文 雪

（湖北職業(yè)技術學院護理學院基礎醫(yī)學教研室，湖北 孝感432000）

目前已證實I型糖尿病和自身免疫耐受缺失有關，自身反應性T細胞在I型糖尿病的免疫發(fā)病機理中起主導作用[1]。移植胰島細胞治療I型糖尿病是一個具有前景的治療策略，然而自身反應性T細胞的存在是胰島移植治療I型糖尿病方法中最大的障礙。程序性死亡分子配體-1（PD-L1）和程序性死亡分子配體-2（PD-L2）已被證實為PD-1的配體[2]。由于PD-L1在非淋巴組織的表達提示PD-L1可以調(diào)節(jié)自身反應性T細胞或B細胞，同時（或者）調(diào)節(jié)靶器官的炎癥反應。有研究表明，PD-L1信號可以介導T細胞的凋亡，在腫瘤細胞逃逸免疫系統(tǒng)攻擊中起重要的作用。通過抗體阻斷PD-1：PD-L1這條通路可促進NOD鼠糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本實驗在前期構建PD-L1表達載體和初步研究其功能的基礎上，進一步研究PD-L1對同種淋巴細胞的負性調(diào)節(jié)作用，通過建立穩(wěn)定表達PD-L1胰島細胞株，觀察PD-L1對同種淋巴細胞增殖的影響，為PD-L1修飾胰島細胞移植重建糖尿病患者胰島細胞功能研究提供新的策略。

1 材料

NIT-1細胞株（小鼠胰島β細胞株）由澳大利亞WEH1實驗室惠贈，本室傳代培養(yǎng)與保種。pEGFP-N1-PD-L1質(zhì)粒含有表達綠色熒光蛋白（EGFP）基因序列，由本科室構建。陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，抗體、CFSE購于美國BD公司。

2 實驗方法

2.1 轉染PD-L1基因的NIT-1細胞穩(wěn)定子篩選

根據(jù)Lipofectamine2000TM試劑說明書進行。將NIT-1細胞轉種于24孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞達到50～80%的融合；用無血清培養(yǎng)基分別溶解pEGFP-N1/pEGFP-N1-PD-L1和脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體與核苷酸混合，室溫下靜置30min后，在24孔板中加入以上混合液，輕混；培養(yǎng)6h后棄轉染液，加入完全培養(yǎng)基，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)。流式細胞儀檢測GRP78的表達。

2.2 CFSE染色檢測PD-L1修飾NIT細胞對同種淋巴細胞增殖影響

將Balb/c小鼠頸椎脫位處死，無菌取脾臟制備成脾淋巴細胞懸液，加入CFSE（2μmol/L）染色 ，調(diào)整細胞濃度作為同種反應淋巴細胞備用。用0.25%胰酶消化NIT、NIT-PD-L1和NIT-EGFP細胞，洗滌后用DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度，加入無菌絲裂霉素C（終濃度為30μg/ml），調(diào)節(jié)細胞濃度作為刺激細胞備用。將Balb/c小鼠脾細胞懸液（反應細胞）分別加入24孔培養(yǎng)板中，每孔5×106個細胞；將刺激細胞分別加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔5×105個細胞；實驗分組：① NIT-PD-L1+淋巴細胞；②NIT-EGFP+淋巴細胞；③NIT+淋巴細胞。反應細胞和刺激細胞懸液培養(yǎng)7天后FCM測定淋巴細胞增殖。

2.3 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0進行方差分析和t檢驗。

3 實驗結果

3.1 穩(wěn)轉NIT-1細胞中EGPF或PD-L1的表達

pEGFP-N1和pEGFP-N1-PD-L1表達載體分別轉染NIT-1細胞，培養(yǎng)48h后，經(jīng)FCM檢測EGPF和PD-L1的表達。結果顯示：對照組（NIT）EGPF表達率為0，pEGFP-N1轉染NIT細胞組EGPF表達率為 87.2%±5.6，pEGFP-N1-PD-L1 轉 染 NIT 細 胞組 EGPF 表 達率 為88%±6.8； 對照組 （NIT）PD-L1 表達率為 5.4%±0.8，pEGFP-N1 轉染NIT 細胞組 PD-L1 表達率為 4.8%±1.5，pEGFP-N1-PD-L1 轉染 NIT細胞組 PD-L1 表達率為 90%±5.3（P＜0.01）。

3.2 PD-L1可顯著抑制同種淋巴細胞增殖

CFSE染色流式細胞儀檢測結果顯示：NIT-PD-L1+淋巴細胞組增殖指數(shù)為（4.5±1.6）；NIT-EGFP+淋巴細胞組增殖指數(shù)為（9.1±2.1）；NIT+淋巴細胞組增殖指數(shù)為（8.5±3.1）。 結果說明 PD-L1 可以抑制同種淋巴細胞增殖，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

4 討論

PD-L1是正性或負性調(diào)節(jié)T細胞受體（TCR）介導的信號通路B7家族成員之一[4]。一些體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，在非肥胖糖尿?。∟OD）小鼠，體內(nèi)應用拮抗的單克隆抗體（mAb）阻斷B7-H1可以活化效應T細胞，結果促進了自身免疫性糖尿病的發(fā)生發(fā)展，在半抗原誘導的小鼠接觸性過敏反應模型或?qū)嶒炐宰陨砻庖咝阅X脊髓炎模型中，B7-H1基因敲除同樣促進了自身免疫性疾病的、發(fā)生發(fā)展[5-6]。以上結果說明，PD-L1在同種免疫應答中的重要負性調(diào)節(jié)功能。本實驗以PD-L1真核表達載體轉染NIT-1細胞作為體外細胞模型，研究PD-L1的負性調(diào)節(jié)功能。從細胞混合培養(yǎng)結果可以看出，PD-L1抑制淋巴細胞的增殖，提示PD-L1抑制反應性淋巴細胞的活化。本實驗證明PD-L1對同種免疫應答具有負性調(diào)節(jié)功能，并初步探討了其機制，對于誘導并維持免疫耐受具有一定作用。

［1］Atkinson MA,Kaufman DL,Campbell L,et al.Response of peripheral-blood mononuclear cells to glutamate decarboxylase in insulin-dependent diabetes[J].Lancet,1992：339,458.

［2］Freeman GJ,Long AJ,Iwai Y,et al.Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J].J.Exp.Med.,2000：192,1027.

［3］Ansari MJ,Salama AD,Chitnis T,Smith RN,Yagita H,Akiba H,Yamazaki T,Azuma M,Iwai H,Khoury SJ,Auchincloss H Jr,Sayegh MH.The Programmed Death-1 (PD-1)Pathway Regulates Autoimmune Diabetes in Nonobese Diabetic(NOD)Mice[J].J Exp Med.,2003：63,69.

［4］Chen L.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J].Nat Rev Immunol,2004,4：336-47.

［5］Dong H,Strome SE,Salomao DR et al.Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis：a potential mechanism of immune evasion[J].Nat Med.,2002,8：793-800.

［6］Latchman YE,Liang SC,Wu Y et al.PD-L1-deficient mice show that PD-L1 on T cells,antigen-presenting cells,and host tissues negatively regulates T cells[J].Proc Natl Acad Sci.USA,2004,101：10691-6.