李翰書，盧妍妍，李海英，2，茹廣欣，楊 陽，候 婷，楊永紅

(1.河南農(nóng)業(yè)大學林學院，河南鄭州450002;2.華北水利水電學院，河南鄭州450002)

泡桐屬(Paulownia)屬于玄參科(Scrophulariaceae)落葉喬木，原產(chǎn)于中國，在全國23個省、市、自治區(qū)均有分布，是重要的速生優(yōu)質用材樹種和綠化樹種.由于泡桐材質輕軟，不翹裂，脹縮性小，是優(yōu)質的家具用材和裝飾用材［1］.另外，由于泡桐的葉、花、果、樹皮還具有良好的藥用價值，因此，泡桐占有重要的國民經(jīng)濟地位.關于泡桐屬植物的栽培、育種以及依據(jù)外部形態(tài)指標進行的種間親緣關系探討已做了比較深入研究［2］，但由于表型性狀經(jīng)常會受環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，有些情況下表型變化并不能真實反映遺傳變異，要更加準確、細致地理解種群的遺傳變異狀況，僅僅依賴表型性狀是遠遠不夠的，還必須進行更深層次的研究，并加以比較和驗證［3］.目前對泡桐在分子水平上的分類只有盧龍斗等［4］運用RAPD分析方法將泡桐屬7種植物分為白花泡桐、川泡桐、楸葉泡桐、南方泡桐、山明泡桐組和毛泡桐、蘭考泡桐組2大類群;馬浩等［5］利用RFLP分子標記法對泡桐屬15個植物的葉綠體DNA進行分析，最終將研究材料分為南方泡桐組、毛泡桐組和白花泡桐組;莫文娟等［6］則運用ISSR分子標記對泡桐屬21份種、變種及變型材料進行親緣關系分析，最終將供試材料分為3大類群，分別是臺灣泡桐和川泡桐;白花泡桐、南方泡桐2、南方泡桐1、南方泡桐3、鄂川泡桐、建始泡桐和成都泡桐;蘭考泡桐1、蘭考泡桐2、山明泡桐2、山明泡桐1、白花蘭考泡桐、楸葉泡桐2、楸葉泡桐l、圓冠泡桐、宜昌泡桐、亮葉毛泡桐、毛泡桐l和毛泡桐2.上述所得結論存在一定差異，種群之間的分類仍存在較多爭議.擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism AFLP)，結合了RFLP和RAPD技術的優(yōu)點，擴增條帶豐富、多態(tài)性高、重復性好是目前綜合效應較高的分子標記方法.目前廣泛應用于種質資源研究［7～11］、系統(tǒng)分類［12，13］、遺傳多樣性檢測［14～16］以及遺傳圖譜的構建和基因定位等方面，已成為材料間遺傳多樣性和分類研究的有效手段［17］.但有關AFLP技術在泡桐上的應用還未見報道，本研究旨在利用FISHAFLP分子標記技術，研究探討泡桐屬植物種間的親緣關系，為該屬植物的系統(tǒng)分類和遺傳育種提供更可靠的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用材料(表1)采自江西九江共青城泡桐種源育種基地，每份材料選取3～5片新鮮嫩葉，置于采樣箱中帶回實驗室，-20℃保存?zhèn)溆?

表1 供試材料Table 1 Materials tested in the experiment

本試驗所用試劑:Taq酶(2 U·μL-1)、dNTPs(10 mmol·L-1)、引物(10 mmol·L-1)以及 B002-1 Marker，DGL 2000 Marker均由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司提供，內(nèi)切酶(10 U·μL-1)、T4連接酶(5 U·μL-1)及ROX 500相對分子質量內(nèi)標則分別購自NEB公司和ABI公司.試驗所用接頭和擴增引物序列詳見表2.

1.2 總DNA的制備及檢測

參照DOYLE等［18］經(jīng)典的CTAB法略加改動提取DNA總基因組并加以純化.具體方法:稱取泡桐葉片50 mg，液氮研磨成粉狀，并將粉末轉移到裝有800 μL 2×CTAB提取液的2 mL離心管中，加入60 μL巰基乙醇混勻，60℃預熱30 min，其間混勻2～3次，取出樣品于室溫放置，待樣品冷卻到室溫加入800 μL［V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1］，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液到另一新2 mL離心管，加入等體積的氯仿與異戊醇［V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1］，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液到新的2 mL離心管中加入1.5倍體積1×CTAB沉淀液，放置20 ～30 min，12 000 r·min-1離心 15 min 將沉淀晾干溶于 200 μL TE-buffer(溶解)，加入 400 μL 95% 乙醇，20 μL 3 mmol·L-1乙酸鈉，-20 ℃ 沉淀1 h后4 ℃ ，12 000 r·min-1離心 15 min，加入500 μL 75% 乙醇洗滌，12 000 r·min-1離心10 min后加入 30 ～50 μL TE-buffer稀釋，經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20℃保存?zhèn)溆?，使用前將其稀釋?50 mg·L-1.

表2 擴增引物序列及名稱Table 2 The sequences and name of the amplification primer

1.3 AFLP 分析

1.3.1 限制性酶切及連接反應 采用北京鼎國生物技術公司的試劑盒，按照其操作指南酶切連接一步進行.在20 μL反應體系中含有DNA模板(50 mg·L-1)4 μL，Adapter 1 μL，PstI和 MseI 2 μL，10×Reaction buffer 2.5 μL，10 mM ATP 2.5 uL，T4 Ligase 1 μL，AFLP-Water7 μL.將上述混合液混勻離心數(shù)秒，37℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃過夜.

1.3.2 預擴增 參照馬慶國等［17］的16個早實核桃良種遺傳多樣性AFLP分析的預擴增體系及預擴增程序，將預擴產(chǎn)物經(jīng)1∶20稀釋后作為選擴模板.

1.3.3 選擇性擴增 用篩選出的9對引物組合(表2)經(jīng)熒光標記后進行選擇性擴增(對MseI引物的5’端進行熒光標記).25 μL擴增體系中含有2 μL 預擴稀釋樣品，2.5 μL 10 × PCR buffer，0.5 μL dNTPs，PstI和 MseI引物各 1 μL，0.5 μL Taq酶，最后用ddH2O補足體系.將上述體系混勻，離心數(shù)秒后參照寧德魯?shù)龋?9］的云南省核桃品種遺傳多樣性的FISH-AFLP擴增程序進行選擇性擴增.

1.4 電泳與數(shù)據(jù)分析

將選擇擴增后的樣品在ABI 377自動測序儀上電泳分離檢測［20］，然后把14份供試材料9對熒光引物產(chǎn)生的電泳凝膠圖通過GeneScan 3.1軟件轉換為“0/1”矩陣(即根據(jù)凝膠上不同材料同一位置條帶的有無進行統(tǒng)計，有帶記為“l(fā)”，無帶記為“0”).對原始矩陣用 NT-SYSpc 2.10 軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過SimQual程序求相似系數(shù)，并獲得相似系數(shù)矩陣;用SHAN程序中的UPGMA進行聚類分析，并通過Treeplot模塊生成聚類圖.

2 結果與分析

2.1 泡桐屬植物葉片DNA的檢測結果

所提取的泡桐屬植物基因組DNA通過DG-III雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀在電壓180 V，電泳時間1 h條件下經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，所提取的DNA有較清晰的電泳條帶，可用于AFLP擴增.

2.2 泡桐屬植物葉片DNA的多態(tài)性分析

從64對引物組合中篩選出擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復性好、多態(tài)性高且分辨能力強的引物組合［20］，利用所選出的9對引物組合(表3)對14份供試材料進行選擇性擴增，獲得了較好的擴增結果(圖2).共檢測到DNA片段1 171條，大小為70～500 bp，其中多態(tài)性條帶1 158條，平均每個引物組合檢測到多態(tài)性片段128.7條，平均多態(tài)性比率高達98.9%，這表明14份泡桐品種具有較高比例的多態(tài)性條帶.其中引物組合P-GTG/M-CAG檢測到的條帶最多，171條均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為100%;引物組合P-GAG/M-CAC共獲得總條帶115條，多態(tài)性條帶 107條，多態(tài)性比例為93.04%，但在所選用的9對引物組合中多態(tài)性比例最低.可見，F(xiàn)ISH-AFLP檢測泡桐品種遺傳多樣性的效率很高，也充分體現(xiàn)了試驗材料具有豐富的遺傳多樣性.

圖1 泡桐屬植物基因組DNA電泳Fig.1 Gel electrophoretogram of the genus Paulownia genomic DNA

2.3 泡桐屬種間聚類與遺傳關系分析

利用NT-SYSpc 2.10軟件計算泡桐屬植物種間遺傳相似系數(shù)并基于UPGMA法繪制泡桐屬種質間親緣關系樹狀圖(圖3).由圖3可知，當閾值為0.675時，可將14份供試材料分成Ⅳ個類群.其中，類群Ⅰ包括白花泡桐、臺灣泡桐、南方泡桐、山明泡桐、宜昌泡桐、鄂川泡桐、蘭考泡桐、建始泡桐以及白花蘭考泡桐;類群Ⅱ包括毛泡桐、亮葉毛泡桐以及川泡桐;類群Ⅲ和Ⅳ均由1個泡桐種群組成，分別為楸葉泡桐和成都泡桐.

表3 不同引物組合在泡桐種群中的多態(tài)位點比率Table 3 The polymorphic ratio of different primers combination in Paulownia species

圖2 引物組合P-GAT/M-CAG對14個泡桐屬植物的AFLP擴增結果Fig.2 Amplification results of primer combination P-GAT/M-CAG to 14 genus Paulownia plants

3 結論與討論

圖3 14份泡桐屬植物的聚類分析圖Fig.3 Clustering analysis diagram of the 14 genus Paulownia plants

盧龍斗等［4］對泡桐屬7種植物的RAPD分析中，選用13個引物共擴增出89條譜帶，其中多態(tài)性譜帶有63條，多態(tài)性比率為70.79%;莫文娟等［6］運用9條ISSR引物對泡桐屬植物進行親緣關系分析，共擴增出85條片段，多態(tài)性條帶74條，多態(tài)性比率為87.05% .本試驗采用 FISH-AFLP技術，運用9對引物組合對14份泡桐屬植物進行了基因組DNA分子水平上的檢測，共獲得多態(tài)性條帶1 158條，多態(tài)性百分率達98.89% ，表現(xiàn)出更高的檢測效率，說明FISH-AFLP方法得到的信息量較大，是一種較好的用于分析遺傳多態(tài)性和指紋圖譜分析的標記方法［19］.陳志遠等［21］認為南方泡桐(Paulownia australis)和臺灣泡桐(Paulownia kawakamii)應合為1種并將南方泡桐作為異名，本研究在DNA水平上提供了一定的理論基礎，顯示南方泡桐和臺灣泡桐親緣關系最近，被聚在1個亞群.同時，鄂川泡桐與蘭考泡桐聚為1個亞群，這與陳志遠等［21］鄂川泡桐應為南方泡桐與蘭考泡桐的雜交種的觀點一致.白花蘭考泡桐是根據(jù)花冠顏色而定的［22］，本試驗結果也得出白花蘭考泡桐與蘭考泡桐聚為1組的結論，它們間的遺傳相似系數(shù)比較大，也說明它們的親緣關系較近.本研究同樣在DNA水平上支持白花蘭考泡桐為蘭考泡桐的變型這一觀點.陳志遠等［21，23］的泡桐屬植物同工酶分析及泡桐屬的地理分布中均認為山明泡桐的譜帶一部分與蘭考泡桐相同，一部分與毛泡桐相同，因此得出結論，山明泡桐可能是蘭考泡桐和毛泡桐的雜交種.本研究結果顯示，山明泡桐與蘭考泡桐被聚在1個亞群，支持了這一觀點.1995年熊金橋等［2］用數(shù)量分類的方法對泡桐屬植物的38個性狀進行分析，并對所分析的種或變種進行了系統(tǒng)聚類，最終把該屬植物分成3個組，即白花泡桐組:白花泡桐、蘭考泡桐等;毛泡桐組:毛泡桐、川泡桐、南方泡桐等;楸葉泡桐組:楸葉泡桐、山明泡桐等.在本研究結果中，雖然山明泡桐沒有歸入楸葉泡桐組中，但從遺傳相似系數(shù)可以看出二者的遺傳一致度也比較大，這與熊金橋等［2］的研究結果基本相符.但在本研究中，成都泡桐和楸葉泡桐被單獨聚為1組，且成都泡桐被聚在了最外類群，得出了與以往結果不一致的結論，還需要更進一步試驗驗證.

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