向云龍，張 亮，陳 卓

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007)

泛素偶聯(lián)酶2C(Ubiquitin- conjugating enzyme 2C，UBE2C) 能夠優(yōu)先對(duì)底物賴氨酸進(jìn)行多聚泛素化，特異性降解有絲分裂過程中細(xì)胞周期蛋白等短周期蛋白從而使細(xì)胞退出分裂期，起到調(diào)控有絲分裂檢驗(yàn)點(diǎn)以及控制細(xì)胞周期進(jìn)程的作用［1］。同時(shí)，在臨床腫瘤病例以及癌細(xì)胞系中，均在染色體上發(fā)現(xiàn)UBE2C 多拷貝以及表達(dá)上調(diào)，提示UBE2C可以在一定程度上作為腫瘤標(biāo)記分子［2，3］。研究表明，在細(xì)胞系中過表達(dá)UBE2C 導(dǎo)致細(xì)胞忽略有絲分裂紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)，失去基因組穩(wěn)定性從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［4］。但UBE2C在小鼠早期胚胎中的作用尚未見報(bào)道。

小鼠以及其他哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞在發(fā)育過程中會(huì)逐漸積累mRNA、蛋白質(zhì)等母源物質(zhì)，從而達(dá)到卵母細(xì)胞成熟［5］。這些母源物質(zhì)對(duì)隨后的受精以及胚胎發(fā)育過程至關(guān)重要。盡管母源蛋白在卵母細(xì)胞向受精卵轉(zhuǎn)變后，通過泛素化［6，7］或者巨自噬途徑［8］開始逐漸降解，但部分母源物質(zhì)仍然需要維持一定時(shí)間，以渡過合子基因組激活前轉(zhuǎn)錄的空隙期［9］。如果母源物質(zhì)過早缺失則會(huì)嚴(yán)重影響早期胚胎的發(fā)育，導(dǎo)致一系列的發(fā)育遲緩甚至發(fā)育停滯［10］。

既往研究證明，UBE2C 能夠靶向降解多種蛋白，參與諸如細(xì)胞周期進(jìn)程、抗原遞呈、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡等［11，12］細(xì)胞活動(dòng)。本試驗(yàn)通過在受精卵時(shí)期過表達(dá)UBE2C，觀察隨后胚胎發(fā)育進(jìn)程，從而初步探索UBE2C 在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ICR 小鼠(北京維通利華公司) ; 促性腺激素(寧波第二激素廠) ; 載體(Clontech) 、內(nèi)切酶、RT- PCR 試劑(日本TAKARA 公司) ; 鼠抗GAPDH 和UBE2C 抗體(臺(tái)灣Abnova 公司) ; 反轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega 公司) ; 轉(zhuǎn)錄、純化試劑盒(德國QIAGEN 公司) ; ECL 底物發(fā)光試劑盒(英國Pierce 公司) ; 其他試劑除特別說明外均購自美國Sigma 公司。

1.2 溶液配制

KSOM 培養(yǎng)液配制: 95 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，0.35 mmol/L KH2PO4，0.2 mmol/L MgSO4·7H2O，0.2 mmol/L 葡萄糖，10 mmol/L 乳酸鈉，25 mmol/L NaHCO3， 0.2 mmol/L丙酮酸鈉，1.71 mmol/L CaCl2·2H2O，0.01 mmol/L EDTA，1 mmol/L L-谷氨酰胺，BSA 1 g/L，酚紅0.001 g/L，青、鏈霉素。

蛋白裂解液配制: 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5) ，150 mmol/L NaCl，1%脫氧膽酸鈉，1% Triton X- 100，0.1% SDS，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L Na3VO4，5 ～10 mmol/L NaF。

1.3 方法

1.3.1 小鼠卵母細(xì)胞及胚胎獲取

ICR 雌性小鼠于下午注射孕馬血清促性腺激素(PMSG) ，48 h 后注射人絨毛膜促性腺激素(hCG) 后合籠，次日檢查陰道栓。頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，按超排及見栓時(shí)間分別獲取卵巢、輸卵管、子宮置于PBS中，收集卵母細(xì)胞及胚胎。

1.3.2 mRNA 提取以及RT-PCR

使用微量mRNA 磁珠提取試劑盒提取mRNA。預(yù)制磁珠，加入100 μL裂解液將樣品完全溶解，之后加入20 μL 預(yù)制的磁珠，室溫混勻5 min; 置于磁鐵上去除懸液，加100 μL洗滌液A，重懸洗滌2 次; 去懸液后加100 μL洗滌液B，轉(zhuǎn)移至新離心管，洗滌2 次; 使用13 μL去RNA 酶的水重懸，保持置于冰上。加入預(yù)制反轉(zhuǎn)錄體系，37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃、5 s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，備用。

1.3.3 免疫印記

加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，離心后測(cè)定蛋白濃度，取20 μg組織總蛋白(卵母細(xì)胞及胚胎則分別各取100 個(gè)) 上樣; 120 V 電泳2 h至結(jié)束，之后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h; 一抗1 ∶1 000 稀釋，4 ℃過夜孵育; 次日PBST 洗滌3 次，每次5 min; 隨后二抗室溫孵育1 h，洗滌3 次后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色、曝光。

1.3.4 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)

收集卵母細(xì)胞和胚胎，4%多聚甲醛固定1 h，PBS 洗滌3 次后置于0.1% Triton X-100 中打孔1 h; PBS 洗滌3 次，5%驢血清室溫封閉1 h 后，1∶100 加入U(xiǎn)BE2C 抗體4 ℃孵育過夜; 洗滌3 次，每次5 min，二抗1∶200 稀釋，室溫孵育1 h 后，再次洗滌3次后置于PBS 稀釋的染料(Hoechst，2 μg/mL) 中染核10 min，壓片備用。

1.3.5 UBE2C 過表達(dá)載體構(gòu)建

通過兩步法構(gòu)建UBE2C 和綠色熒光蛋白獨(dú)立表達(dá)的體外轉(zhuǎn)錄載體。以卵巢cDNA為模板，用高保真DNA 聚合酶擴(kuò)增全長的Ube2c ORF 序列，經(jīng)過EcorI 和BamHI 雙酶切后插入到真核表達(dá)載體Pirse2- Zsgreen1中。構(gòu)建成功的質(zhì)粒，測(cè)序正確后，通過PCR 將ube2c- IRES- GFP 序列擴(kuò)增，經(jīng)EcorI 和AscIS 雙酶切連接到可以體外轉(zhuǎn)錄的經(jīng)改造后的Pcs2(+)-myc 載體中。陽性克隆測(cè)序。正確的克隆線性化后備用。

1.3.6 mRNA 轉(zhuǎn)錄及顯微注射

使用 mMESSAGE mMACHZNE kit(Ambion) 轉(zhuǎn)錄UBE2C- eGFP mRNA，使用RNeasy MinElute Cleamup Kit(QiaGen) 純化回收。分別制備固定針外徑約80 μm、內(nèi)徑20 μm，注射針外徑小于1 μm。單個(gè)受精卵注射約5 pL mRNA，之后置于KOSM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 UBE2C 在小鼠組織中的mRNA 與蛋白表達(dá)

如圖1 所示，UBE2C 的mRNA 以及蛋白水平在小鼠脾臟組織中的表達(dá)最高，在子宮以及卵巢中呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平。在腦、肌肉、心臟等器官均無明顯表達(dá)。提示UBE2C 在小鼠脾臟以及雌性生殖系統(tǒng)中具有重要作用。

圖1 UBE2C 在小鼠組織中的表達(dá)模式a，RT-PCR 顯示mRNA 表達(dá)水平b，UBE2C 在組織中的蛋白表達(dá)水平

2.2 UBE2C 在小鼠卵母細(xì)胞以及早期胚胎中的表達(dá)圖譜

以前的研究表明，卵母細(xì)胞在成熟過程中不斷積累母源物質(zhì)，這些母源物質(zhì)在隨后的受精、卵裂中具有重要作用。母源RNA以及蛋白質(zhì)在卵母細(xì)胞向合子轉(zhuǎn)變過程中被逐漸降解。UBE2C 作為一種泛素偶聯(lián)酶，能夠降解一些短周期底物蛋白。其在小鼠卵巢中也呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平，通過RT- PCR以及免疫熒光分析UBE2C 從小鼠卵母細(xì)胞到囊胚的發(fā)育過程，如圖2a 所示，其mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平在受精之后均呈現(xiàn)逐漸上升，在桑椹胚時(shí)到達(dá)最高，隨后在囊胚時(shí)期下降到較低水平(圖2) 。提示UBE2C 可能具有降解母源物質(zhì)的作用，從而促進(jìn)小鼠早期胚胎發(fā)育進(jìn)程順利進(jìn)行。

圖2 UBE2C 在卵母細(xì)胞以及早期胚胎中的表達(dá)

2.3 過表達(dá)UBE2C 導(dǎo)致2-細(xì)胞發(fā)育阻滯

構(gòu)建UBE2C-EGFP 過表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)錄純化RNA 后，注射入受精卵中并置于KSOM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，之后檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)來選取過表達(dá)UBE2C 的胚胎。如圖3 結(jié)果表明，與注射去離子水的對(duì)照組相比，過表達(dá)UBE2C 后所有胚胎均停滯在2-3細(xì)胞，對(duì)照組均達(dá)到桑椹胚時(shí)期。提示卵母細(xì)胞在注射入U(xiǎn)BE2C 后可能發(fā)揮了泛素化E2 酶的功能，對(duì)包含母源蛋白在內(nèi)的一些蛋白進(jìn)行降解，從而引起胚胎卵裂、合子基因組啟動(dòng)障礙，導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育停滯。

圖3 受精卵過表達(dá)UBE2C 并培養(yǎng)2 d 后導(dǎo)致2-細(xì)胞發(fā)育阻滯

3 討論

由于在臨床腫瘤以及癌細(xì)胞系中，均能檢測(cè)到UBE2C 的顯著異常升高［13］，提示著UBE2C 可能與癌變以及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。Okamoto Y，Pallantep 等 人［14］相繼證明，UBE2C 的高表達(dá)加快細(xì)胞生長速率，促進(jìn)增殖，使得UBE2C 在體細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控以及癌癥相關(guān)作用取得了更多的關(guān)注。但對(duì)其在胚胎中的功能卻知之甚少。受精卵作為一種全能性細(xì)胞，UBE2C 在其卵裂過程中發(fā)揮了什么樣的功能仍然未知。通過構(gòu)建UBE2C 過表達(dá)載體，之后體外轉(zhuǎn)錄mRNA并注射入胚胎中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)UBE2C能導(dǎo)致胚胎發(fā)生2-3 細(xì)胞阻滯，提示其在胚胎中的功能與癌細(xì)胞系中不盡相同。既往研究表明，早期胚胎發(fā)育需要多種母源蛋白的參與，這些母源物質(zhì)在隨后的卵裂、去甲基化、合子基因組激活等過程中具有重要作用，過早的缺失母源物質(zhì)均能導(dǎo)致胚胎阻滯在2-細(xì)胞到囊胚期間的多種時(shí)期。

以上結(jié)果表明，在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中，UBE2C 可能通過降解卵母細(xì)胞儲(chǔ)存的母源物質(zhì)，從而確保小鼠胚胎正常發(fā)育。但其在胚胎中對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用以及是否影響染色體整倍性仍需要進(jìn)一步研究。

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