杜雪晴，廖新俤，2＊，吳銀寶，2，陳 偉

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642）

好氧堆肥是一種對有機(jī)物廢棄物進(jìn)行資源化、無害化和穩(wěn)定化處理的經(jīng)濟(jì)高效的方法［1］，目前已在農(nóng)業(yè)固體有機(jī)廢棄物如農(nóng)作物秸稈、養(yǎng)殖畜禽糞便、病死動物尸體等，以及城市生活垃圾如餐廚垃圾、城市污泥等的處理中得到廣泛應(yīng)用。但好氧堆肥過程會造成不同程度的氮素?fù)p失［2－3］，一般氮素?fù)p失量約為初始總氮的16%～76%［4］，其損失途徑包括氨氣揮發(fā)、氧化亞氮和氮?dú)馀欧?、淋溶等形式，其中以氨氣揮發(fā)形式損失的氮素可達(dá)氮素總損失量的44%～99%［3］，特別是在含氮較高的畜禽糞便堆肥中損失更嚴(yán)重。氮素?fù)p失不僅降低了堆肥的農(nóng)用價(jià)值，而且會對環(huán)境產(chǎn)生二次污染，產(chǎn)生臭氣和溫室氣體的排放、酸雨、土壤富營養(yǎng)化等環(huán)境問題。

研究有機(jī)廢棄物堆肥過程中的氮素轉(zhuǎn)化機(jī)制及相關(guān)微生物，有助于減少好氧堆肥過程中的氮素?fù)p失及溫室氣體排放。近年來，關(guān)于自然界氮素循環(huán)的研究取得了重要的進(jìn)展，氮循環(huán)主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用4個(gè)過程［5］，堆肥過程中含氮有機(jī)物易于被微生物分解轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮（NH4＋），銨態(tài)氮被氧化為亞硝態(tài)氮（NO2－ ），再進(jìn)一步氧化為硝態(tài)氮（NO3－ ）完成硝化作用［6］。Matsuno等［7］分析76個(gè)土壤樣品的氮素循環(huán)，都觀察到NH4＋的聚集，但NH4＋→NO2－ 比NO2－ →NO3－要緩慢，是由于亞硝態(tài)氮極不穩(wěn)定，易被氧化為硝態(tài)氮，因此氨氧化是硝化作用的關(guān)鍵限速步驟［8］。自100多年前，細(xì)菌氨氧化作用被首次發(fā)現(xiàn)以來［9］，與氨氧化相關(guān)的微生物學(xué)研究在氮素的生物地球化學(xué)循環(huán)中一直倍受關(guān)注。長期以來，變形菌綱的氨氧化細(xì)菌（Ammonia Oxidizing Bacteria，AOB）被研究者普遍認(rèn)為是地球氮素循環(huán)過程中最主要的承擔(dān)者［10］，然而隨著環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，國內(nèi)外眾多研究者發(fā)現(xiàn)了另一類完全獨(dú)立于AOB 的具有氨氧化能力的微生物－氨氧化古菌（Ammonia Oxidizing Archaea，AOA）［6］，在氮循環(huán)中可能起著非常重要的作用［5，11］。至此，再次引起人們對氨氧化微生物的廣泛關(guān)注和研究。如前所述，在堆肥系統(tǒng)中，氨氧化作用對氮素的轉(zhuǎn)化非常重要，直接影響到堆肥的農(nóng)用價(jià)值及堆肥過程中氨氣和氧化亞氮的排放。因此本文介紹了好氧堆肥系統(tǒng)中的兩種主要氨氧化微生物AOB和AOA 的生理生態(tài)特性及其影響因素，總結(jié)了堆肥過程中氨氧化微生物對氮素轉(zhuǎn)換的作用和可能的調(diào)控措施，以期為今后氨氧化微生物在堆肥系統(tǒng)中的應(yīng)用提供參考。

1 好氧堆肥系統(tǒng)中氨氧化微生物的種類及特性

目前，自然界中發(fā)現(xiàn)的氨氧化微生物主要有好氧氨氧化細(xì)菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）和厭氧氨氧化細(xì)菌（anaerobic ammonium oxidation，Anammox）。其中AOA 和AOB都能將氨氧化為亞硝酸鹽，它們廣泛分布在海洋、土壤和濕地等生態(tài)系統(tǒng)中［12－15］；Anammox屬于浮霉菌門，是污水處理中非常重要的細(xì)菌，可以在缺氧環(huán)境中，將銨離子（NH4＋）用亞硝酸根（NO2－）氧化為氮?dú)?，其化學(xué)方程式為NH4＋＋NO2－ →N2＋2H2O，Δ Go ＝－357kJ mol－1［16－17］。這三種細(xì)菌對全球氮循環(huán)具有非常重要意義，目前對好氧堆肥系統(tǒng)中氨氧化微生物的研究主要集中在AOA 和AOB。

1.1 好氧氨氧化細(xì)菌（AOB）

好氧氨氧化細(xì)菌（AOB）屬于變形菌門，是一類能夠在好氧條件下將氨氧化為亞硝酸鹽的化能無機(jī)自養(yǎng)型細(xì)菌，其含有一種可催化銨氧化為羥胺的胞內(nèi)酶即氨單加氧酶（ammonia monooxygenase，amoA），由amoA、amoB和amoC 3個(gè)亞基組成［18］，amoA 基因在氨氧化菌中普遍存在且可作為氨氧化菌特異的分子標(biāo)記［19－20］。通過16SrRNA 基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的好氧氨氧化菌主要屬于β－和γ－Proteobacteria 兩個(gè)亞綱，其中γ－Proteobacteria亞綱適合在海洋環(huán)境中生長［21］，β－Proteobacteria亞綱則適合在淡水環(huán)境中生長，可分為亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和亞硝化螺菌屬（Nitrosopira）［16］。

Maeda等［22］2010年在牛糞堆肥的表面檢測到大量的amoA基因，同年Yamamoto等［23］在牛糞堆肥的研究中發(fā)現(xiàn)AOB的優(yōu)勢種群主要為亞硝化單胞菌屬，孫志遠(yuǎn)［24］和虞泳等［25］分別在牛糞堆肥和秸稈等農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥研究中都發(fā)現(xiàn)Nitrosospira和Nitrosomonas 為AOB 優(yōu)勢種屬，其中Nitrosomonas存在于整個(gè)堆肥過程中，是耐受性較強(qiáng)的種屬，在堆肥體系氨氮的氧化過程中可能發(fā)揮著重要的作用。2012年，Yamamoto等［26］在豬糞堆肥也中檢測到與亞硝化單胞菌屬基因序列相似性較高的AOB，且AOB非?；钴S的參與了堆肥過程的硝化作用，說明AOB對堆肥過程的硝化作用至關(guān)重要。而賀紀(jì)正等［27］在長期施用氮磷鉀肥和有機(jī)質(zhì)肥的土壤生態(tài)系統(tǒng)中檢測到的AOB主要為亞硝化螺菌屬（Nitrosopira），說明在不同陸地生態(tài)系統(tǒng)中AOB的種群分布存在差異。

1.2 氨氧化古菌（AOA）

自Venter等［28］2004年在在海水微生物宏基因組測序中首次發(fā)現(xiàn)泉古菌擁有與硝化細(xì)菌非常類似的amoA基因，提出海洋泉古菌可能具有氨氧化能力以來，激起了廣大學(xué)者對不同生態(tài)環(huán)境中泉古菌氨氧化能力的廣泛關(guān)注。2005年，Treusch等［29］在對土壤泉古菌基因組分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)泉古菌擁有amoA基因，同年，Konneke等［6］成功分離并獲得一株具有氨氧化能力的中溫泉古菌Nitrosopum ilusmaritimus純培養(yǎng)物，繼而Francis等［30］將具有氨氧化能力的泉古菌命名為氨氧化古菌（ammonia－oxidizing archaea，AOA）。

氨氧化古菌屬于泉古門菌，含有氨單加氧酶的全部亞基［29］，是一類完全獨(dú)立于AOB 的進(jìn)化類群。它能將銨態(tài)氮氧化為亞硝態(tài)氮同時(shí)固定二氧化碳，進(jìn)行無機(jī)自養(yǎng)，而且它可以耐受缺氧環(huán)境，是深海海域等缺氧環(huán)境中氨氧化的優(yōu)勢微生物類群［31］。根據(jù)amoA基因序列變異及其所棲息的生態(tài)環(huán)境，可將硝化古菌分為海洋環(huán)境硝化古菌群落、土壤環(huán)境硝化古菌群落、嗜高溫環(huán)境硝化古菌群落3 大類［32］。

最近的研究發(fā)現(xiàn)在土壤［33－34］和海洋［5，13］生態(tài)系統(tǒng)中AOA 的amoA 豐富度通常遠(yuǎn)高于AOB 的amoA，Gannes等［35］在熱帶地區(qū)堆肥系統(tǒng)的研究中也證實(shí)了該結(jié)論。然而也有研究發(fā)現(xiàn)在微好氧條件下的海灣底泥中AOB 數(shù)量高于AOA［36］。2012年Yamamoto等［26］通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在牛糞、雞糞、豬糞三種糞便堆肥過程中檢測到AOB 數(shù)量明顯高于AOA，表明在動物糞便堆肥過程中，AOB可能比AOA 分布更廣泛。由此可見，AOA 廣泛存在于不同生態(tài)系統(tǒng)中，對自然界中氨的氧化具有重要作用，但不同生態(tài)系統(tǒng)中AOA 和AOB的分布存在差異。

此外，Yamamoto等［37］利用16srRNA 序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)在牛糞堆肥過程中分離出的AOA 與豬糞、雞糞堆肥過程分離的Candidatus Nitrososphaera相似性高達(dá)99%，PCR－DGGE 表明牛糞堆肥過程中的AOA 明顯多于豬糞和雞糞堆肥，但Yamada等［38］2013年在銨含量較高的牛糞堆肥過程中卻未能檢測到AOA。

解開治等［39］在雞糞好氧堆肥中發(fā)現(xiàn)總氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮對AOA 群落結(jié)構(gòu)的演替影響顯著。

盡管環(huán)境中存在大量的AOA，但由于其在實(shí)驗(yàn)室條件下難培養(yǎng)，目前只有少數(shù)AOA 菌群被鑒定出來，因此其生理生態(tài)學(xué)特性還有待進(jìn)一步研究。

2 堆肥過程理化指標(biāo)對氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

堆肥過程一般分為升溫階段、高溫階段、降溫階段和腐熟階段4個(gè)階段［40］，每一階段堆肥的溫度、銨濃度、pH 等理化指標(biāo)都存在顯著差異，而堆肥中微生物的組成和群落結(jié)構(gòu)與這些理化指標(biāo)密切相關(guān)。孫志遠(yuǎn)［24］在牛糞堆肥過程中對氨氧化細(xì)菌數(shù)量與牛糞堆肥理化參數(shù)分析表明，堆體溫度、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮對氨氧化細(xì)菌數(shù)量有著顯著影響；虞泳等［25］在秸稈等農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥中基于手動選擇的RDA 分析結(jié)果也表明，堆體溫度、NH4＋－N 和NO3－－N 對AOB群落演替有著顯著的影響（P＜0.05），且前兩個(gè)因子達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）?？梢?，有機(jī)廢棄物堆肥過程中堆體物料理化性質(zhì)的改變會影響AOA 和AOB 的種類和群落結(jié)構(gòu)，這些參數(shù)的有效控制對有機(jī)廢棄物好氧堆肥過程中氨氧化微生物活性的調(diào)控具有重要的意義。

2.1 溫度

溫度是影響微生物生長和生存的最主要的環(huán)境因素之一［41］，對堆肥體系中氨氧化微生物種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響。Yamamoto［26］研究發(fā)現(xiàn)，在牛糞堆肥中AOB 的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，在高溫階段（＞60 ℃），Nitrosomonas europaea cluster為優(yōu)勢菌群，在溫度降低時(shí)則出現(xiàn)了Nitrosomonas spp.Cluster；AOA 菌群則在溫度降低時(shí)開始出現(xiàn)，且AOA 的amoA 基因數(shù)為3.2～3.9×107，明顯高于AOB的amoA 基因數(shù)2.2～3.2×106；通過16s rRNA 序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，牛糞堆肥中AOA的基因序列與土壤及沉淀物中的AOA 相似。

在稻草秸稈和蔬菜葉混合的農(nóng)業(yè)固體廢棄物堆肥中［42］，全程都能檢測到AOA 的amoA 基因，且AOA 在高溫和降溫階段占主導(dǎo)地位；AOB 的amoA 基因則在高溫和降溫階段下降到不能檢出。此外，AOA 和AOB的amoA 基因豐富度與潛在的氨氧化作用都存在線性相關(guān)性，AOB在中溫和腐熟階段與氨氧化作用存在顯著線性相關(guān)，說明在堆肥過程中AOA 和AOB 都非?；钴S的參與了堆肥過程的硝化作用。虞泳在秸稈等農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥中發(fā)現(xiàn)AOB 群落的Shannon－Weaver指數(shù)初始值為2.58，堆肥結(jié)束時(shí)為2.02，多樣性整體呈下降趨勢，通過對部分優(yōu)勢條帶進(jìn)行克隆測序，AOB群落結(jié)構(gòu)在堆肥高溫期前期（4～9d）變化較小，而在高溫期后期（9～12d）特別是降溫期（12～25d）演替尤為劇烈［25］。由此可見堆肥過程中溫度對AOA 和AOB的群落組成和動態(tài)變化有很大影響，但在不同堆肥系統(tǒng)中高溫和低溫階段AOA 和AOB 的群落組成存在差異，這可能與不同堆肥系統(tǒng)中銨離子濃度、pH、C／N 等有差異有關(guān)。

2.2 銨離子濃度

銨作為氨氧化微生物的間接底物，其濃度與氨氧化微生物的數(shù)量和種類有直接關(guān)系［43］，Burrell［44］的研究表明，不同銨離子濃度的氨氧化菌富集培養(yǎng)物樣品中檢測出不同的氨氧化菌種屬，且在牛糞［24］、秸稈［45］等農(nóng)業(yè)廢棄物好癢堆肥的研究都表明在有機(jī)廢棄物好氧堆肥中氨氮對AOB 群落結(jié)構(gòu)的演替達(dá)到顯著水平。

有研究發(fā)現(xiàn)高濃度銨態(tài)氮具有抑制嗜溫硝化古菌同化CO2的能力，說明高濃度銨態(tài)氮可能抑制氨氧化能力［46］。Yamada［38］在銨態(tài)氮含量較高的牛糞堆肥中的各個(gè)階段都檢測不到AOA，但在中溫階段能檢測到豐富的AOB；孫志遠(yuǎn)［24］在牛糞堆肥中同樣也證實(shí)了AOA 的存在，不過只在堆肥后期發(fā)現(xiàn)有該菌的存在，這種現(xiàn)象可能是堆肥其它時(shí)期中銨態(tài)氮的含量較高造成的，所獲得的AOA amoA 基因序列都屬于泉古菌門（Crenarcharota），AOA 群落結(jié)構(gòu)比較單一；Di等［47］研究AOA 和AOB 在不同土壤氮條件下的生長情況時(shí)發(fā)現(xiàn)AOB 可以在高銨離子濃度的土壤中生長，而AOA 適于在較低銨離子濃度的土壤中生長，說明AOB 對銨離子濃度的適應(yīng)范圍較AOA 的適應(yīng)范圍廣。

此外，在處理豬廢水的濕地中，AOB 的數(shù)量與NH4＋和NO3－ 的濃度具有很高的相關(guān)性［48］，在高鈣草原土壤中銨態(tài)氮濃度的升高會顯著促進(jìn)AOA的amoA 基因表達(dá)量［29］，稻田土壤中氮肥的施用也會顯著促進(jìn)AOA 的生長和表達(dá)活性［49］，但也有研究發(fā)現(xiàn)在長期施用氮肥的堿性砂質(zhì)土壤或高氮草原土壤中，AOA 的豐富度和活性并沒有隨銨態(tài)氮濃度的升高而增加，而AOB的數(shù)量和活性不僅與土壤硝化活性正相關(guān)，而且隨土壤銨態(tài)氮濃度的升高而升高［50］。說明銨態(tài)氮濃度會影響到土壤生態(tài)系統(tǒng)中AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)和活性，且銨態(tài)氮濃度較高的生態(tài)系統(tǒng)中AOB對硝化作用的貢獻(xiàn)可能更大。

大量研究表明在牛糞堆肥過程中能同時(shí)檢測到AOA 和AOB［23，26，38］，為研究它們的生物學(xué)特性，Oishi進(jìn)行了液態(tài)牛糞堆肥發(fā)酵試驗(yàn)［51］，在不同溫度（37 ℃、46 ℃、60 ℃）和不同氨濃度（0.5、1、4和10mM NH4＋－N）下觀測它們的生長情況，利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)測定AOB和AOA 的生長速率，研究發(fā)現(xiàn)AOB的最適生長環(huán)境為37 ℃，4或10mM NH4＋－N，通過DGGE 和測序分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群為Nitrosomonas halophila；而AOA 的最適生長環(huán)境為46 ℃，10 mM NH4＋－N，優(yōu)勢菌群主要為Candidatus Nitrososphaera gargensis。此研究首次證明AOA 中的優(yōu)勢菌能在牛糞堆肥過程中的適度高溫下氧化NH3進(jìn)行生長。

2.3 pH

有機(jī)廢棄物的堆肥初期pH 變化較明顯，一般認(rèn)為pH 在7.5～8.5時(shí)，可獲得最大堆肥效率，由于堆肥過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)變化是多因素影響的結(jié)果，因此目前較少單純研究堆肥過程pH 對AOA 和AOB的影響，一般結(jié)合銨態(tài)氮、硝態(tài)氮等理化指標(biāo)研究。

不過大量研究發(fā)現(xiàn)在土壤生態(tài)系統(tǒng)中pH 對AOA 和AOB的群落組成存在影響，雖在不同pH條件下都能檢測到AOA［27，33，52－53］和AOB［54－55］，但其氨氧化能力可能存在差異。Nicol等［52］在不同土壤pH 對AOA 和AOB 豐富度、多樣性、轉(zhuǎn)錄活性的研究中發(fā)現(xiàn)，土壤pH 在4.9～7.5的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)古菌的amoA 基因豐富度會隨著pH 的升高而降低，而細(xì)菌的amoA 基因豐富度一直很低，但會隨著pH 的升高而升高。此外不同pH 下，AOA 和AOB的種群也發(fā)生了變化，這種變化會影響酸性土壤的硝化作用。

2.4 其它因素

有研究表明在污泥和土壤中，有機(jī)質(zhì)可抑制硝化作用［56－57］，也有研究發(fā)現(xiàn)在污水處理器中有機(jī)質(zhì)可降低硝化速率，影響AOB 的群落結(jié)構(gòu)［58－59］。Yang等［30］在家庭垃圾堆肥的中溫階段加入有機(jī)質(zhì)，發(fā)現(xiàn)添加組的NO2－和NO3－比對照組低102～103倍，從N 素平衡的角度發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)的降解對氨氧化有負(fù)面影響，氨氧化細(xì)菌減少，可能是異養(yǎng)型微生物與氨氧化微生物競爭O2的原因，但AOB的生長需要有機(jī)質(zhì)的支撐，所以這些影響機(jī)制需進(jìn)一步討論和研究。此外，有研究發(fā)現(xiàn)海水和淡水中的AOB存在差異［61－62］，說明鹽度對氨氧化細(xì)菌的生長和生理特性也存在一定影響。

3 堆肥系統(tǒng)中AOA 和AOB 對氮素轉(zhuǎn)換的作用及調(diào)控

有機(jī)廢棄物堆肥過程中以氨氣形式損失的氮素所占比例有所不同，它與堆肥過程中的溫度、pH、含水率、C／N 比等多種理化性質(zhì)密切相關(guān)。研究表明，堆肥過程中的銨態(tài)氮可使堆肥物料pH 升高并且易以NH3的形式揮發(fā)，特別是在高溫階段或pH較高時(shí)［63－64］。目前雖然可以通過調(diào)節(jié)pH、改變通風(fēng)或翻堆頻率、添加吸附劑等方式來調(diào)控堆肥過程中氮素的轉(zhuǎn)化，但仍然存在很多問題，因此很多研究者希望通過調(diào)節(jié)堆肥過程中與氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)的微生物來提高堆肥過程中氮素的保留繼而增加肥效，減少環(huán)境污染。

在農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥全過程中，AOA 和AOB 的amoA 基因豐富度與潛在的氨氧化作用都存在線性相關(guān)［42］。在粘土土壤和市政垃圾堆肥中，與氨氧化作用相關(guān)的微生物的群落和豐富度可以作為土壤硝化能力的指標(biāo)［65］，說明氨氧化微生物對有機(jī)廢棄物堆肥過程中硝化作用貢獻(xiàn)很大。已有研究表明在牛糞堆肥過程中經(jīng)過翻堆處理的堆肥樣品中AOB 種類、數(shù)量明顯多于不翻堆處理的堆肥樣品［24］，在堆肥過程中若可以通過改變工藝參數(shù)等方法調(diào)控AOA 和AOB的群落結(jié)構(gòu)，將提高硝化速率，減少氮素的損失。

喻其林［66］在雞糞好氧堆肥中篩選出兩株高效氨氧化霉菌M25～22（Penicillium sp.）與M40～4（Aspergillus sp.），其最適蔗糖濃度分別為12g／L、10g／L，碳源濃度明顯低于通常的霉菌培養(yǎng)基（如查氏培養(yǎng)基）；最適銨態(tài)氮濃度分別為2.438mg／mL、2.014mg／mL，氮源濃度明顯高于通常的霉菌培養(yǎng)基。可見與菌體生長相比，氨氧化需較低C／N，這與氨氧化本身的作用特點(diǎn)，即低碳源環(huán)境為氨氧化作用提供驅(qū)動力，以及銨態(tài)氮是氨氧化的作用底物有關(guān)。將其應(yīng)用到堆肥中，兩種菌劑均能促進(jìn)堆肥中銨態(tài)氮及有機(jī)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，降低堆肥氮素?fù)p失；且兩菌劑組中溫度、含水量、pH、C／N 等理化指標(biāo)的變化均有利于堆肥腐熟化的進(jìn)行，有機(jī)質(zhì)的含量與對照相比偏低，而種子發(fā)芽指數(shù)與對照相比偏高，說明兩者回歸堆肥后，均能促進(jìn)堆肥腐熟。

由于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)都不易獲得AOA 和AOB，所以通過向堆肥中添加發(fā)酵培養(yǎng)液增加AOA 的種類和數(shù)量以降低氮素?fù)p失的研究是一個(gè)非常值得探討研究方向。解開治等［67］通過向家禽糞便堆肥過程添加在污泥中擴(kuò)培養(yǎng)的AOA 接種液（1.0×109CFU／mL），發(fā)現(xiàn)能加快高溫階段進(jìn)程，縮短堆肥腐熟的時(shí)間，在堆肥初始階段能顯著促進(jìn)硝化作用，在低溫階段pH 比對照組低，有助于氮的保存。試驗(yàn)組氨氣揮發(fā)量和氧化亞氮的排放量分別為對照組的14.7%和4.2%，說明通過添加AOA 可以降低氮以氣體的形式損失。通過添加AOA 能顯著增加堆肥初期氨氧化古菌的菌落種類和數(shù)量，但其機(jī)制尚需繼續(xù)研究。

迄今為止，異養(yǎng)氨氧化的報(bào)道不多，對其氨氧化的特性也有待進(jìn)一步研究。為尋找適用于堆肥的嗜熱異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌，巴頓等［68］采用稀釋涂布平板法和格里斯試劑顯色法篩選嗜熱異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌，從大理洱源熱泉中分離出兩株嗜熱異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌，菌株NC8和NJ26，分別為Bacillus屬的不同種，其最適生長溫度為55 ℃，最適生長pH 為8.0；在最適生長條件下，NC8和NJ26菌株對NH4＋的最大單位體積減少率分別為1033.3mg／L和1183.67mg／L；對NO2－和NO3－ 最大單位體積產(chǎn)生率分別為23.79 mg／L、272.30 mg／L 和33.81 mg／L、366.70 mg／L。研究表明，NC8和NJ26能將NH4＋氧化成NO2－ 和NO3－，以NO3－為主要積累產(chǎn)物。目前NC8和NJ26還未用于堆肥實(shí)驗(yàn)，有望應(yīng)用于堆肥過程中以減少氨氣排放，同時(shí)提高堆肥中氮素的含量。

4 研究展望

目前，通過分子生物學(xué)、宏基因組學(xué)、培養(yǎng)及非培養(yǎng)等方法的結(jié)合，氨氧化微生物的研究在諸多方面已取得重要進(jìn)展。但仍然存在諸多問題需要深入地研究和探討，特別是在堆肥系統(tǒng)中的氮素減排的研究：如利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段檢測不同堆肥系統(tǒng)中氨氧化微生物的優(yōu)勢菌群；并進(jìn)一步深入研究在不同堆肥系統(tǒng)和堆肥不同階段中的氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)變化，以及pH、銨態(tài)氮濃度、氧氣等理化性質(zhì)對氨氧化微生物的影響，及其與其它微生物群落的互作關(guān)系。此外，氨的揮發(fā)主要在堆肥高溫階段，是否能分離、篩選不同生態(tài)環(huán)境中的耐高溫的氨氧化微生物或直接從堆肥系統(tǒng)中提取擴(kuò)增優(yōu)勢菌群以減少氮素?fù)p失？研究堆肥過程中氨氧化機(jī)制與反硝化機(jī)制的聯(lián)系，是否在增強(qiáng)氨氧化微生物硝化作用的同時(shí)也減少了N2O 的排放，從而增加了氮素的保留和堆肥肥效？這些問題都需要利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法進(jìn)一步研究解決，以增強(qiáng)氨氧化微生物在堆肥系統(tǒng)和其它氮素循環(huán)相關(guān)領(lǐng)域的利用。

［1］Wei Y S，F(xiàn)an Y B，Wang M J，et al.Composting and compost application in China［J］.Resources，Conservation and Recycling，2000，30（4）：277－300.

［2］Gu W，Zhang F，Xu P，et al.Effects of sulphur and Thiobacillus thioparus on cow manure aerobic composting［J］.Bioresource technology，2011，102（11）：6 529－6 535.

［3］黃向東，韓志英，石德智，等.畜禽糞便堆肥過程中氮素的損失與控制［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2010.21（1）：247－254.

［4］Barrington S，Choinière D，Trigui M，et al.Effect of carbon source on compost nitrogen and carbon losses［J］.Bioresource Technology，2002，83（3）：189－194.

［5］Francis C A，Beman J M，Kuypers M M M.New processes and players in the nitrogen cycle：the microbial ecology of anaerobic and archaeal ammonia oxidation［J］.The ISME Journal，2007，1（1）：19－27.

［6］K?nneke M，Bernhard A E，JoséR，et al.Isolation of an autotrophic ammonia－oxidizing marine archaeon［J］.Nature，2005，437（7058）：543－546.

［7］Matsuno T，Horii S，Sato T，et al.Analysis of Nitrification in Agricultural Soil and Improvement of Nitrogen Circulation with Autotrophic Ammonia－Oxidizing Bacteria［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2013，169（3）：795－809.

［8］Kowalchuk G A，Naoumenko Z S，Derikx P J L，et al.Molecular analysis of ammonia－oxidizing bacteria of theβsubdivision of the class Proteobacteria in compost and composted materials［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65（2）：396－403.

［9］Winogradsky S.Recherches sur les organismes de la nitrification［J］.Ann.Inst.Pasteur，1890，4（257）：11－12.

［10］Purkhold U，Pommerening－R?ser A，Juretschko S，et al.Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16SrRNA and amoA sequence analysis：implications for molecular diversity surveys［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（12）：5 368－5 382.

［11］Leininger S，Urich T，Schloter M，et al.Archaea predominate among ammonia－oxidizing prokaryotes in soils［J］.Nature，2006，442（7104）：806－809.

［12］Wuchter C，Abbas B，Coolen M J L，et al.Archaeal nitrification in the ocean［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2006，103（33）：12 317－12 322.

［13］Mincer T J，Church M J，Taylor L T，et al.Quantitative distribution of presumptive archaeal and bacterial nitrifiers in Monterey Bay and the North Pacific Subtropical Gyre［J］.Environmental microbiology，2007，9（5）：1 162－1 175.

［14］Lam P，Jensen M M，Lavik G，et al.Linking crenarchaeal and bacterial nitrification to anammox in the Black Sea［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104（17）：7 104－7 109.

［15］Herrmann M，Saunders A M，Schramm A.Archaea dominate the ammonia－oxidizing community in the rhizosphere of the freshwater macrophyte Littorella uniflora［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（10）：3 279－3 283.

［16］Mulder A，Graaf A A，Robertson L A，et al.Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor［J］.FEMS Microbiology Ecology，1995，16（3）：177－184.

［17］Van de Graaf A A，Mulder A，de Bruijn P，et al.Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process［J］.Applied and Environmental Microbiology，1995，61（4）：1 246－1 251.

［18］郝永俊，吳松維，吳偉祥，等.好氧氨氧化菌的種群生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2007（4）：1 573－1 582.

［19］賀紀(jì)正，張麗梅.氨氧化微生物生態(tài)學(xué)與氮循環(huán)研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2009（1）：406－415.

［20］Kowalchuk G A，Stephen J R.Ammonia－oxidizing bacteria：a model for molecular microbial ecology［J］.Annual Reviews in Microbiology，2001，55（1）：485－529.

［21］Purkhold U，Pommerening－R?ser A，Juretschko S，et al.Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers based on comparative 16SrRNA and amoA sequence analysis：implications for molecular diversity surveys［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66（12）：5 368－5 382.

［22］Maeda K，Toyoda S，Shimojima R，et al.Source of nitrous oxide emissions during the cow manure composting process as revealed by isotopomer analysis of and amoA abundance in betaproteobacterial ammonia－oxidizing bacteria［J］.Applied and environmental microbiology，2010，76（5）：1 555－1 562.

［23］Yamamoto N，Otawa K，Nakai Y.Diversity and abundance of ammonia－oxidizing bacteria and ammonia－oxidizing archaea during cattle manure composting［J］.Microbial Ecology，2010，60（4）：807－815.

［24］孫志遠(yuǎn).堆肥化過程中氨氧化菌群多樣性分析［D］.黑龍江大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2012.

［25］虞 泳，曾光明，陳耀寧，等.農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥中氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)［J］.環(huán)境科學(xué)，2011，31（10）：3 067－3 072.

［26］Yamamoto N，Oishi R，Suyama Y，et al.Ammonia－oxidizing bacteria rather than ammonia－oxidizing archaea were widely distributed in animal manure composts from field－scale facilities［J］.Microbes Environ，2012，27：519－524.

［27］He J，Shen J，Zhang L，et al.Quantitative analyses of the a－bundance and composition of ammonia‐oxidizing bacteria and ammonia‐oxidizing archaea of a Chinese upland red soil under long‐term fertilization practices［J］.Environmental Microbiology，2007，9（9）：2 364－2 374.

［28］Venter J C，Remington K，Heidelberg J F，et al.Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea［J］.Science，2004，304（5667）：66－74.

［29］Treusch A H，Leininger S，Kletzin A，et al.Novel genes for nitrite reductase and Amo‐related proteins indicate a role of uncultivated mesophilic crenarchaeota in nitrogen cycling［J］.Environmental Microbiology，2005，7（12）：1 985－1 995.

［30］Francis C A，Roberts K J，Beman J M，et al.Ubiquity and diversity of ammonia－oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（41）：14 683－14 688.

［31］Hallam S J，Mincer T J，Schleper C，et al.Pathways of carbon assimilation and ammonia oxidation suggested by environmental genomic analyses of marine Crenarchaeota［J］.PLoS biology，2006，4（4）：e95.

［32］Prosser J I，Nicol G W.Relative contributions of archaea and bacteria to aerobic ammonia oxidation in the environment［J］.Environmental Microbiology，2008，10（11）：2 931－2 941.

［33］Jia Z，Conrad R.Bacteria rather than Archaea dominate microbial ammonia oxidation in an agricultural soil［J］.Environmental microbiology，2009，11（7）：1 658－1 671.

［34］Leininger S，Urich T，Schloter M，et al.Archaea predominate among ammonia－oxidizing prokaryotes in soils［J］.Nature，2006，442（7104）：806－809.

［35］De Gannes V，Eudoxie G，Dyer D H，et al.Diversity and abundance of ammonia oxidizing archaea in tropical compost systems［J］.Frontiers in Microbiology，2012，3.

［36］Santoro A E，F(xiàn)rancis C A，De Sieyes N R，et al.Shifts in the relative abundance of ammonia‐oxidizing bacteria and archaea across physicochemical gradients in a subterranean estuary［J］.Environmental Microbiology，2008，10（4）：1 068－1 079.

［37］Yamamoto N，Asano R，Yoshii H，et al.Archaeal communi－ty dynamics and detection of ammonia－oxidizing archaea during composting of cattle manure using culture－independent DNA analysis［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2011，90（4）：1 501－1 510.

［38］Yamada T，Araki S，Ikeda－Ohtsubo W，et al.Community structure and population dynamics of ammonia oxidizers in composting processes of ammonia－rich livestock waste［J］.Systematic and Applied Microbiology，2013，36（5）：359－367.

［39］解開治，徐培智，張發(fā)寶，等.雞糞好氧堆肥過程中氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2012，18（6）：1 487－1 494.

［40］張克強(qiáng)，高懷友.畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物處理與處置［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［41］諸葛健，李華鐘.微生物學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2009.

［42］Zeng G，Zhang J，Chen Y，et al.Relative contributions of archaea and bacteria to microbial ammonia oxidation differ under different conditions during agricultural waste composting［J］.Bioresource Technology，2011，102（19）：9 026－9 032.

［43］董蓮華，楊金水，袁紅莉.氨氧化細(xì)菌的分子生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2008，19（6）：1 381－1 388.

［44］BurrellP C，Phalen C M，Hovanec T A.Identification of bacteria responsible forammonia oxidation in freshwater aquaria［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67（12）：5 791－5 800

［45］虞 泳.農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥中氨氧化菌的研究［D］.湖南長沙：湖南大學(xué)，2011.

［46］Hatzenpichler R，Lebedeva E V，Spieck E，et al.A moderately thermophilic ammonia－oxidizing crenarchaeote from a hot spring［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（6）：2 134－2 139.

［47］Di H J，Cameron K C，Shen J P，et al.Ammonia－oxidizing bacteria and archaea grow under contrasting soil nitrogen conditions［J］.FEMS Microbiology Ecology，2010，72（3）：386－394.

［48］Dong X，Reddy G B.Ammonia－oxidizing bacterial community and nitrification rates in constructed wetlands treating swine wastewater［J］.Ecological Engineering，2012，40：189－197.

［46］Chen X P，Zhu Y G，Xia Y，et al.Ammonia‐oxidizing archaea：important players in paddy rhizosphere soil［J］.Environmental Microbiology，2008，10（8）：1 978－1 987.

［50］Di H J，Cameron K C，Shen J P，et al.A lysimeter study of nitrate leaching from grazed grassland as affected by a nitrification inhibitor，dicyandiamide，and relationships with ammonia oxidizing bacteria and archaea［J］.Soil Use and Management，2009，25（4）：454－461.

［51］Oishi R，Tada C，Asano R，et al.Growth of ammonia－oxidizing archaea and bacteria in cattle manure compost under various temperatures and ammonia concentrations［J］.Microbial ecology，2012，63（4）：787－793.

［52］Nicol G W，Leininger S，Schleper C，et al.The influence of soil pH on the diversity，abundance and transcriptional activity of ammonia oxidizing archaea and bacteria［J］.Environmental microbiology，2008，10（11）：2 966－2 978.

［53］Adair K L，Schwartz E.Evidence that ammonia－oxidizing archaea are more abundant than ammonia－oxidizing bacteria in semiarid soils of northern Arizona，USA［J］.Microbial ecology，2008，56（3）：420－426.

［54］Kowalchuk G A，Stephen J R，De Boer W，et al.Analysis of ammonia－oxidizing bacteria of the beta subdivision of the class Proteobacteria in coastal sand dunes by denaturing gradient gel electrophoresis and sequencing of PCR－amplified 16Sribo－somal DNA fragments［J］.Applied and Environmental Microbiology，1997，63（4）：1 489－1 497.

［55］Lina Z，Hui C，Zhongli C.RFLP analysis of AOB－specific 16SrDNA library from red soil enrichment culture［J］.Acta Pedologica Sinica，2006，43（4）：641.

［56］Bengtsson G，Bengtson P，M?nsson K F.Gross nitrogen mineralization－，immobilization－，and nitrification rates as a function of soil C／N ratio and microbial activity［J］.Soil Biology and Biochemistry，2003，35（1）：143－154.

［57］Strauss E A，Lamberti G A.Regulation of nitrification in aquatic sediments by organic carbon［J］.Limnology and Oceanography，2000，45（8）：1 854－1 859.

［58］Ling J，Chen S.Impact of organic carbon on nitrification performance of different biofilters［J］.Aquacultural engineering，2005，33（2）：150－162.

［59］Racz L，Datta T，Goel R.Effect of organic carbon on ammonia oxidizing bacteria in a mixed culture.Bioresource Technology 2010，101（16）：6 454－6 460.

［60］Zeng Y，De Guardia A，Ziebal C，et al.Impact of biodegradation of organic matters on ammonia oxidation in compost［J］.Bioresource Technology，2013，136：49－57.

［61］Satoh H，Yamakawa T，Kindaichi T，et al.Community structures and activities of nitrifying and denitrifying bacteria in industrial wastewater－treating biofilms［J］.Biotechnology and Bioengineering，2006，94（4）：762－772.

［62］Voytek M A，Ward B B，Priscu J C.The Abundance of Ammonium ‐ Oxidizing Bacteria in Lake Bonney，Antarctica Determined by Immunofluorescence，Pcr and In Situ Hybridization［M］.American Geophysical Union，1998.

［63］Fukumoto Y，Osada T，Hanajima D，et al.Patterns and quantities of NH3，N2Oand CH4emissions during swine manure composting without forced aeration－－effect of compost pile scale［J］.Bioresource Technology，2003，89（2）：109－114.

［64］Osada T，F(xiàn)ukumoto Y.Development of a new dynamic chamber system for measuring harmful gas emissions from composting livestock waste［J］.Water Science ＆ Technology，2001，44（9）：79－86.

［65］Paranychianakis N V，Tsiknia M，Giannakis G，et al.Nitrogen cycling and relationships between ammonia oxidizers and denitrifiers in a clay－loam soil［J］.Applied microbiology and biotechnology，2013，97（12）：5 507－5 515.

［66］喻其林.雞糞好氧堆肥氨氧化霉菌的篩選及生物學(xué)特性研究［D］.黑龍江哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［67］Xie K Z，Jia X，Xu P，et al.Improved composting of poultry feces via supplementation with ammonia oxidizing archaea［J］.Bioresource Technology，2012，120：70－77.

［68］巴頓，張琦，季秀玲，等.兩株嗜熱異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌的鑒定及其氨氧化特性［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2014，20（1）：157－161.