毛浩萍，牛子長，王興業(yè)，邱燕榮

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

補骨脂酚對人腎上腺皮質癌H295R細胞中睪酮和雌二醇分泌的影響*

毛浩萍1，牛子長2，王興業(yè)1，邱燕榮1

（1.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]研究補骨脂酚對人腎上腺皮質細胞（H295R）睪酮及雌二醇分泌的影響。[方法]實驗分為空白對照組及補骨脂酚不同濃度組，分別使用CCK-8法及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測補骨脂酚對H295R細胞活力、睪酮和雌二醇分泌的影響；同時采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應法（Real-time PCR）檢測補骨脂酚對睪酮和雌二醇合成酶CYP17A1和CYP19A1 mRNA表達的影響。[結果]補骨脂酚對睪酮合成酶CYP17A1 mRNA無顯著影響，但能上調雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA含量，具有減少睪酮分泌增加雌二醇分泌的作用。[結論]補骨脂酚促進H295R細胞中雌激素的產生。

補骨脂酚；腎上腺皮質細胞；睪酮；雌二醇

補骨脂為補陽類中藥，具有補腎助陽，固精縮尿，暖脾止瀉，納氣平喘的功效。中醫(yī)臨床主要用于腎陽不足，命門火衰，腰膝冷痛，脾腎陽虛，泄瀉及腎不納氣的虛喘等癥的治療?，F(xiàn)代化學成分研究發(fā)現(xiàn)補骨脂含有多種活性成分，包括香豆素類、黃酮類、單萜酚類及尿嘧啶、豆甾醇類化合物等[1-3]。補骨脂酚是補骨脂中一個含量較高的單萜酚類化合物，補骨脂酚在補骨脂中含量較高，約為1%～7%。研究顯示補骨脂酚具有抗氧化應激、抗炎、抗腫瘤及肝保護等作用[4-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂酚具有植物雌激素樣作用，能劑量依賴性激活雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ），且對ERβ表現(xiàn)出很強的選擇性[8]。同時，也發(fā)現(xiàn)補骨脂酚能雙向調節(jié)牛腎上腺髓質細胞兒茶酚胺分泌，提示補骨脂酚可能具有抗抑郁樣作用[9]。補骨脂酚經由雄激素受體抑制雄激素依賴的前列腺癌細胞增殖[10]。腎上腺皮質中，酶CYP19A1能催化睪酮生成雌激素雌二醇[11]。補骨脂酚是否能調節(jié)腎上腺皮質中雌激素的分泌未見相關報道。因此，本研究使用人腎上腺皮質癌H295R細胞，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應法（Real-time PCR）檢測補骨脂酚對H295R細胞中睪酮和雌二醇分泌及上述類固醇激素合成的催化酶mRNA含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 H295R細胞購自ATCC（美國），補骨脂酚由本課題組自補骨脂中提取分離，經高效液相色譜法分析其中補骨脂酚純度大于97%?；A培養(yǎng)液DMEM/F12（Gibco，美國），雙抗（75 U/mL青霉素，75 μg/mg鏈霉素，Hyclone），Ⅳ組分無血清培養(yǎng)物（Nu-serumⅣ）及胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉（ITS）細胞培養(yǎng)補充物購自BD公司，0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國），細胞活力試劑盒（CCK-8）（日本同仁公司），睪酮及雌二醇ELISA檢測試劑盒購自DRG，cDNA合成試劑盒（TaqMan Reverse Transcription Rengents）購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自羅氏。CYP17A1 ANP mRNA引物序列：AGCCGCACACC AACTATCAG（上游），TCACCGATG CTGGAGTCAAC（下游）；CYP19A1 mRNA引物序列：AGGTGCTAT TTGTCATCTGCTC（上游），TGGTG GAATCGGGTCT TTATGG（下游）；人GAPDH mRNA引物序列：AGGT CGGAGTCAACGGATTTGG（上游），GCTCCTGGAAG ATGGTGATGGG（下游）。

1.2 細胞培養(yǎng) 細胞完全培養(yǎng)：全培基含97.5%的基礎培養(yǎng)液，2.5%無血清培養(yǎng)物Nu-serum IV及0.1%的ITS細胞培養(yǎng)補充物。H295R細胞株培養(yǎng)于上述完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每4～5 d按1∶4傳代1次。每周換液2～3次。取對數生長期、生長良好的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組 H295R細胞胰酶消化后使用完全培養(yǎng)基種于24孔板或12孔板中。24 h后分為對照組及補骨脂酚10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5mol/L濃度組。

1.4 補骨脂酚對H295R細胞活性的影響 調整細胞濃度為105個/mL種于96孔板中，24 h后細胞加入不同濃度的補骨脂酚（終濃度為10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5mol/L）孵育24 h。棄上清，加入CCK-8（終濃度V∶V 1∶10）孵育0.5 h后，450 nm處測定吸光值。

1.5 細胞分泌的睪酮和雌二醇含量的檢測 調整細胞濃度為106個/mL，種于12孔板中過夜，根據CCK-8實驗結果選擇對細胞活性無顯著變化的補骨脂酚濃度（終濃度為10-7、3×10-7、10-6mol/L）孵育24 h。1 000 r/min離心5 min后取細胞上清按ELISA試劑盒說明檢測睪酮和雌二醇含量。

1.6 Real-time PCR法檢測CYP17A1和CYP19A1 mRNA含量 調整細胞濃度為106個/mL，種于12孔板中過夜，根據CCK-8實驗結果選擇對細胞活性無顯著變化的補骨脂酚濃度（終濃度為10-7，3×10-7、10-6mol/L）孵育24 h。1 000 r/min離心5 min后棄上清，提取細胞總RNA，按反轉錄試劑盒及擴增試劑盒操作進行Real-time PCR實驗。擴增反應條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min,40個循環(huán)。循環(huán)擴增結束后，記錄各組Ct值，根據2-ΔΔCt法計算各組相對mRNA含量。

1.7 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 18.0軟件包進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 補骨脂酚對H295R細胞活性的影響 與空白對照組相比，3×10-6、10-5mol/L補骨脂酚顯著抑制H295R細胞活性（P＜0.01）；10-7、3×10-7、10-6mol/L補骨脂酚孵育24 h對H295R細胞活性無顯著影響，見表1。因此，選擇使用10-7、3×10-7、10－6mol/L補骨脂酚進行后續(xù)實驗。

2.2 補骨脂酚對H295R細胞中睪酮和雌二醇分泌的影響 與空白對照組比較，補骨脂酚（10-7、3×10-7、 10-6mol/L）顯著抑制H295R細胞中睪酮分泌（P＜0.01），見表2。與空白對照組相比，補骨脂酚（3×10-7、10-6mol/L）顯著促進H295R細胞中雌二醇分泌（P＜0.01），見表2。

表1 補骨脂酚對H295R細胞增殖的影響（±s）

表1 補骨脂酚對H295R細胞增殖的影響（±s）

注：與空白對照組相比，**P＜0.01。n=3，重復3次，結果趨勢一致。

組別 濃度（mol/L） 吸光值空白對照組- 0.259 2±0.019 2補骨脂酚 3×10-70.244 7±0.012 9 3×10-70.241 7±0.012 9 3×10-60.235 8±0.028 9 3×10-60.208 6±0.018 9** 3×10-50.122 6±0.019 1**

表2 補骨脂酚對H295R細胞睪酮和雌二醇分泌的影響（±s） %

表2 補骨脂酚對H295R細胞睪酮和雌二醇分泌的影響（±s） %

注：與空白對照組相比，**P＜0.01。n=3，結果重復3次，趨勢一致。

組別 濃度（mol/L） 睪酮 雌二醇空白對照組- 100.00±7.96 100.00±16.33補骨脂酚 3×10-7080.81±9.81** 109.53±19.02 3×10-7064.78±4.01** 126.92±10.07** 3×10-6060.11±7.04** 138.62±17.77**

2.3 補骨脂酚對 H295R細胞中 CYP17A1和CYP19A1mRNA表達的影響 結果顯示，與空白對照組相比，補骨脂酚（10-7、3×10-7、10-6mol/L）對H295R細胞中CYP17A1mRNA表達無顯著影響。與空白對照組相比，補骨脂酚（3×10-7、10-6mol/L）顯著上調H295R細胞中CYP19A1 mRNA表達（P＜0.01），見表3。

表3 補骨脂酚對H295R細胞CYP17A1和CYP19A1mRNA表達的影響（±s）

表3 補骨脂酚對H295R細胞CYP17A1和CYP19A1mRNA表達的影響（±s）

注：與空白對照組相比，**P＜0.01。n=3，結果重復3次，趨勢一致。

組別 濃度（mol/L） CYP17A1 mRNA CYP19A1 mRNA空白對照組- 1.00±0.10 1.01±0.17補骨脂酚 10-71.02±0.02 1.01±0.09 3×10-70.94±0.06 1.52±0.09** 10-61.01±0.02 2.02±0.46**

3 討論

H295R細胞來源于人腎上腺皮質瘤，它具有上皮細胞的形態(tài)，呈單層貼壁生長。所有類固醇激素合成過程必需的催化酶均在H295R細胞中有表達，因而H295R細胞具有分泌各種腎上腺皮質激素的特性，如能分泌孕激素、雄激素、雌激素、糖皮質激素和鹽皮質激素等[12]。同時它對有毒物質的反應水平與正常的人腎上腺細胞對有毒物質的反應水平相比是一致的。因此，H295R細胞系成為了體外篩選具有調節(jié)腎上腺皮質類固醇激素作用相關藥物的有力工具[13]，同時也為體外研究藥物調節(jié)類固醇激素分泌的作用機制提供了可能。

腎上腺皮質能分泌包括鹽皮質類固醇、糖皮質激素類固醇以及腎上腺性激素等多種調節(jié)機體物質代謝相關的激素，參與機體對一切有害刺激的應激反應。腎上腺皮質中的各種皮質類固醇激素均由統(tǒng)一的前體膽固醇在不同合成酶的催化下合成而來。研究顯示腎上腺皮質中的雄性激素睪酮能在酶CYP19A1的催化下生成雌二醇。正常生理條件下，腎上腺皮質并非是雌激素的直接重要來源。但是，婦女進入更年期后卵巢功能逐步衰退導致體內雌二醇水平急劇下降，此時從腎上腺皮質雄激素轉化而來的雌二醇是絕經期后婦女體內雌二醇的主要來源。研究顯示補骨脂中多種成分具有類雌激素樣作用[14-15]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂中補骨脂酚具有類雌激素樣作用，當前研究顯示補骨脂酚顯著抑制H295R細胞中睪酮分泌，同時促進細胞雌二醇分泌。檢測上述兩種類固醇激素合成酶CYP17A1和CYP19A1 mRNA含量發(fā)現(xiàn)，補骨脂酚對睪酮合成的催化酶CYP17A1 mRNA水平無明顯影響，顯著提高雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA，提示補骨脂酚調節(jié)腎上腺皮質中雌性激素分泌的作用可能與調節(jié)雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA水平有關，這與補骨脂改善初老小鼠體內雌孕激素水平等作用的報道是一致的[16]。

雌激素尤其是17β-雌二醇是許多靶組織生長、分化以及行使生物學功能的關鍵調節(jié)因子。研究顯示雌激素具有降血脂、抗氧化、保護內皮、抑制血管平滑肌細胞增殖等活性，雌激素還能調節(jié)CA類神經遞質的合成、分泌及重吸收，從而具有心血管保護、抗抑郁等作用[17-18]。課題組研究發(fā)現(xiàn)補骨脂酚能顯著促進腎上腺皮質中的雄激素向雌激素的轉化，從而上調雌激素的分泌水平，課題組以往的研究也發(fā)現(xiàn)補骨脂酚具有潛在的抗抑郁樣作用[6]，其作用是否與補骨脂酚調節(jié)腎上腺皮質細胞中雌性激素分泌有關仍有待于進一步研究。

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Effects of bakuchiol on secretion of testosterone and estradiol from H295R cells in human with carcinoma of adrenal cortex

MAO Hao-ping1,NIU Zi-chang2,WANG Xing-ye1,QIU Yan-rong1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

[Objective]To study the effects of bakuchiol on testosterone and estradiol secretion from H295R cells.[Methods]The researches were divided into control group and bakuchiol groups.The effects of bakuchiol on cellular activites and the secretion of testosterone and estradiol were detected by CCK-8 method and ELISA method.The levels of CYP17A1 and CYP19A1 mRNA were also detected by Real-time PCR.[Results]Bakuchiol could not affect CYP17A1 mRNA leverl but could up-regulate CYP19A1 mRNA.Bakuchiol had the effect of decreasing the secretion of testosterone but increasing the secretion of estradiol.[Conclusion]Bakuchiol can stimulate estradiol secretion from H295R cells.

bakuchiol；H295R cell；testosterone；estradiol

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0347-04

2014-07-10）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.08

國家自然科學基金項目（81303247）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金項目（20121210120009）。

毛浩萍（1983-），女，助理研究員，主要從事中藥藥理學研究。

牛子長，E-mail:haoping_mao@126.com。