢及術(shù)前接受化療、放療、免疫治療的患者。符合上述要求患者共130例被納入本研究。

2 信息采集及隨訪方法 整理患者的臨床病理資料及輔助治療資料：年齡、月經(jīng)狀況、手術(shù)方式、病理類型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、臨床分期、SBR分級、脈管癌栓、雌激素受體(estrogen receptor，ER)表達、孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達、HER-2表達、Ki-67百分比、分子分型、術(shù)后輔助化療方案及周期數(shù)、內(nèi)分泌治療用藥及維持時間、放射治療時間及部位。并記錄復發(fā)轉(zhuǎn)移的時間、部位以及死亡時間。計算無病生存期(disease free survival，DFS)、無遠處轉(zhuǎn)移生存期(distant disease free survival，DDFS)、總生存期(overall survival，OS)及生存率。DFS為手術(shù)至出現(xiàn)局部(患側(cè)乳腺或皮下、胸壁轉(zhuǎn)移、患側(cè)乳腺局域淋巴結(jié)引流區(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)和(或)遠處復發(fā)轉(zhuǎn)移的時間；DDFS為手術(shù)至出現(xiàn)遠處復發(fā)轉(zhuǎn)移的時間；OS為手術(shù)至任何原因?qū)е滤劳龅臅r間。

3 免疫組化及結(jié)果判讀方法 對130例病人的腫瘤組織切片進行免疫組化染色。組織切片由2位獨立的病理醫(yī)師(對臨床和預后情況不知曉)分別進行分析，核對所得結(jié)果，獲得共識。IL-2陽性細胞計數(shù)方法如下：LEICA DM2000顯微鏡下全片隨機取30個不重復高倍視野(400×)，鏡下計數(shù)腫瘤間質(zhì)陽性細胞數(shù)，得出平均每個高倍視野的陽性細胞數(shù)并除以高倍視野面積(0.31 mm2)，得出平均每1 mm2陽性細胞數(shù)，即IL-2間質(zhì)細胞密度。

4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。所得實驗參數(shù)為連續(xù)變量，各參數(shù)之間的相關(guān)性、實驗參數(shù)與乳腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用Spearman秩和檢驗。年齡、Ki-67分別按照中位數(shù)分為兩組并賦值。IL-2間質(zhì)細胞密度依DDFS繪制ROC曲線，在曲線下面積最大處選取截點值，按所選節(jié)點值分為低表達與高表達兩組并賦值。生存分析選用Kaplan-Meier法，單因素分析顯著性檢驗選用Log-rank檢驗，多因素生存分析采用COX風險比例模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 隨訪結(jié)果 最后隨訪日期為2012年7月3日，中位隨訪時間112(7.7 ～ 138.6)個月。130例乳腺癌患者，中位年齡48(25 ～ 80)歲，腫瘤中位大小3(0.7 ～ 12.0) cm。118例患者接受了改良根治術(shù)，12例患者行保乳切除術(shù)。80例患者接受了術(shù)后輔助放療，104例患者接受輔助化療，術(shù)后接受輔助內(nèi)分泌治療者71例。所有患者均未接受新輔助放化療和輔助靶向治療。具體見表1。至隨訪截止時，33例出現(xiàn)局部復發(fā)和(或)轉(zhuǎn)移，31例出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，29例死亡；無病生存率74.6%，無遠處轉(zhuǎn)移生存率76.2%，總生存率77.7%。

2 乳腺癌臨床病理特征與DFS、DDFS、OS的關(guān)系 在單因素分析中，DFS與臨床分期、年齡、SBR分級、癌栓、HER2、Ki-67、分子分型相關(guān)；DDFS與臨床分期、SBR分級、癌栓、HER2、Ki-67、分子分型相關(guān)；OS與臨床分期、SBR分級、癌栓、HER2、Ki-67、ER、PR、分子分型相關(guān)(表2)。而COX多因素生存分析顯示，臨床分期、SBR分級、HER-2均是DFS、DDFS與OS的獨立預后預測因素(表3)。

3 IL-2在乳腺癌組織中的免疫組織化學染色結(jié)果IL-2主要表達在部分間質(zhì)細胞的細胞質(zhì)，這些IL-2陽性的間質(zhì)細胞呈淋巴細胞形態(tài)(圖1)。對IL-2間質(zhì)細胞密度繪制ROC曲線，選取截點值為45.48。IL-2間質(zhì)細胞密度以45.48為界(曲線下面積0.589，敏感度0.303，特異度0.935)分為高表達組與低表達組。

4 乳腺癌間質(zhì)中IL-2的表達與臨床病理特征的關(guān)系 IL-2間質(zhì)細胞密度分組與T分期呈負相關(guān)(Spearman，相關(guān)系數(shù)-0.197，P=0.025)，與臨床分期、SBR分級、分子分型、癌栓、ER、PR、HER2、Ki-67、月經(jīng)狀況等的相關(guān)性均無統(tǒng)計學意義。見表1。

5 IL-2在乳腺癌腫瘤浸潤淋巴細胞中的表達與DFS、DDFS、OS的關(guān)系 對130例患者進行單因素Kaplan-Meier分析，顯示IL-2間質(zhì)密度分組與預后相關(guān)：IL-2間質(zhì)細胞密度低表達組與高表達組的平均DFS分別為113.09±5.54個月、131.40± 4.27個月；平均DDFS分別為114.88±5.48個月、131.4±4.27個月；平均OS分別為115.63±4.21個月、130.24±4.26個月，經(jīng)Log-rank檢驗，IL-2間質(zhì)細胞密度高表達組DFS、DDFS均優(yōu)于低表達組(P=0.007、P=0.010)，兩組患者的OS差異無統(tǒng)計學意義(P=0.051)(圖2)。而在加入年齡分組、臨床分期、SBR分級、癌栓、ER、PR、HER2、Ki-67分組的COX多元分析中，IL-2間質(zhì)細胞密度分組是DFS、DDFS、OS的獨立預后預測因素，IL-2間質(zhì)細胞密度高表達組復發(fā)轉(zhuǎn)移風險和死亡風險均較低表達組低(表3)。

討 論

表1 乳腺癌患者的臨床病理特征及治療情況Tab. 1 Clinicopathologic features and treatment of breast cancer patients

IL-2是Th1類細胞因子，主要由Th1淋巴細胞產(chǎn)生?；罨腄C細胞、NK細胞和NKT細胞也可以產(chǎn)生IL-2，但是其生物學關(guān)聯(lián)尚不清楚[7-9]。IL-2通過與細胞膜上的IL-2受體(IL-2R)結(jié)合來發(fā)揮其生物活性。IL-2R受體復合體包含的亞基不同[α鏈(55 kU)，β鏈(75 kU)和γ鏈(64 kU)]，與IL-2的親和力也不同，包括低親和力的IL-2Ra，中、高親和力IL-2Raβγ。高親和力IL-2R主要存在于活化的T、B淋巴細胞及NK細胞，NK細胞(靜止狀態(tài))表達低水平的CD56抗原及IL-2Rβγ。靜止狀態(tài)的巨噬細胞亦表達中等親和力IL-2R，低親和力IL-2R僅表達在靜止狀態(tài)的T細胞。IL-2R有兩種存在形式，一種是與細胞膜結(jié)合的IL-2R(mIL-2R)，另一種是IL-2R釋放到血液及其他體液中成為可溶性形式(sIL-2R)[10-11]。目前認為淋巴細胞中存多條IL-2信號轉(zhuǎn)導途徑，例如Jak-STAT通路、Ras-Raf-MAP途徑、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kin-ase，MAPK)途徑、磷酸酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號傳導途徑等[12]。IL-2可以產(chǎn)生以下作用：1)誘導活化T淋巴細胞的增殖；2)促進CTL細胞的分化、激活NK細胞、巨噬細胞等效應(yīng)細胞產(chǎn)生殺滅腫瘤細胞作用；3)刺激T淋巴細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子(tumor neerosis factor，TNF)等免疫增強因子，間接增強B淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞等效應(yīng)細胞產(chǎn)生殺滅腫瘤細胞作用[13-15]。IL-2的濃度的降低可以減弱CD4+細胞的功能。同樣，IL-2的減少也會影響免疫信息向CTL細胞的傳遞，從而減弱CTL細胞對腫瘤細胞的殺傷能力[16]。

表2 130例患者的COX單因素生存分析Tab. 2 COX univariate analysis showing survival in 130 patients

表3 130例患者的多因素COX生存分析Tab. 3 COX multivariate analysis showing survival in 130 patients

圖 1 IL-2在乳腺癌組織中的免疫組織化學染色情況Fig. 1 Immunohistochemical staining showing low (A) and high (B) IL-2 expression in breast cancer tissue

本研究在早期乳腺癌組織間質(zhì)中觀察到大量IL-2陽性淋巴細胞浸潤。Camp等[17]對89例乳腺癌組織切片與14例良性乳腺病變組織切片的免疫組化染色分析研究顯示，乳腺癌組織中腫瘤浸潤淋巴細胞產(chǎn)生的IL-2水平超出后者。說明可能在腫瘤發(fā)生時，機體免疫水平上調(diào)以發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究深入分析了IL-2在腫瘤細胞的表達與各臨床病理特征的關(guān)系，IL-2陽性淋巴細胞的浸潤強度與腫瘤T分期負相關(guān)(P=0.025)，這與Els?sser-Beile等[18]對原發(fā)乳腺癌患者全血細胞培養(yǎng)分析，IL-2表達水平與腫瘤負荷量呈負相關(guān)的研究結(jié)果一致，也有研究發(fā)現(xiàn)，新輔助化療后腫瘤負荷減少，外周血IL-2 CD25細胞百分比較前明顯提高[19]。

本研究進一步的單因素與多因素生存分析認為IL-2間質(zhì)細胞密度分組是DFS、DDFS、OS的獨立保護性預后預測因素，IL-2間質(zhì)密度較低的患者更容易出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移，死亡風險也更高。既往有研究顯示：IL-2在血清中的表達水平與患者乳腺癌的復發(fā)率呈負相關(guān)[20-21]。Muraro和Saglam等[22-23]的研究都發(fā)現(xiàn)血清IL-2表達水平在Her-2陰性的乳腺癌患者中低于正常人與Her-2陽性乳腺癌患者。所以乳腺癌間質(zhì)IL-2陽性淋巴細胞的浸潤水平具有預后預測價值。

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Expression of IL-2 in human early breast cancer tissue and its prognostic value

LI Ying1, YU Hai-ming1, YANG Jun-lan1, JIAO Shun-chang1, SI Wen21Department of Medical Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Nankai University, Tianjin 300071, China Corresponding author: YANG Jun-lan. Email: yangjunlan301@sina.cn

ObjectiveTo study the relation between expression of IL-2 in breast cancer tissue and clinicopathological characteristics and prognosis of breast cancer. MethodsClinical data about 130 patients with stages Ⅰ-Ⅲ breast cancer admitted to our hospital from January 2000 to December 2002 were retrospectively analyzed and their paraffn sections were collected. Relation between expression of IL-2 detected with immunohistochemical staining and clinicopathological features and prognosis of breast cancer was analyzed. ResultsThe IL-2 was mainly expressed in mesenchymal lymphocytes of breast cancer. The IL-2 expression levels of disease-free survival (DFS) and distant disease-free survival (DDFS) were signifcantly higher in high density IL-2 mesenchymal cells than in low density IL-2 mesenchymal cells (P＜0.05). The overall survival (OS, HR=0.301, P=0.059), DFS(HR=0.156, P=0.012)and DDFS(HR=0.171, P=0.018)were the independent predicting factors for high density IL-2 mesenchymal cells. ConclusionExpression of IL-2 in breast cancer tissue can predict the prognosis of breast cancer. Relapse and metastasis of breast cancer are related with the high death rate in breast cancer patients with a low IL-2 expression level.

breast neoplasms; interleukin-2; prognosis

R 737.9

A

2095-5227(2014)02-0161-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.02.019

2013-10-12 11:15

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20131012.1115.003.html

2013-08-12

衛(wèi)生部吳階平醫(yī)學基金項目(320.6752.1230GB001)

李瑩，女，在讀碩士。研究方向：乳腺癌的內(nèi)科治療。Email: liyingpla@126.com；共同第一作者：于海明，女，在讀博士，主治醫(yī)師。研究方向：惡性腫瘤的免疫治療。Email: xiaooyu @hotmail.com

楊俊蘭，女，主任醫(yī)師，教授。Email: yangjunlan301@ sina.cn