文 雪
(湖北職業(yè)技術學院護理學院基礎醫(yī)學教研室,湖北 孝感432000)
目前已證實I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有關,自身反應性T細胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機理中起主導作用[1]。移植胰島細胞治療I型糖尿病是一個具有前景的治療策略,然而自身反應性T細胞的存在是胰島移植治療I型糖尿病方法中最大的障礙。程序性死亡分子配體-1(PD-L1)和程序性死亡分子配體-2(PD-L2)已被證實為PD-1的配體[2]。由于PD-L1在非淋巴組織的表達提示PD-L1可以調(diào)節(jié)自身反應性T細胞或B細胞,同時(或者)調(diào)節(jié)靶器官的炎癥反應。有研究表明,PD-L1信號可以介導T細胞的凋亡,在腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)攻擊中起重要的作用。通過抗體阻斷PD-1:PD-L1這條通路可促進NOD鼠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本實驗在前期構建PD-L1表達載體和初步研究其功能的基礎上,進一步研究PD-L1對同種淋巴細胞的負性調(diào)節(jié)作用,通過建立穩(wěn)定表達PD-L1胰島細胞株,觀察PD-L1對同種淋巴細胞增殖的影響,為PD-L1修飾胰島細胞移植重建糖尿病患者胰島細胞功能研究提供新的策略。
NIT-1細胞株(小鼠胰島β細胞株)由澳大利亞WEH1實驗室惠贈,本室傳代培養(yǎng)與保種。pEGFP-N1-PD-L1質(zhì)粒含有表達綠色熒光蛋白(EGFP)基因序列,由本科室構建。陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000購自Invitrogen公司,抗體、CFSE購于美國BD公司。
根據(jù)Lipofectamine2000TM試劑說明書進行。將NIT-1細胞轉種于24孔板中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,使細胞達到50~80%的融合;用無血清培養(yǎng)基分別溶解pEGFP-N1/pEGFP-N1-PD-L1和脂質(zhì)體,將脂質(zhì)體與核苷酸混合,室溫下靜置30min后,在24孔板中加入以上混合液,輕混;培養(yǎng)6h后棄轉染液,加入完全培養(yǎng)基,37℃,5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。流式細胞儀檢測GRP78的表達。
將Balb/c小鼠頸椎脫位處死,無菌取脾臟制備成脾淋巴細胞懸液,加入CFSE(2μmol/L)染色 ,調(diào)整細胞濃度作為同種反應淋巴細胞備用。用0.25%胰酶消化NIT、NIT-PD-L1和NIT-EGFP細胞,洗滌后用DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度,加入無菌絲裂霉素C(終濃度為30μg/ml),調(diào)節(jié)細胞濃度作為刺激細胞備用。將Balb/c小鼠脾細胞懸液(反應細胞)分別加入24孔培養(yǎng)板中,每孔5×106個細胞;將刺激細胞分別加入到24孔培養(yǎng)板中,每孔5×105個細胞;實驗分組:① NIT-PD-L1+淋巴細胞;②NIT-EGFP+淋巴細胞;③NIT+淋巴細胞。反應細胞和刺激細胞懸液培養(yǎng)7天后FCM測定淋巴細胞增殖。
采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0進行方差分析和t檢驗。
pEGFP-N1和pEGFP-N1-PD-L1表達載體分別轉染NIT-1細胞,培養(yǎng)48h后,經(jīng)FCM檢測EGPF和PD-L1的表達。結果顯示:對照組(NIT)EGPF表達率為0,pEGFP-N1轉染NIT細胞組EGPF表達率為 87.2%±5.6,pEGFP-N1-PD-L1 轉 染 NIT 細 胞組 EGPF 表 達率 為88%±6.8; 對照組 (NIT)PD-L1 表達率為 5.4%±0.8,pEGFP-N1 轉染NIT 細胞組 PD-L1 表達率為 4.8%±1.5,pEGFP-N1-PD-L1 轉染 NIT細胞組 PD-L1 表達率為 90%±5.3(P<0.01)。
CFSE染色流式細胞儀檢測結果顯示:NIT-PD-L1+淋巴細胞組增殖指數(shù)為(4.5±1.6);NIT-EGFP+淋巴細胞組增殖指數(shù)為(9.1±2.1);NIT+淋巴細胞組增殖指數(shù)為(8.5±3.1)。 結果說明 PD-L1 可以抑制同種淋巴細胞增殖,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
PD-L1是正性或負性調(diào)節(jié)T細胞受體(TCR)介導的信號通路B7家族成員之一[4]。一些體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn),在非肥胖糖尿?。∟OD)小鼠,體內(nèi)應用拮抗的單克隆抗體(mAb)阻斷B7-H1可以活化效應T細胞,結果促進了自身免疫性糖尿病的發(fā)生發(fā)展,在半抗原誘導的小鼠接觸性過敏反應模型或?qū)嶒炐宰陨砻庖咝阅X脊髓炎模型中,B7-H1基因敲除同樣促進了自身免疫性疾病的、發(fā)生發(fā)展[5-6]。以上結果說明,PD-L1在同種免疫應答中的重要負性調(diào)節(jié)功能。本實驗以PD-L1真核表達載體轉染NIT-1細胞作為體外細胞模型,研究PD-L1的負性調(diào)節(jié)功能。從細胞混合培養(yǎng)結果可以看出,PD-L1抑制淋巴細胞的增殖,提示PD-L1抑制反應性淋巴細胞的活化。本實驗證明PD-L1對同種免疫應答具有負性調(diào)節(jié)功能,并初步探討了其機制,對于誘導并維持免疫耐受具有一定作用。
[1]Atkinson MA,Kaufman DL,Campbell L,et al.Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J].Lancet,1992:339,458.
[2]Freeman GJ,Long AJ,Iwai Y,et al.Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J].J.Exp.Med.,2000:192,1027.
[3]Ansari MJ,Salama AD,Chitnis T,Smith RN,Yagita H,Akiba H,Yamazaki T,Azuma M,Iwai H,Khoury SJ,Auchincloss H Jr,Sayegh MH.The Programmed Death-1 (PD-1)Pathway Regulates Autoimmune Diabetes in Nonobese Diabetic(NOD)Mice[J].J Exp Med.,2003:63,69.
[4]Chen L.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J].Nat Rev Immunol,2004,4:336-47.
[5]Dong H,Strome SE,Salomao DR et al.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis:a potential mechanism of immune evasion[J].Nat Med.,2002,8:793-800.
[6]Latchman YE,Liang SC,Wu Y et al.PD-L1-deficient mice show that PD-L1 on T cells,antigen-presenting cells,and host tissues negatively regulates T cells[J].Proc Natl Acad Sci.USA,2004,101:10691-6.