劉樹業(yè)

專家述評

肝癌診斷相關(guān)標(biāo)志物的應(yīng)用

劉樹業(yè)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，存活率低，早期診斷面臨挑戰(zhàn)。隨著對肝癌生物學(xué)的了解和檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，從病理學(xué)、基因?qū)W及分子生物學(xué)等方面研究肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)大量的潛在標(biāo)志物，這些標(biāo)志物有利于早期診斷、最佳治療、降低腫瘤復(fù)發(fā)及外科手術(shù)或者肝移植后的腫瘤轉(zhuǎn)移。本文將相關(guān)標(biāo)志物做一個(gè)總結(jié)。

肝癌；細(xì)胞因子；miRNA；早期診斷；侵襲轉(zhuǎn)移；預(yù)后

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)，HCC在惡性腫瘤中位列第五，病死率位列第三。每年有626 000新患病例，600 000死亡病例，患病率與病死率基本持平，早期明確診斷和正確治療是影響預(yù)后的關(guān)鍵。隨著對HCC生物學(xué)的了解和技術(shù)進(jìn)步，從病理學(xué)、基因?qū)W及分子生物學(xué)等方面研究HCC的發(fā)生發(fā)展過程，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)大量的生物標(biāo)志物有利于早期診斷、最佳治療、降低腫瘤復(fù)發(fā)及術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移。

理想的腫瘤標(biāo)志物需要有較高的特異性，能夠?qū)CC與肝硬化、肝炎、肝臟再生結(jié)節(jié)等區(qū)別開來；同時(shí)還需要較高的敏感性，能夠在HCC早期提示診斷，且具有易檢測、可重復(fù)、侵入少的特點(diǎn)。目前用于診斷HCC的標(biāo)志物有甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、甲胎蛋白異質(zhì)體L3（alpha-fetoprotein L3，AFP-L3）、DES-羧基凝血酶原（DES-carboxyl prothrombin，DCP）、磷脂?；嫉鞍拙厶?3（glypican-3，GPC-3）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyl transferase，GGT）、a-L-巖藻糖苷酶（a-L-fucosidase，AFU）、人羰基還原酶2、高爾基體蛋白酶73（golgiprotease，GP73）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腫瘤特異性生長因子（tumor specific growth factor，TSGF）、微小RNA（microRNA，miRNA）等。本文對上述標(biāo)志物在HCC診斷中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)探討。

1 蛋白質(zhì)及酶類

1.1 AFP-L3最早被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于診斷HCC患者和臨床治療效果及疾病進(jìn)程跟蹤的標(biāo)志物是AFP，到目前為止，依然被認(rèn)定為診斷HCC的金標(biāo)準(zhǔn)。AFP血清濃度持續(xù)大于500 ng／mL時(shí)即可診斷為HCC。低于500 ng／mL且在血液中非持續(xù)存在則經(jīng)常被認(rèn)為是良性肝臟疾病。如果患者存在HCC危險(xiǎn)因素（比如肝硬化），那么AFP水平持續(xù)增高，就有可能發(fā)展成HCC。但是，血清AFP的敏感性（40%～65%）和特異性（76%～96%）均不佳，并且不能預(yù)測HCC的大小、分期或疾病進(jìn)程情況，在臨床應(yīng)用上有一定的不足之處。1989年AFP-L3被Taketa發(fā)現(xiàn)，AFP-L3含有AFP的扁豆凝集素結(jié)合部分，為HCC細(xì)胞特有。AFP-L3相對于AFP具有更高特異性及HCC陽性預(yù)測值，而且AFP-L3值與總AFP值無相關(guān)性，是獨(dú)立于總AFP值的HCC診斷因子［1］。另外，AFP-L3與肝功能不佳、腫瘤低分化程度及生物學(xué)惡性行為相關(guān)。

1.2 DCP DCP為異常的凝血酶原蛋白，可以在HCC患者或維生素K缺乏及服用華法林的患者血清中檢測到。DCP診斷HCC的靈敏度在48%～62%之間，特異性在82%～98%之間（以酶聯(lián)免疫法測定，40mAU／mL為DCP臨界值）［2］。DCP和AFP之間沒有明顯的相關(guān)性，其與HCC的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移尤其是門脈轉(zhuǎn)移相關(guān)［3，4］。因此，DCP在HCC預(yù)后評估方面優(yōu)于AFP，但并沒有體現(xiàn)出早期診斷的優(yōu)勢。但在區(qū)別HCC和非惡性肝臟腫瘤以及監(jiān)測小細(xì)胞肝癌方面均優(yōu)于AFP［5］。通過表1可以看出診斷HCC的靈敏度和特異性，AFP-L3與DCP聯(lián)合檢測的準(zhǔn)確性優(yōu)于AFP［1-3］。

1.3 GPC-3 GPC-3在胎兒時(shí)期的肝臟高表達(dá)，出生后異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在HCC中GPC-3呈高表達(dá)，而在其他腫瘤或良性肝病中呈低表達(dá)或中度表達(dá)［6］。目前，GPC-3診斷癌前病變及早期HCC具有較高的敏感性及特異性［7，8］，與AFP聯(lián)合診斷可以提高早期HCC的診斷率，為HCC患者取得早期治療時(shí)機(jī)。GPC-3在HCC中高表達(dá)這一特性除了用于診斷外還用于HCC的靶向治療，甚至疫苗研究［9］。目前，多數(shù)研究集中于GPC-3在HCC中的作用機(jī)制。另外，GPC-3的免疫治療文獻(xiàn)報(bào)道較多，但大多僅是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，臨床實(shí)驗(yàn)較少，要使GPC-3免疫治療有更進(jìn)一步發(fā)展，必須要有更多的臨床實(shí)驗(yàn)支持。

表1 HCC血清標(biāo)志物的診斷價(jià)值（%）

1.4 GP73 GP73又稱高爾基體磷酸化蛋白，大樣本臨床研究［10］證明，GP73可作為惡性肝病的獨(dú)立指標(biāo)與AFP互補(bǔ)應(yīng)用于臨床。監(jiān)測丙型肝炎患者血清中GP73水平可預(yù)測HCC的發(fā)生［11］。同時(shí)，HCC組織中GP73的表達(dá)與腫瘤大小、血管侵犯等呈正相關(guān)［12］。一項(xiàng)對亞洲人群的研究［13］顯示，GP73作為診斷HCC的血清標(biāo)志物更適用于中國人群。

1.5 其他其他酶學(xué)指標(biāo)如AFU、GGT、堿性磷酸酶，廣泛分布于人體正常組織、血液、體液中。這些指標(biāo)在HCC患者血清中升高，但是檢測時(shí)標(biāo)本的存放時(shí)間會影響其測定的結(jié)果，而且并不是HCC的特異性診斷標(biāo)志物，聯(lián)合檢測可以作為AFP的有效補(bǔ)充［14］。

總的來說，AFP、AFP-L3、DCP、GPC-3、GGT、AFU、GP73都用于HCC早期診斷。近年臨床實(shí)驗(yàn)研究的熱點(diǎn)集中在優(yōu)化組合上。目前的研究中，指標(biāo)搭配形式較多，每項(xiàng)組合中都有AFP或AFP-L3。從靈敏度和特異性綜合考慮來看，現(xiàn)有研究比較公認(rèn)的組合有AFP-L3＋DCP、GP73＋AFP-L3以及GPC-3＋AFP。但是尚未有研究對以上標(biāo)志物做綜合分析，哪些指標(biāo)組合更利于臨床診斷有待進(jìn)一步研究。

2 細(xì)胞因子類

相對于蛋白及酶類對HCC早期的診斷作用，細(xì)胞因子及其受體類則側(cè)重于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、靶標(biāo)治療、預(yù)后。與HCC密切相關(guān)的生長因子及受體有TGF-β1、HGF、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、TSGF、EGFR、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblastgrowth factor，bFGF）、胰島素樣生長因子-Ⅱ等。

2.1 TGF-β1 TGF是具有生物活性的多肽，在肝細(xì)胞增殖中起負(fù)相調(diào)節(jié)作用，可使肝細(xì)胞逃避TGF-β1介導(dǎo)的生長抑制效應(yīng)［15］。有研究［16］發(fā)現(xiàn)HCC患者TGF-β1水平顯著高于良性肝病患者。HCC誘癌模型的動(dòng)態(tài)觀察研究［17］發(fā)現(xiàn)，TGF-β1及TGF-β1mRNA表達(dá)呈漸進(jìn)型梯度增加，增加血管生成促進(jìn)進(jìn)展期腫瘤生長、侵襲與轉(zhuǎn)移［17］。

2.2 HGF HGF由胚胎發(fā)育和肝臟再生過程中產(chǎn)生，與癌細(xì)胞表面c-Met受體結(jié)合能引起基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)增加，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，并且導(dǎo)致癌轉(zhuǎn)移和降低患者生存期［18］。電鏡下HGF定位于癌細(xì)胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其表達(dá)與癌細(xì)胞分化程度間無相關(guān)性。術(shù)后HGF水平高者，預(yù)后相對差。慢性肝炎、肝硬化和HCC患者血清中HGF水平反映HCC的發(fā)生狀態(tài)，故HGF表達(dá)可作為HCC診斷的一個(gè)指標(biāo)［19］。

2.3 VEGF肝VEGF主要存在于肝細(xì)胞，其內(nèi)皮細(xì)胞中有VEGF受體。癌組織VEGF表達(dá)明顯升高，啟動(dòng)了新生血管生長，血管形成是HCC生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，新生血管提供營養(yǎng)，排除代謝產(chǎn)物，也是肝癌細(xì)胞播散的途徑［20］。VEGF除促進(jìn)血管增殖外，還能增加血管通透性，其強(qiáng)度是組織胺的數(shù)百倍。HCC早期VEGF過表達(dá)，可引起血中VEGF增加，表現(xiàn)為HCC患者血清VEGF水平明顯高于慢性肝炎和肝硬化患者，反映HCC早期新生血管形成。

2.4 TSGF TSGF由腫瘤細(xì)胞在其生長期釋放入周邊血液中，在診斷HCC中的敏感性可以達(dá)到82%，同時(shí)檢測TSGF（cutoff值65 U／mL），AFP（cutoff值25 ng／mL）及血清鐵蛋白（cutoff值240 ng／mL）三個(gè)指標(biāo)，靈敏度和特異性分別能達(dá)到98.4%和99%［15］。

EGFR和bFGF與HCC術(shù)后早期復(fù)發(fā)和降低無病生存期有關(guān)，HCC患者的血清EGFR和bFGF水平顯著高于肝轉(zhuǎn)移癌、肝硬化及肝良性病變患者［21，22］。這些細(xì)胞因子可用于HCC的早期診斷或監(jiān)測其復(fù)發(fā)情況，但由于其在血清中穩(wěn)定性差，因此臨床應(yīng)用受到一定的限制。

3 miRNA

miRNA是內(nèi)源性短的非編碼RNA，一般由20～25個(gè)堿基組成。研究［23］發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miRNA能穩(wěn)定存在，這些游離的miRNA不但能抵抗RNA酶的消化，且可耐受高、低pH值、反復(fù)凍融、長期儲存等復(fù)雜環(huán)境，這些特征使循環(huán)miRNA可能成為一種新的腫瘤分子標(biāo)志物。表2對目前文獻(xiàn)［24-36］報(bào)道的有關(guān)HCC循環(huán)miRNA的研究進(jìn)行了總結(jié)，可見miRNA在HCC的篩查、診斷、監(jiān)測治療和預(yù)后評估方面均有很好地臨床價(jià)值。雖然HCC循環(huán)miRNA的研究取得了進(jìn)展，但也存在一些亟待解決的問題，例如目前沒有公認(rèn)的內(nèi)參照miRNA，許多研究采用不同的內(nèi)參照或加入非人源性miRNA作為外參照，導(dǎo)致各研究間的數(shù)據(jù)兼容性和可比性差；各研究采用的血液樣本（血清或血漿）也不盡相同。另外，有研究［37］發(fā)現(xiàn)許多因素可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏倚，即便是輕微的溶血亦可導(dǎo)致游離miRNA濃度改變，因此采血流程需標(biāo)準(zhǔn)化才能夠保證miRNA檢測的準(zhǔn)確性。

4 小結(jié)

隨著對HCC生物學(xué)的了解和技術(shù)進(jìn)步，大量診斷HCC的標(biāo)志物被研究并報(bào)道出來，如何選擇最有利于臨床實(shí)踐的標(biāo)志物變得富有挑戰(zhàn)性。本文集中討論了最廣泛應(yīng)用和最易接受的生物標(biāo)志物。盡管存在局限性，血清AFP依然是臨床應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物。AFP-L3和DCP聯(lián)合檢測在鑒別HCC和肝臟良性腫瘤及檢測小肝癌方面優(yōu)于單純AFP檢測。另外，其他腫瘤標(biāo)志物，比如GPC-3、GGT、AFU都是AFP-L3和DCP檢測HCC的有益補(bǔ)充。細(xì)胞因子類也可用在HCC的早期診斷，然而更加傾向于判斷HCC的侵襲、預(yù)后及復(fù)發(fā)情況。

表2 HCC循環(huán)miRNA

最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤分子標(biāo)志物miRNA家族的前景最好。miRNA家族在HCC中異常表達(dá)，其中一些在癌變過程中發(fā)揮作用。另外，某些miRNA已經(jīng)被證實(shí)與HCC或HCC亞型相關(guān)，就有可能用于HCC分期診斷及預(yù)后。那么就有可能建立一個(gè)平臺，進(jìn)行HCC診斷、風(fēng)險(xiǎn)評估、患者危險(xiǎn)因素分級等，最終達(dá)到個(gè)性化治療的目的，為臨床服務(wù)。

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2014-11-09）

（本文編輯：楊軍）

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