劉宇欣，李紅玉，嚴 鵬

遼寧醫(yī)學院藥學院，遼寧錦州 121000

海龍蛋白質提取物誘導宮頸癌Hela細胞凋亡的機制

劉宇欣，李紅玉，嚴 鵬

遼寧醫(yī)學院藥學院，遼寧錦州 121000

目的研究海龍蛋白質提取物對宮頸癌Hela細胞增殖及凋亡的誘導作用。方法采用MTT法檢測蛋白質提取物對細胞生長的抑制情況，采用Annexin V/PI流式細胞分析法檢測細胞凋亡，Western blot檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2、P53的表達。結果不同濃度海龍蛋白質提取物對Hela細胞的增殖有抑制作用，具有時間和濃度依賴性。Annexin V/PI流式細胞分析顯示，加藥組早期凋亡率分別為29.18±0.65、39.32±0.78、51.21±1.13、61.56±1.09，與對照組(9.82±0.18)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；晚期凋亡率加藥組分別為3.20±0.03、7.48±0.06、11.11±0.07、14.60±0.03，與對照組(1.12±0.09)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Western blot檢測發(fā)現隨著蛋白質提取物濃度的升高，Bax、P53蛋白的表達逐漸升高，Bcl-2蛋白的表達逐漸降低。結論海龍蛋白質提取物在一定濃度范圍內可在體外抑制Hela細胞增殖并誘導其凋亡，且隨蛋白質提取液濃度的升高，凋亡率顯著增加，可能的機制是增強促凋亡蛋白Bax、P53的表達，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。

海龍；蛋白質提取物；Hela細胞；凋亡

海龍屬脊索動物門硬骨魚綱、海龍目、海龍科。海龍始載于《本草綱目拾遺》，謂“功倍海馬，催生尤捷效”。海龍性溫、味甘、暖水藏、壯陽道、消腫塊，故有溫腎壯陽，散結消腫之功效，主治陽痿，遺精，腎虛作喘，瘰疬痰核，跌撲損傷，外治臃腫疔瘡[1]。海龍中含有多種氨基酸、脂肪酸和微量元素，還含有多糖和蛋白質類物質[2]。近年來，很多文獻報道海龍?zhí)崛∥锛扔写龠M人體淋巴細胞轉化的作用，又有抑制人體癌細胞株的效果，海龍?zhí)崛∥镞€可促使腫瘤細胞溶解，且藥物劑量越大，細胞溶解率越高[2]。而抗癌的有效成分可能是蛋白質和多肽類，有研究表明，其蛋白類成分對肺癌和結腸癌有抑制作用，而對宮頸癌的作用未見明確報道[3]。近年來宮頸癌發(fā)病率較高，對其抗癌藥物的研究越來越受到人們的重視。本文對海龍中的蛋白質組分進行提取分離，并考察其對宮頸癌細胞凋亡的影響。

材料和方法

1 材料 海龍(購自錦州市藥材市場)；低分子量標準蛋白(20 ～ 120 kU)(上海金穗生物科技有限公司)；Hela細胞(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所)；DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清、胰酶、MTT均購自北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司；凱基Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；一抗兔抗人Bax、Bcl-2(北京博奧森生物技術有限公司)；兔抗人P53(Proteintech Group公司)。

2 儀器 SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺(蘇州江東精密儀器有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；全自動酶標儀SUNRISE(瑞士TECAN公司)；熒光顯微鏡TE2000-U(日本NIKON公司)；FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)；043BR119 12BIO-RAD半干轉印儀、041BR24044BIO-RAD電泳槽均購自美國伯樂公司；曝光顯影系統(tǒng)。

3 海龍蛋白質的提取 將海龍粉碎，過篩，精密稱取50 g，按1∶10加入三蒸水，4℃提取24 h，攪拌，使有效成分充分溶解。將粗提液加入2倍體積的硫酸銨(硫酸銨的飽和度為50%)，靜置4 h后8 000 r/min離心30 min，棄上清，用蒸餾水溶解攪拌促溶，待蛋白質完全溶解后離心，收集蛋白質上清液，將蛋白質提取液放入經NaHCO3和EDTA處理后的透析袋中，用0.02 mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液平衡，每隔3 h換1次緩沖液，用1%氯化鋇檢查硫酸鹽的除去情況，直到溶液中無硫酸鹽沉淀為止[4-5]。將透析得到的提取液用Sephadex G-75層析柱進一步分離，用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)平衡Sephadex G-75柱(2.6 cm×20 cm)，樣品上樣后用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)洗脫，流速為0.5 ml/min，收集洗脫液，用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，得到含量為40%的1組蛋白質提取物[6-8]。

4 細胞培養(yǎng) 取1株Hela細胞用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液在5% CO2的37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞80% ～ 90%貼壁時按1∶3進行傳代，取對數生長期的細胞進行實驗[9]。

5 MTT法檢測蛋白質提取物對Hela細胞抑制率 取對數生長期Hela細胞，調整細胞密度為5×104/ml，接種于96孔板，每孔100 μl，將培養(yǎng)板放入37℃5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h后，加入蛋白質提取液，使終濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml，并設空白對照組，每個濃度6個復孔，藥物作用24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸棄孔內全部上清液，同時每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，輕微振蕩10 min，混勻后用酶標儀(波長= 490 nm)檢測各孔吸光值(A值)。按公式計算細胞生長抑制率并以細胞生長抑制率對藥物濃度和作用時間繪制曲線。

6 Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡將Hela細胞以密度為1×106/ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，加入濃度分別為0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml的蛋白質提取液，另外設3個對照孔，其中兩個分別加入4 mg/ml的蛋白質提取液，剩下1個孔不加藥，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入不含EDTA的胰酶消化收集細胞，用PBS洗細胞2次(2 000 r/min離心5 min)，調節(jié)細胞密度為1×105～ 5×105/ml，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，藥物處理組分別加入5 μl Annexin VFITC和5 μl PI，混勻，加藥的兩個孔1個單染5 μl Annexin V-FITC 1個單染5 μl PI，不加藥的對照組不做任何處理，缺失的用量用PBS補足，加好后于室溫、避光條件下反應5 ～ 15 min，在1 h內用流式細胞儀檢測[12-13]。

7 Western blot檢測Bax、Bcl-2和P53蛋白表達

取5瓶長滿的Hela細胞分別加入0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml的蛋白質提取液，其中1瓶不加藥的細胞作為空白對照，加藥48 h收集細胞，放入EP管離心，將收集好后的細胞加入裂解液，將其振蕩混勻，離心取上清，用BCA法測定細胞中的蛋白含量，進行制樣。制好樣品后配置12%分離膠，5%濃縮膠進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，90 V電壓待進入分離膠后調節(jié)電泳到120 V，待出現完整的Mark條帶后終止電泳，20 V 20 min進行轉膜。將轉好的膜用封閉液封閉，分別根據所檢測的蛋白分子量進行裁膜，分組分別用一抗兔抗人Bax(1∶400稀釋)、兔抗人Bcl-2(1∶400稀釋)，兔抗人P53(1∶1 000稀釋)，鼠抗人β-actin (1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，二抗孵育1 h，兩次孵育后分別用TBST洗膜3次，ECL顯影，上機檢測[14]。

8 數據處理 用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析，各組數據用±s表示，多組之間比較采用兩因素析因方差分析和單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MTT法檢測海龍蛋白質提取液對Hela細胞抑制率的影響 根據不同時間、不同濃度測得的OD值，按照材料和方法5中的公式計算出抑制率。由圖1可以看出隨著蛋白質提取液濃度的升高和時間的延長，細胞的抑制率明顯升高，各個濃度組分別與對照組進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2 流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡 在流式細胞的左下區(qū)(LL)為正常細胞，Annexin V及PI均低染(Annexin V- PI-)，右上區(qū)(RU)為死亡或晚期凋亡的細胞Annexin V及PI均高染(Annexin V+ PI+)，右下區(qū)(LR)為早期凋亡的細胞Annexin V高染而PI低染(Annexin V+ PI-)(圖2)[15-16]。將各濃度組細胞早期凋亡率和晚期凋亡率分別與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

3 Western blot檢測Bax、P53、Bcl-2的表達 Bax、P53在對照組的表達最低，隨著蛋白質提取液濃度的升高，兩種蛋白的表達均逐漸升高，Bcl-2在對照組表達最高，實驗組隨著蛋白質提取液濃度的升高，蛋白的表達逐漸降低，3種蛋白各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖3。

表1 Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡率Tab. 1 Annexin V-FITC/PI flow cytometry showing apoptosis rate of Hela cells (±s, %)

表1 Annexin V-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡率Tab. 1 Annexin V-FITC/PI flow cytometry showing apoptosis rate of Hela cells (±s, %)

aP＜0.05, vs 0 mg/ml

ConcentrationEarly apoptosis rateLate apoptosis rate 0 mg/ml9.82±0.181.12±0.09 0.5 mg/ml29.18±0.65a3.20±0.03a 1 mg/ml39.32±0.78a7.48±0.06a 2 mg/ml51.21±1.13a11.11±0.07a 4 mg/ml61.56±1.09a14.60±0.03a

圖 1 海龍蛋白質提取液對Hela細胞抑制率的影響Fig. 1 Effect of Syngrathus protein extract on proliferation and apoptosis of Hela cells

圖 2 流式細胞術檢測Hela細胞凋亡Fig. 2 Flow cytometry showing apoptosis of Hela cells A: control group； B： 0.5 mg/ml dosing group； C: 1 mg/ml dosing group； D: 2 mg/ml dosing group； E: 4 mg/ml dosing group

圖 3 Western blot 檢測Bax、P53、Bcl-2 蛋白的表達情況(P＜0.05)Fig. 3 Western blot showing expression of Bax, P53 and Bcl-2 in Hela cells (P＜0.05) 1: 0 mg/ml; 2: 0.5 mg/ml; 3: 1 mg/ml; 4: 2 mg/ml; 5: 4 mg/ml

討 論

宮頸癌細胞凋亡與其他細胞凋亡一樣，可能受到很多凋亡相關基因的調控，參與細胞凋亡的基因主要分為兩類：促凋亡基因和抑凋亡基因，其中Bax和p53是促凋亡基因，Bcl-2是抑凋亡基因，它們都是細胞凋亡過程中的重要基因。當促凋亡基因表達過量時，抑凋亡基因表達降低，則促進細胞凋亡。實驗發(fā)現隨著海龍蛋白質提取物濃度的增加，Bax和P53的表達逐漸升高，而Bcl-2蛋白的表達則逐漸降低，達到誘導腫瘤細胞凋亡的作用[17-18]。

海龍中蛋白提取物同其他海洋藥物的蛋白類提取物一樣，不僅具有增強免疫調節(jié)的作用，還有抗腫瘤的功效，通過實驗初步探討了其對宮頸癌Hela細胞凋亡的機制，而其他導致凋亡的機制還需要進一步研究，為以后抗宮頸癌藥物的研制提供了一定的依據。

1 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典［M］. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 495.

2 許東暉，謝江海，梅雪婷，等.我國海龍的研究進展［J］.中國海洋藥物，2005，24（2）：51-56.

3 劉冬玲，盧振.藥用海洋動物海龍的研究概述［J］.時珍國醫(yī)國藥，2005，16（9）：918-919.

4 王子佳，李紅梅，弓愛君，等.蛋白質分離純化方法研究進展［J］.化學與生物工程，2009，26（8）：8-11.

5 王廷華，邢如新，游潮.蛋白質理論與技術［M］.北京：科學出版社，2005：108-110.

6 羅輕蕾，閆茂倉，陳少波，等.美國紅魚免疫球蛋白的分離純化［J］.科技通報，2010，26（4）：623-627.

7 張及祿，文慧民，孫德軍.蝮蛇毒小分子多肽的分離、純化及其抗腫瘤作用研究［J］.中國生化藥物雜志，2009，30（4）：217-220.

8 何芬，馬旭東，王夢月，等.粗吻海龍蛋白質組分體外抗腫瘤活性的研究［J］.中國藥學雜志，2008，43（12）：903-906.

9 Yang PY， Hu DN， Liu FS. Cytotoxic effect and induction of apoptosis in human cervical Cancer cells by Antrodia camphorata［J］. Am J Chin Med， 2013， 41（5）： 1169-1180.

10 李月紅，易建平，王曉燕.噴他脒對人宮頸癌細胞株 Hela 細胞增殖和誘導凋亡的作用［J］.軍醫(yī)進修學院學報，2008，29（2）：95-97.

11 林濤，李剛，劉青林，等.冬凌草甲素誘導人腦膠質瘤U251細胞的凋亡及其機制［J］.山東大學學報：醫(yī)學版，2010，48（8）：8-12.

12 劉文達，衣服新，惠青山.枸杞多糖聯(lián)合卡鉑對人膠質瘤U251細胞生長抑制和凋亡作用［J］.解放軍醫(yī)學院學報，2013，34（2）：179-180.

13 張巖巖，康健.中藥艾迪誘導人喉癌細胞Hep-2凋亡的研究［J］.軍醫(yī)進修學院學報，2012，33（1）：78-81.

14 李明，劉霞，郭書翰，等.木果楝內酯抑制人乳腺癌腦轉移細胞增殖活性的研究［J］.解放軍醫(yī)學院學報，2013，34（8）：865-868.

15 劉曉霓，李玉潔，楊慶，等.瑞香狼毒提取物體外誘導腫瘤細胞凋亡作用比較研究［J］.中國中藥雜志，2012，37（10）：1440-1444.

16 Zhang T， Du J， Liu L， et al. Inhibitory effects and underlying mechanism of 7-hydroxyflavone phosphate ester in HeLa cells［J］. PLoS One， 2012， 7（5）： e36652.

17 Archana M， Bastian， Yogesh TL， et al. Various methods available for detection of apoptotic cells--a review［J］. Indian J Cancer， 2013，50（3）： 274-283.

18 呂俊華，沈文娟，韋笑梅，等.荔枝核提取物對荷瘤小鼠腫瘤細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響［J］.中成藥，2008，30（9）：1381-1383.

Mechanism of Syngrathus protein extract underlying apoptosis of cervical cancer Hela cells

LIU Yu-xin, LI Hong-yu,YAN Peng
School of Pharmacy, Liaoning Medical College, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China
Corresponding author: LI Hong-yu. Email: lihongyu@163.com

ObjectiveTo study the role of Syngrathus protein extract in inducing proliferation and apoptosis of cervical cancer Hela cells.MethodsThe inhibitory effect of Syngrathus protein extract on growth of Hela cells was tested by MTT assay. Apoptosis of Hela cells was assayed by Annexin V/PI flow cytometry. Expression of Bax, p53 and Bcl-2 in Hela cells was detected by Western blot.ResultsSyngrathus protein extract inhibited the growth of Hela cells in a time- and concentration-dependent manner. Annexin V/PI flow cytometry showed that the early and late apoptosis rate of Hela cells were significantly higher in Syngrathus protein extract treatment group than in control group (29.18±0.65, 39.32±0.78, 51.21±1.13, 61.56±1.09 vs 9.82±0.18, P＜0.05; 3.20±0.03, 7.48±0.06, 11.11±0.07, 14.60±0.03 vs 1.12±0.09, P＜0.05). Western blot displayed that the expression level of Bax and P53 protein increased while that of Bcl-2 protein decreased with the increasing concentration of Syngrathus protein extract.ConclusionSyngrathus protein extract inhibits the proliferation and induces the apoptosis of Hela cells in vitro by up-regulating the expression of Bax and P53 and down-regulating the expression of Bcl-2. The apoptosis rate of Hela cells increases with the increasing concentration of Syngrathus protein extract.

syngrathus; protein extract; Hela cells; apoptosis

R 329

A

2095-5227(2014)06-0623-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.06.030

2013-11-05

劉宇欣，女，碩士。Email: yuxin19880610@163.com

李紅玉，女，教授，碩士生導師。Email: lihongyu@163. com