葉麗華，夏 飛，李 欣，江必武，王 平

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科，武漢 430030；2.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，武漢 430060；3.武漢市第一醫(yī)院漢西分院消化內(nèi)科，武漢 430034）

黃芪對銅綠假單胞菌毒力因子調(diào)控表達(dá)及菌體運(yùn)動的影響*

葉麗華1，夏 飛2，李 欣3，江必武3，王 平3

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科，武漢 430030；2.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，武漢 430060；3.武漢市第一醫(yī)院漢西分院消化內(nèi)科，武漢 430034）

摘要：[目的]觀察黃芪對銅綠假單胞菌相關(guān)毒力因子表達(dá)及菌體運(yùn)動的影響，探討黃芪對銅綠假單胞菌的作用機(jī)制。[方法]不同濃度黃芪與對數(shù)生長期銅綠假單胞菌共培養(yǎng)，彈性蛋白-剛果紅降解實驗檢測細(xì)菌分泌的彈性蛋白酶活性，紫外分光光度法測定綠膿菌素分泌量，結(jié)晶紫染色法觀察生物被膜形成量，在含黃芪瓊脂平板中檢測菌體集群運(yùn)動與泳動能力。[結(jié)果]黃芪在終濃度25、12.5、6.25 g/L條件下對彈性蛋白酶、綠膿菌素表達(dá)有顯著抑制，并能抑制生物被膜形成。在低于12.5 g/L時對細(xì)菌增殖無顯著影響。細(xì)菌在12.5 g/L條件下泳動能力與集群運(yùn)動均受到顯著影響。[結(jié)論]黃芪對銅綠假單胞菌增殖和毒力因子表達(dá)的抑制程度不一致，提示黃芪抑菌可能通過多種途徑發(fā)揮抑菌功能，并可能在低濃度下便對密度感應(yīng)系統(tǒng)造成顯著抑制。

關(guān)鍵詞：彈性蛋白酶；綠膿菌素；生物被膜；菌體運(yùn)動；黃芪

銅綠假單胞菌（PA）是臨床上常見院內(nèi)獲得性感染條件致病菌之一，能產(chǎn)生釋放多種毒力因子，如外毒素A、彈性蛋白酶、鼠李糖等[1]。該菌能借助分泌物形成生物被膜（BF）并依靠菌體運(yùn)動器官完成多種細(xì)菌運(yùn)動如集群運(yùn)動、涌動等。利用生物膜-浮游態(tài)轉(zhuǎn)換導(dǎo)致感染擴(kuò)散、毒素播散和全身炎癥反應(yīng)綜合征，加之抗生素的亂用和濫用，導(dǎo)致多重耐藥或泛耐藥菌株的出現(xiàn)，部分患者由于無藥可用而死于感染。隨著“抗生素后時代”的到來，人們開始更多地求助于非抗生素治療。中藥迄今已有兩千多年的歷史，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)有多種中藥具有抑菌殺菌的功效[2-3]，黃芪是臨床上常用的一味中藥，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、保肝、利尿和廣泛的抗菌作用。因此本實驗選用黃芪粉作用PA，觀察其對毒力因子表達(dá)與菌體運(yùn)動的影響，探討作用機(jī)制，為臨床細(xì)菌感染的治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株與培養(yǎng)液 野生標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)AO1株為本實驗室保存。培養(yǎng)液：LB培養(yǎng)液，含1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉。

1.2 試劑與試液 0.2 mol/L鹽酸溶液，10 mmol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液，剛果紅彈性蛋白（美國Sigma公司），黃芪顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司，1205182，每袋1.5 g。

1.3 瓊脂平板 LB培養(yǎng)基配制成0.3%、0.5%瓊脂懸液，高壓滅菌后備用。配制500g/3L黃芪粉末懸液，裝入玻璃瓶，100℃水浴40 min后離心，5 000 r/min，分別取上清液1.5 mL加入平碟內(nèi)，各加入融化的0.3%、0.5%瓊脂20 mL，混勻固化后備用。平碟內(nèi)黃芪藥液終濃度為12.5 g/L。0.5%瓊脂平板使用前倒置于30℃過夜。

1.4 實驗器材 紫外分光光度計（HITACHU-2900、Amersham Genequant pro），蘇泰生物安全柜，恒溫?fù)u床，硅膠管。

1.5 黃芪對PA生長的影響 PAO1菌培養(yǎng)過夜，用LB培養(yǎng)液稀釋A600為0.6后加入玻管，3.0mL/管；配制1200g/6L的黃芪懸液，玻管內(nèi)100℃水浴40 min后，5 000 r/min，取上清用LB培養(yǎng)基稀釋為100、50、25和12.5 g/L。取上述不同濃度藥液分別加入含有菌液的玻璃管中，1.0 mL/管。加入后使菌懸液中黃芪終濃度為50、25、12.5、6.25、3.12 g/L。陰性對照組加入1 mL LB培養(yǎng)基，同時設(shè)立黃芪懸液對照。37℃培養(yǎng)、150 r/min，24 h。測定A600值，實驗重復(fù)3次。

1.6 綠膿菌素分泌檢測 收集上述菌液離心，16 000×g 5 min取上清，加入2.0 mL氯仿，分離下層溶液并加入0.2 mol/L HCL 0.8 mL，取上層液體離心，16 000×g 2min，取上清測定A520值，實驗重復(fù)3次，取平均值[4]。

1.7 彈性蛋白酶檢測[5]收集上述菌液上清，每管取80 μL備用，取60 μL加入到800 μL Na2HPO4溶液中（含1 g/L剛果紅彈性蛋白），37℃反應(yīng)18 h。反應(yīng)完成后離心，16 000×g 5 min，取上清測A495值，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.8 BF形成能力檢測 準(zhǔn)備2 cm長硅膠管高壓滅菌后置玻管內(nèi)，加入A600值0.6菌液3.0 mL，分別加入上述濃度藥液1.0 mL，每梯度3管，37℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)到期后取出硅膠管至空白玻璃管內(nèi)用蒸餾水清洗殘留浮游菌3次，用1%結(jié)晶紫室溫孵育15 min，用蒸餾水清洗3次后加入2 mL 95%乙醇洗滌，測定A540值，實驗重復(fù)3次，取平均值[5]。

1.9 集群運(yùn)動與泳動能力檢測 根據(jù)前期檢測結(jié)果分別制備含12.5 g/L黃芪藥液的0.3%與0.5%瓊脂平皿。取培養(yǎng)過夜菌液A6001.5接種，集群運(yùn)動接種于瓊脂層表面，每板1.0 μL，泳動接種于瓊脂中層，每板0.6 μL[6-7]。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BF檢測 BF的A540值顯示50 g/L組生物膜形成弱于其余各組，3.12 g/L組生物膜形成與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果見表1。

2.2 黃芪對PA生長的影響 本次實驗中PA的A600值隨著黃芪濃度的升高而逐漸增加。其中50 g/L和25 g/L的A600值顯著高于其余各組，12.5、6.25、3.12 g/L組與空白對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異，結(jié)果見表2。

表1 不同濃度黃芪對PA的BF起始量的影響（x±s，n=3）Tab.1 Effects of Astragalus mongholicus on the initiation of PA biofilms（x±s，n=3）

2.3 綠膿菌素與彈性蛋白酶分泌檢測 各組綠膿菌素A520值與彈性蛋白酶A495值隨著黃芪濃度的增加而逐漸降低，50 g/L組綠膿菌素與彈性蛋白酶分泌量均低于其余各組，結(jié)果見表3。

2.4 集群運(yùn)動與泳動能力檢測 選取12.5 g/L黃芪濃度制備瓊脂平板。37℃孵育24 h后可見0.3%瓊脂平皿中黃芪組泳動能力弱于陰性對照組。0.5%集群運(yùn)動平皿中陰性對照組泳動面積顯著略大于黃芪組，培養(yǎng)24、48、72 h仍呈現(xiàn)此結(jié)果，見圖1。

3 討論

近年來中藥已成為研究抗菌抑菌藥物的來源之一，其優(yōu)勢在于中藥某些成分具有天然抗菌抑菌活性，這已在中醫(yī)學(xué)典籍與長期臨床醫(yī)學(xué)實踐中得到證實[8-10]，如具有補(bǔ)氣清熱解毒、利濕通淋類作用的黃芪、黃連等多種中藥具有不同程度的抑菌作用。此外，通過現(xiàn)代科技還可提取有效成分并在其基本結(jié)構(gòu)上加以改造。在細(xì)菌抗生素耐藥壓力與日俱增的背景下，利用中藥配以低劑量抗生素協(xié)同殺菌抑菌的研究日漸增多。

本實驗中筆者選擇黃芪體外作用于PA，觀察是否能夠?qū)A毒力因子、BF以及細(xì)菌運(yùn)動系統(tǒng)產(chǎn)生影響。實驗數(shù)據(jù)表明PA的吸光度A600隨著黃芪濃度增加而升高。實驗組與黃芪對照組的吸光度差值有隨著黃芪濃度增加而升高的趨勢，這表明高濃度黃芪提取液對吸光度造成干擾。同時低濃度黃芪對照組間吸光度值無顯著差異顯示這種干擾程度在此范圍內(nèi)較為恒定，細(xì)菌吸光度數(shù)值在低黃芪濃度范圍內(nèi)與正常對照無顯著差異。

表2 不同濃度黃芪對PA生長的影響（x±s，n=3）Tab.2 Effects of Astragalus mongholicus at different concentration on growth of PA（x±s，n=3）g/L

表3 綠膿菌素與彈性蛋白酶的檢測結(jié)果（x±s，n=3）Tab.3 Effects of Astragalus mongholicus on production of pyocyanin and lastase（x±s，n=3）g/L

圖1 12.5 g/L黃芪對PA泳動與集群運(yùn)動的影響Fig.1 Effects of Astragalus mongholicus of 12.5 g/L onswimming and swarming of PA

實驗結(jié)果顯示細(xì)菌毒力因子在黃芪作用下不同程度地受到抑制，特別是低于12.5 g/L時，黃芪提取液吸光度無顯著變化，細(xì)菌濃度也無顯著增加，這表明低濃度黃芪提取液對細(xì)菌生長無抑制作用。此時毒力因子的抑制機(jī)制可能為非生長抑制途徑。Schabel等[5]的研究表明彈性蛋白酶受到Las密度感應(yīng)系統(tǒng)（QS）的嚴(yán)格調(diào)控，QS系統(tǒng)激活之前只有非常低水平的表達(dá)，彈性蛋白酶缺失意味著QS系統(tǒng)單一或者雙缺陷。在筆者前期研究中已將彈性蛋白酶的表達(dá)作為判斷QS系統(tǒng)突變或缺失的標(biāo)準(zhǔn)并已進(jìn)行了基因水平的驗證，這也提示當(dāng)QS系統(tǒng)受到抑制時其彈性蛋白酶的表達(dá)也會受到抑制。QS系統(tǒng)也參與BF的分化與成熟，特別是BF的微克隆分化需要3OC12-高絲氨酸內(nèi)酯（3OC12-HSL）分子，lasI基因一旦突變，PA就只能形成扁平、均一不分化的生物膜，而不能形成成熟的三維立體結(jié)構(gòu)。當(dāng)加入合成的信號分子3OC12-HSL共同培養(yǎng)后，能使突變株恢復(fù)形成成熟生物膜的能力[11]。本項實驗結(jié)果表明不同濃度的實驗組黃芪同樣能抑制BF的起始，并呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。

基于以上結(jié)果，筆者選取12.5 g/L黃芪開展泳動和集群運(yùn)動實驗。有報導(dǎo)表明泳動與集群運(yùn)動主要依賴細(xì)菌鞭毛[12]，泳動來自細(xì)菌菌毛與鞭毛的協(xié)同作用，集群運(yùn)動主要來自鞭毛運(yùn)動。本實驗結(jié)果顯示在12.5 g/L黃芪作用下，細(xì)菌泳動與集群運(yùn)動均受到顯著抑制。這表明QS系統(tǒng)不僅對毒力因子的表達(dá)具有不同程度的調(diào)控作用，同時還能影響細(xì)菌鞭毛運(yùn)動，包括BF的形成。

本次實驗筆者發(fā)現(xiàn)黃芪從多個方面對PA的毒力因子、BF和運(yùn)動產(chǎn)生廣泛抑制，因此這種抑制有可能在低濃度條件下對QS系統(tǒng)產(chǎn)生抑制而在高濃度時對細(xì)菌生長產(chǎn)生抑制。這種機(jī)制可能來自對QS系統(tǒng)的多個層面的抑制。如從紅藻Delisea pulchra發(fā)現(xiàn)的溴化呋喃[13]因其結(jié)構(gòu)與AHL分子相似而發(fā)揮干擾QS信號交流系統(tǒng)傳遞的作用，又如從大蒜提取物中發(fā)現(xiàn)至少含有3種不同的QS抑制物,其中的一種已被鑒定為環(huán)狀二硫化合物[14],這種QS抑制物對以LuxR為基礎(chǔ)的QS發(fā)揮強(qiáng)烈抑制作用。這些天然QS抑制物的作用機(jī)制為研究黃芪QS抑制機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Smith RS,Iglewski BH.P.aeruginosa quorum-sensing systems and virulence[J].Curr Opin Microbiol,2003，6(l):56-60.

[2]薛 坤.15種中藥制劑微生物限度檢查方法驗證[J].天津中醫(yī)藥，2008,25（1）：71-74.

[3]張曉燕汪選斌王林海，等.前愈湯劑體外抗菌實驗研究[J].天津中醫(yī)藥，2008,25（3）：241-242.

[4] Essar DW,Eberiy L,Hadero A,et al.Identification and characterization of genes for a second anthranilate synthase in Pseudomonas aeruginosa:interehangeability of the two anthranilate synthases and evolutionary implications[J].J Baeteriol,1990,172(2):884-900.

[5] Schabel JA,Carty NL,Mcdonald NA,et al.Analysis of quorum sensing-deficient clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa[J].J Med Microbiol,2004,53(9):841-853.

[6] Déziel E,Comean Y,Villemur R.Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming,swarming,and twitching motilities[J].J Baeteriol,2001,183 (4):1195-1204.

[7] Rashid MH,Kornberg A.Inorganic polyphosphate is needed for swimming,swarming,and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa[J].Proc Natl Aead Sci,2000,25(9):4885-4890.

[8]張麗娟,張貴君,李仁偉.金蓮花蛋白超聲提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性的初步測定[J].天津中醫(yī)藥,2007,24(1):63-65.

[9]熊衛(wèi)東馬慶一.含蒽醌的中草藥—一類潛在的天然抑菌防腐劑初探[J].天津中醫(yī)藥，2004,21（2）:158-160.

[10]楊春華.幽門螺桿菌感染性胃病中醫(yī)藥治療研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008,27(2):110-112.

[11]Davies DG，Parsek MR，Pearson JP，et al.The involvement of cellto-cell signals in the development of a bacterial biofilm[J]．Science, 1998,280:295-298．

[12]Ja cinta CC,Maxsim LG,Fan J,et al.Flagella and pili-mediated near-surface single-cell motility mechanisms in P.aeruginosa[J]. Biophysical Journal,2011,100(7):1608-1616.

[13]Manefield M，Rasmussen TB，Henzter M，et al．Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover[J]．Microbiology，2002，148(4)：1119-1127． [14]PerssonT,HansenTH,RasmussenTB,et al.Rational design and synthesis of new quorum-sensing inhibitors derived fromac-ylated homoserine lactones and natural products from garlic[J].Org Biomol Chem,2005,3（2）:253-262.

（本文編輯：高 杉，于春泉）

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-1519（2014）02-0113-04

收稿日期：（2013-08-10）

*基金項目：湖北省自然科學(xué)基金資助項目（2011CDB302），武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學(xué)科研項目（WX12A06）。

作者簡介：葉麗華（1970-），碩士，主管護(hù)師，主要從事感染性疾病研究。

通訊作者：王 平，E-mail:13986271869@139.com。

Effects of Astragalus mongholicus on expression of pseudomonas aeruginosa virulence factors and somatic motility

YE Li-hua1，XIA Fei2，LI Xin3,JIANG Bi-wu3,WANG Ping3
（1.Department of Infectious Diseases,Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.Wuhan Institute of Biological Institute Co.,Ltd.,Wuhan 430060,China;3.Department of Gastroenterology,Hanxi Branch of Wuhan First Hospital,Wuhan 430034,China）

Abstract:[Objective]To investigate the effects of Astragalus mongholicus on virulence factor of pseudomonas aeruginosa(PA)virulence and somatic motility and explore its mechanism.[Methods]The elastase activity was assessed quantitatively by elastin-Congo red degradation;the secretion of pyocyanin was determined with ultraviolet spectrophotometry after co-culture of different concentration of Astragalus mongholicus and PA at heterogonous grow phase;the biofilm formation was detected by crystal violet staining.The assay of somatic swarming was conducted in petri dishes,containing Astragalus mongholicus.[Results]The expression of elastase and pyocyanin were obviously inhibited at the concentration of 25 g/L,12.5 g/L and 6.25 g/L of Astragalus mongholicus and the biofilm formation was also inhibited.No effect on bacterial hyperplasia was found under 12.5 g/L.But the swimming and swarming motility of bacteria were reduced at 12.5 g/L.[Conclusion]Astragalus mongholicus can inhibit the hyperplasia and virulence factor of PA at different levels,indicating that the inhibition is controlled by multiple mechanisms,and the quorum sensing system can regulate these factors at a lower concentration of cultivation.

Key words：elastase;pyocyanin;biofilm;somatic motility;Astragalus mongholicus