童蕓 王曉芬 吳芳 郭梅菊 沈輝

透明質(zhì)酸支架復合小鼠3T3-L1細胞及VEGF注射充填的實驗研究

童蕓 王曉芬 吳芳 郭梅菊 沈輝

目的 觀察透明質(zhì)酸（HA）支架復合小鼠3T3-L1細胞及血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）注射充填后移植細胞的存活情況。 方法 體外培養(yǎng)細胞并誘導后分組，PCR法檢測分組后的脂肪分化相關基因 [氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白α（C-EBP α）]的表達。根據(jù)移植物成分分為4組：實驗組（3×106誘導后脂肪細胞+0．6mlPBS緩沖液+0．6mlHA+20ng/mlVEGF），HA對照組（3×106誘導后脂肪細胞+0．6mlPBS緩沖液+0．6mlHA），VEGF對照組（3×106誘導后脂肪細胞+1．2mlPBS緩沖液+20ng/mlVEGF），空白對照組（3×106誘導后脂肪細胞+1．2mlPBS緩沖液）。術后2、4、8周處死小鼠后取材，標本行形態(tài)學及病理學檢查，并測定移植物質(zhì)量及微血管計數(shù)。 結(jié)果 體外培養(yǎng)后各組小鼠PPARγ及C/EBP α條帶密度相近。實驗組較其他各組存活的細胞多，形態(tài)均一，壞死較少。2、4、8周實驗組小鼠移植物質(zhì)量均明顯高于其他組，HA對照組均明顯高于VEGF對照組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．05）；2、4、8周實驗組小鼠微血管計數(shù)均明顯高于其他組，VEGF對照組均明顯高于空白對照組，HA對照組均明顯低于VEGF對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．05）。 結(jié)論 HA支架復合小鼠3T3-L1細胞及VEGF體外培養(yǎng)后移植入小鼠體內(nèi)可以提高移植細胞的存活水平。

透明質(zhì)酸 小鼠 3T3-L1細胞 血管內(nèi)皮細胞生長因子

脂肪前體細胞（如小鼠3T3-L1細胞）是從脂肪組織分離出的脂肪干細胞分化出的早期脂肪細胞，通過誘導具有分化增殖的潛能。外源性血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）可促進移植組織內(nèi)的血管增生和脂肪細胞分化增殖，但需要持續(xù)作用組織才能起到較好效果[1]。透明質(zhì)酸（HA）是葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖，為雙糖單位組成的直鏈高分子多糖，廣泛存在于組織細胞基質(zhì)中，具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性。HA的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)通過與水形成氫鍵可結(jié)合大量的水，可以維持局部VEGF水平，同時其獨特的三維結(jié)構(gòu)使之成為理想的種子細胞的支架材料[2-3]。本文旨在通過實驗研究探討HA支架復合自體脂肪干細胞及VEGF注射充填的效果，以期為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠3T3-L1細胞（國家傳染病診治重點實驗室提供），6周齡雌性BALB/c小鼠24只（浙江大學動物實驗中心提供）。胰島素、地塞米松、甲基異丁基黃嘌呤（Sigma公司），VEGF165（Peprotech公司）。10%FBS的DMEM液（Sigma公司）。1∶100HA（施佩特，福瑞達公司）。

1.2 細胞復蘇和培養(yǎng) 取凍存小鼠3T3-L1細胞，37°C水浴2min至完全溶解。22°C下800r/min離心5min。取沉淀，加入10%FBS的DMEM液10m1，在直徑10cm細胞培養(yǎng)皿中37°C、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察細胞長滿則進行傳代，棄培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿加入1.5m1胰酶洗滌消化30～60s，加培養(yǎng)液終止消化，22°C下800r/min離心5min。取沉淀，1∶3在直徑10cm細胞培養(yǎng)皿中傳代，37°C、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 細胞誘導及PCR檢測 0.5mmo1/L甲基異丁基黃嘌呤、10mg/L胰島素、1μmo1/L地塞米松誘導細胞2d后，換10mg/L胰島素培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)2d，之后再換成10%FBS的DMEM液培養(yǎng)4d。誘導后細胞分為4組（見表1），取6孔板培養(yǎng)1周后，行PCR檢測PPAR-g及C/EBP-α，內(nèi)參為β-actin。結(jié)果采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR引物及序列見表2。

1.4 脂肪細胞復合組織移植 將24只小鼠隨機分成4組，以1m1注射器，每只小鼠背部皮下，筋膜層以內(nèi)，移植物各注射2點，每點注射量1.2m1。注射后可見皮丘，2點間距離1.5cm，防止融合。各組小鼠移植物成分見表3。1.5 取材及測定 術后2、4、8周采用頸椎脫臼法處死法處死小鼠，眼科剪打開移植物周圍筋膜，完整剝離出移植物，肉眼觀察色澤、質(zhì)地。電子天平測量質(zhì)量。之后標本分別進行HE組織染色和蘇丹Ⅲ染色。在HE染色片上計數(shù)每個HP（200倍）下微血管的個數(shù)，取其平均值即血管密度。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用方差分析。

表1 細胞分組及成分

表2 PCR引物及序列

表3 各組小鼠移植物成分

2 結(jié)果

2.1 大體觀察 2、4、8周取材見小鼠背部皮下脂肪組織淡黃色，質(zhì)軟，容易剝離。實驗組、HA對照組均取到標本。

2.2 PCR結(jié)果 PCR產(chǎn)物大?。篜PARγ 226bp，C/EBP α 214bp，β-actin 446bp。凝膠電泳圖見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖（1：實驗組；2：HA對照組；3：VEGF對照組；4：空白組）

由圖1可見，各組內(nèi)參β-actin條帶均有顯示，密度相似，大小符合446bp區(qū)間，證明結(jié)果可信。各組PPAR-γ、C-EBP α均有明顯表達，所在區(qū)間分別符合226bp和214bp，可以認為是特異性條帶，且條帶密度均相近。

2.3 HE染色檢查結(jié)果 HE染色切片表現(xiàn)為移植物外周有纖維包膜。實驗組存活脂肪細胞較多，壞死灶較少，細胞較大排列均一，可見微血管生長（圖2a）；HA對照組脂肪細胞形態(tài)較均一，壞死少，炎性細胞少量浸潤（圖2b）；VEGF對照組也可見部分壞死脂肪細胞，炎性細胞浸潤較空白對照組減少，脂肪細胞大小不一（圖2c）；空白對照組可見較多壞死脂肪細胞，炎性細胞浸潤，脂肪細胞大小不一，存活較少（圖2d）。

2.4 蘇丹Ⅲ染色結(jié)果 對照組紅染脂肪較少，排列不規(guī)則，大小不一，有局部纖維化（圖3a）；實驗組紅染脂肪較多，壞死灶較少，細胞較大排列均一（圖3b）。

圖3 蘇丹Ⅲ染色組織學檢查（a：空白對照組；b：實驗組；×200）

2.5 各組小鼠移植物質(zhì)量的比較 見表4。

表4 各組小鼠移植物質(zhì)量的比較（mg）

由表4可見，2、4、8周實驗組小鼠移植物質(zhì)量均明顯高于其他組，HA對照組均明顯高于VEGF對照組及空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；VEGF對照組與空白對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。2.6 各組小鼠微血管計數(shù)的比較 見表5。

表5 各組小鼠微血管計數(shù)的比較（個）

由表5可見，2、4、8周實驗組小鼠微血管計數(shù)均明顯高于其他組，VEGF對照組均明顯高于空白對照組，HA對照組均明顯低于VEGF對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

體表軟組織缺損、凹陷、萎縮是臨床上常見的面部形態(tài)畸形，目前主要常采用自體游離脂肪注射移植、注射性材料充填、或手術植入固體生物代用品，但都有明顯缺點。很多人工材料植入有一定風險，可能出現(xiàn)材料包膜破裂、移位、硬結(jié)、過敏等并發(fā)癥。自體脂肪移植雖然并發(fā)癥較少，但吸收率較高，HA及其它多糖類制劑（如幾丁質(zhì)）降解時間過快，影響臨床應用效果。脂肪前體細胞是從脂肪組織分離出的脂肪干細胞分化出的早期脂肪細胞，通過誘導具有分化增殖的潛能[3-4]。早期脂肪細胞來源廣泛，并且本身具有體外分裂增殖能力，培養(yǎng)后通過脂肪分化的3聯(lián)誘導劑可分化為脂肪細胞[5-6]。

目前，臨床上對脂肪間充質(zhì)干細胞的研究已取得重大進展。Zuk等[4]從脂肪組織中分離出了一種多能干細胞，在不同的刺激下具有成脂肪、成軟骨、成骨和肌原性及神經(jīng)細胞的分化潛能，被稱為脂肪來源干細胞（ADSCs）。作為一種間充質(zhì)干細胞，ADSCs在細胞形態(tài)和免疫學表型上與骨髓干細胞很相似[5-6]。平均300m1脂肪組織可獲得2×108～6×108個細胞，這表明以種子細胞替代終末細胞具有無可比擬的增殖優(yōu)勢。ADSCs通過一系列尚不明確的機制進入脂肪系分化，成為成纖細胞樣的脂肪前體細胞，開始了脂肪分化。這些脂肪前體細胞不像骨髓間充質(zhì)干細胞對培養(yǎng)基中FBS來源和質(zhì)量有嚴格要求，在加有任何批號FBS的DMEM培養(yǎng)基中均能很好地擴增。在傳代培養(yǎng)中，平均倍增時間為60h，并且保持穩(wěn)定的倍增率直至13～15代，其中衰老和死亡細胞的所占比例也很少，這表明脂肪前提細胞體外擴增能力很強，傳代培養(yǎng)易于獲得大量有分化能力的細胞。

3T3-L1可被經(jīng)典的三聯(lián)誘導劑誘導分化為成熟脂肪細胞。誘導劑包括異丁基甲基嘌呤（MIX）、糖皮質(zhì)激素如地塞米松（DEX）和胰島素。MDI誘導1h后，3T3-L1細胞產(chǎn)生一系列早期基因的表達，包括c-fos、c-jun、c-myc以及轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白β和δ（C/EBPβ和C/EBPδ）。c-fos、c-jun、c-myc在誘導2～6h后消失；24h后出現(xiàn)飽和后有絲分裂，在誘導分化第2天，有絲分裂完成，隨后出現(xiàn)特殊的生長抑制稱為GD。該有絲分裂起著解旋DNA，使轉(zhuǎn)錄因子與相應的脂肪分化相關基因元件結(jié)合的作用[7]，此時仍處在低濃度水平的PPARγ和C/EBP α開始升高；在誘導分化第3天，前脂肪細胞開始表達后期標記并在之后的幾天逐漸變成球形出現(xiàn)脂肪滴，最后進入終末分化階段[8]。通過大量實驗為脂肪前體細胞分化為脂肪細胞的重要通路建立了一個模型，C/EBPβ和C/EBPδ的表達誘導首先表現(xiàn)為PPARγ的表達，然后PPARγ與C/EBP s又一起激活C/EBPα的表達，最終PPARγ、C/EBP α分別啟動脂肪分化相關的各種基因表達。在PPARγ缺失的純合子胚胎干細胞中，可以產(chǎn)生正常含量C/EBPβ和δ，而C/ EBPα含量很低[9-10]，提示PPARγ可誘導C/EBP α的表達。實驗研究表明，PPAR γ和C/EBP α之間存在一個正反饋效應環(huán)，促進相互的表達[11]。在此基礎上，大量轉(zhuǎn)錄因子和活性蛋白作用與這條通路的各個環(huán)節(jié)影響脂肪分化過程。對PPARγ基因敲除和嵌合體小鼠的研究證明，PPARγ作為主要的轉(zhuǎn)錄因子，可以獨立地起始整個脂肪誘導分化過程[12-14]。因此，可以通過PCR檢測PPARγ和C/EBPα表達情況了解細胞脂肪分化的程度。

VEGF是血管生成的重要因子，它促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、血管增生、延長血管內(nèi)皮細胞的壽命以及增加血管通透性和血管維持，但VEGF需持續(xù)作用于脂肪移植體及周圍組織才能起到良好的效果[15]。HA是葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖，為雙糖單位組成的直鏈高分子多糖，廣泛存在于組織細胞基質(zhì)中，具有優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性[1]。HA的大分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)通過與水形成氫鍵可結(jié)合大量的水，可以維持局部VEGF水平，同時其獨特的三維結(jié)構(gòu)使之成為理想的種子細胞的支架材料。HA是皮膚組織的主要成分之一，皮膚內(nèi)只要含有足夠量的HA就可以防止皮膚的衰老、脫水，抑制纖維化；而且可以促進創(chuàng)傷愈合，抑制膠原過度沉積而導致的瘢痕。但是作為皮膚支架其易于降解，為了延長其在創(chuàng)面的作用時間，減少降解率，可以將HA與其他天然高分子或者細胞成分復合[16]。

本文結(jié)果顯示，誘導分化后的3T3-L1脂肪細胞移植后在小鼠體內(nèi)前2周，主要以急性炎癥反應包括血運的重建，脂肪細胞的壞死吸收以及轉(zhuǎn)化為前脂肪細胞、炎性細胞浸潤等，2周后隨四周血管的長入，邊緣血運的逐步建立，該部位細胞成活，中央部位細胞壞死吸收及纖維化，此時為慢性炎癥反應，2～3個月后，隨血液循環(huán)的完善，細胞營養(yǎng)充足，前脂肪細胞又分化為成熟的脂肪細胞。2、4、8周實驗組微血管計數(shù)與各組有明顯差異，HA組與空白組無明顯差異，VEGF組與空白組有明顯差異，表明VEGF可以促進移植物血管生長，且該促進作用與HA的緩釋作用有關。實驗組移植物質(zhì)量逐漸下降，此過程為HA逐漸降解。由此可見該HA材料作為支架，VEGF緩釋后產(chǎn)生效應時間＞2周。而移植組織血管形成的時間在2周左右。這期間可以緩釋VEGF，使新生脂肪組織內(nèi)血管有較好的增生條件，從而使新生組織獲得充分血供，以利于其存活。單純的脂肪細胞移植有較多的細胞由于缺少血運重建最終壞死被炎性細胞吸收形成纖維化，而缺少HA作為支架，單純VEGF進入體內(nèi)被迅速代謝降解，與空白對照組無明顯差異；HA對照組與空白對照組差異有統(tǒng)計學意義，提示了HA本身作為一種支架，可能通過其他作用有利于誘導的3T3-L1脂肪前體細胞形成脂肪組織，該現(xiàn)象有待進一步研究。

此外，PCR結(jié)果顯示各組內(nèi)參β-actin條帶均有顯示，密度相似，大小符合446bp區(qū)間。證明結(jié)果可信。作為脂肪分化主要的轉(zhuǎn)錄因子，PPAR-γ、C-EBP α均有明顯表達，所在區(qū)間分別符合226bp和214bp，可以認為是特異性條帶。各組PPAR-γ、C-EBP α條帶密度均相近，說明在體外各組表達無明顯差異。由于VEGF只有在體內(nèi)才能促進血管生長，故在體外細胞實驗各組無明顯差異，進一步證明了VEGF通過促進血管生長來促進脂肪存活，對3T3-L1細胞脂肪分化表達無直接影響。由移植物的生長情況可見，HA4～8周降解趨于平穩(wěn)，形成的脂肪組織逐漸穩(wěn)定，可以認為其內(nèi)已經(jīng)形成了較完善的血運，這些組織已經(jīng)存活，提示降解時間長于4周的HA更適合作為VEGF的載體。

[1]Zuk P A,Zhu M,Mizuno H,et al．Multilineage cells from human adipose tissue:Implications for cell-based therapies[J]．Tissue Engineering,2001,7(2):211-228．

[2]Lee R H,Kim B,Choi I,et al．Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue[J]．Cellular Physiology and Biochemistry,2004, 14(4-6):311-324．

[3]De Ugarte D A,Ashjian P H,Elbarbary A D A,et al．Future of fat as raw material for tissue regeneration[J]．Annals of Plastic Surgery, 2003,50(2):215-219．[4]Harasymiak-Krzyzanowska I,Niedojadlo A,Karwat J,et al．Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications[J]．Cellular&Molecular Biology Letters,2013,18(4):479-493．

[5]Avram M M,Avram A S,James W D．Subcutaneous fat in normal and diseased states-3．Adipogenesis:From stem cell to fat cell [J]．Journal of the American Academy of Dermatology,2007,56(3): 472-492．

[6]Cornelius P,Macdougald O A,Lane M D．Regulation of asipocyte development[J]．Annual Review of Nutrition,1994,14:99-129．

[7]Ntambi J M,Kim Y C．Adipocyte differentiation and gene expression[J]．Journal of Nutrition,2000,130(12):3122s-3126s．

[8]Tontonoz P,Hu E D,Devine J,et al．PPAR-GAMMA-2 tegulates adipose expression of the phosphoenolpyruvatecarboxykinase gene[J]．Molecular and Cellular Biology,1995，15(1):351-357．

[9]Kubota N,Terauchi Y,Miki H,et al．PPAR gamma mediates high-fat diet-induced adipocyte hypertrophy and insulin resistance[J]．Molecular Cell,1999,4(4):597-609．

[10]Wu Z D,Rosen E D,Brun R,et al．Cross-regulation of C/EBP alpha and PPAR gamma controls the transcriptional pathway of adipogenesis and insulin sensitivity[J]．Molecular Cell,1999,3(2): 151-158．

[11]Kapur S K,Katz A J．Review of the adipose derived stem cell secretome[J]．Biochimie,2013,95(12):2222-2228．

[12]Chen Z,Torrens J I,Anand A,et al．Krox20 stimulates adipogenesis via C/EBP beta-dependent and-independent mechanisms[J]．Cell Metabolism,2005,1(2):93-106．

[13]Tang Q Q,Lane M D．Activation and centromeric localization of CCAAT/enhancer-binding proteins during the mitotic clonal expansion of adipocyte differentiation[J]．Genes&Development, 1999，13(17):2231-2241．

[14]Oishi Y,Manabe I,Tobe K,et al．Kruppel-like transcription factor KLF5 is a key regulator of adipocyte differentiation[J]．Cell Metabolism,2005,1(1):27-39．

[15]Koutnikova H,Cock T A,Watanabe M,et al．Compensation by the muscle limits the metabolic consequences of lipodystrophy in PPAR gamma hypomorphic mice[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100 (24):14457-14462．

[16]Rosen E D,Sarraf P,Troy A E,et al．C/EBP alpha induces adipogenesis through PPAR gamma:a unified pathway[J]．Genes& Development,2002,16(1):22-26．

The study of injection of 3T3-L1 preadipocyte and hyaluronic acid scaffold combined with VEGF

ObjectiveTo evaluate the effect of increasing the survival rate of mouse 3T3-L1 after transplantation with hyaluronic acid(HA)gel scaffold and vascular endothelial growth factor(VEGF)．Methods After cell culture and differentiation induction in vitro,gene expression of peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ)and CCAAT/enhancer-binding proteinα (C/EBP α)was tested．HA-VEGF group(3×106induced 3T3-L1+0．6ml PBS+0．6ml HA),HA group(3×106induced 3T3+0．6mlPBS+0．6mlHA),VEGF group(3×106induced 3T3+1．2mlPBS+20ng/mlVEGF)and control group(3×106induced 3T3+1．2mlPBS)were set up to transplant the components．The mice were executed after 2,4,and 8 weeks．Morphology and pathology evaluation were performed to exam the tissue specimen．The weight measurement of the tissue specimen and the microvessel counting were also performed． Results After culture and differentiation induction in vitro,the band density of PPARγand C/EBP α were similar between groups by PCR test．The HE and Sultan III staining result indicated that VEGF combined with hyaluronic acid transplantation group had regular cell size,more cell survival,less necrosis than other groups．After 2,4 and 8 weeks,Graft weight of HA-VEGF group was significant higher than other groups．Graft weight of HA groups was significant higher than VEGF group and control group．The results had statistical difference(P＜0．05)．After 2,4 and 8 weeks,the microvessel density of HA-VEGF group was significant higher than other groups．Microvessel density of VEGF groups was significant higher than HA group and control group．The results had statistical difference(P＜0．05)． Conclusion Intradermal injection of 3T3-L1 preadipocyte by hyaluronic acid scaffold combined with VEGF increases the rate of survival of transplanted tissue．

Hyaluronic acid Mouse 3T3-L1 preadipocyte VEGF

2014-01-23）

（本文編輯：歐陽卿）

321000 金華市中心醫(yī)院整形美容中心（童蕓、王曉芬、吳芳、郭梅菊）；浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院（沈輝）