查日維， 謝曉梅， 楊 沫， 周亞菁， 吳 茜， 王 鍵

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院， 現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室， 安徽省 “115” 新安醫(yī)藥研究與開發(fā)產業(yè)創(chuàng)新團隊， 安徽 合肥 230031）

基于層次分析法的多指標綜合評價優(yōu)選宣木瓜提取方法

查日維， 謝曉梅*， 楊 沫， 周亞菁， 吳 茜， 王 鍵

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院， 現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室， 安徽省 “115” 新安醫(yī)藥研究與開發(fā)產業(yè)創(chuàng)新團隊， 安徽 合肥 230031）

目的 優(yōu)選制備宣木瓜生物活性成分提取物的提取方法。方法 比較滲漉提取法、超聲提取法和回流提取法，以齊墩果酸、 熊果酸、 可滴定總有機酸、 總多酚、 總多糖的量以及提取物收率為考察指標， 采用層次分析法 （AHP）確立權重，以多指標綜合評分法對提取方法進行評價。結果 3種提取方法所得宣木瓜提取物的收率及各類成分含有量有較大的差異， 最佳提取方法為回流提取法， 一致性檢驗結果 （CR＜0.1） 表明權重系數(shù)合理有效。 結論 基于AHP法的多指標綜合評價提取方法具有科學性和準確性， 研究內容可為宣木瓜提取物的制備和質量控制提供參考。

宣木瓜；提取方法；層次分析法；多指標綜合評價

宣木瓜，又名皺皮木瓜、鐵腳梨，為薔薇科植物貼梗海棠 Chaenomelesspeciosa （ Sweet） Nakai的近成熟果實； 是安徽道地藥材；有舒筋活絡、和胃化濕功效，中醫(yī)臨床用于濕痹拘攣、腰膝關節(jié)酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉筋攣痛、腳氣水腫［1］。 研究表明， 宣木瓜中富含具有鎮(zhèn)痛抗炎作用的有機酸類化合物、增強免疫活性及抗氧化作用的三萜類化合物、對胃腸平滑肌有松弛作用的黃酮類化合物以及具有抗氧化活性作用的多糖類化合物［2-5］。 近年來已有對木瓜提取物的藥效研究［6-9］， 但鮮見木瓜提取物提取方法評價的報道。中藥提取物是對藥材的深度加工，具有技術水平高、產品附加值大， 質量易于控制等優(yōu)勢［10］。 本研究在前期實驗的基礎上， 采用先用 75%乙醇提取， 殘渣再用水提取的方法制備宣木瓜提取物， 通過對提取物中齊墩果酸 （oleanolic acid， OA） 和熊果酸 （ ursolic acid， UA） 、 可滴定總有機酸、總多酚、總多糖四類活性成分的定量測定，比較超聲、回流、滲漉3種常用中藥提取方法，結合提取物收率，采用 AHP綜合評判， 優(yōu)選宣木瓜最佳提取方法， 以期為宣木瓜提取物的制備、質量控制及后續(xù)研究提供科學依據(jù)和參考資料。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Agilent1260 高 效 液 相 色 譜 儀 （ Agilent公 司）；756MC紫外可見分光光度計 （上海精密科學儀器有限公司） ； BP221D電子 天 平 （ Sartorius公 司 ） ； KQ-250DB數(shù) 控超聲波清洗器 （ 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司） ； Milli-Q實驗室超純水系統(tǒng) （ Merck Millipore公司） ； pH S-3CT型精密酸度計 （上海大普儀器有限公司）； 電磁攪拌器； HHS型電熱恒溫水浴鍋 （上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 試藥 宣木瓜來源于安徽宣城， 經(jīng)本院彭華勝教授鑒定為貼梗海棠 Chaenomeles sepciosa （ Sweet） Nakai的近成熟果實； 齊墩果酸 （ 批號為 110709-200505）、 熊果酸 （批號為 110742-200516）、 沒食子酸 （批號為 110831-200302） 對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；鄰苯二甲酸氫鉀為基準物質；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 提取方法 精密稱取宣木瓜粗粉 5 g， 采用常規(guī)提取條件，按下述方法進行提取試驗，各方法平行兩份。

2.1.1 超聲提取 加 75%乙醇 60 mL于樣品中， 浸泡 0.5 h， 室溫超聲 1 h， 濾過， 濾渣加 60 mL水浸泡 0.5 h， 室溫超聲1 h， 濾過， 合并濾液， 濃縮， 真空干燥至恒定質量。

2.1.2 回流提取 加 75%乙醇 60mL于樣品中， 浸泡 0.5 h， 80 ℃回流 1 h， 濾過， 濾渣加 60mL水浸泡 0.5 h， 100℃回流 1 h， 濾過， 合并濾液， 濃縮， 真空干燥至恒定質量。

2.1.3 滲漉提取 加 75%乙醇 180mL于樣品中， 浸泡 24 h， 以 3 mL/min 體積流量滲漉， 濾渣加 180 mL水浸泡 0.5 h， 以 3 mL/min 體積流量滲漉， 合并滲漉液， 濃縮， 真空干燥至恒定質量。

2.2 多指標成分測定方法

2.2.1 HPLC法測定齊墩果酸和熊果酸［11］

2.2.1.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取 “2.1” 項下提取方法所制得的提取物 0.35 g， 置具塞錐形瓶中， 精密加甲醇 25mL， 密塞， 稱定質量， 超聲處理 （功率 250 W，頻率 40 kHz） 20 min， 放冷， 再稱定質量， 用甲醇補足減失的質量， 搖勻， 濾過， 棄去初濾液， 續(xù)濾液過 0.45 μm濾膜，備用。

2.2.1.2 齊墩果酸、 熊果酸對照品溶液的制備 精稱齊墩果酸對照品 3.82 mg， 加甲醇溶解， 定容至 10 mL量瓶中，得齊墩果酸貯備液。 精稱熊果酸對照品4.34mg， 加甲醇溶解， 定容至10mL量瓶中， 得熊果酸貯備液。 分別精密量取各貯備液適量混合， 得每1 mL含齊墩果酸0.191 mg、 熊果酸 0.217 mg。

2.2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用 Shim-packCLCODS （M） 色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 甲醇-水-冰乙酸-三乙胺 （265 ∶35 ∶0.1 ∶0.05） 為流動相， 體積流量0.6mL/min； 柱 溫 20 ℃， 檢測 波 長 210 nm， 進樣 量 20 μL。 齊墩果酸理論塔板數(shù)在16 000以上， 齊墩果酸和熊果酸分離度達 1.6。 3 種提取方法所得提取物的 HPLC譜圖見圖1。 各提取物中齊墩果酸和熊果酸的量按外標一點法計算。

圖1 宣木瓜提取物 HPLC譜圖

2.2.2 電位滴定法測定總有機酸［12］

2.2.2.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取 “2.1” 項下各提取方法所制得的提取物 0.45 g至錐形瓶中， 精密加水30mL， 超聲 30 min， 冷卻至室溫， 稱重， 加水補足減失的質量，抽濾，棄去初濾液，續(xù)濾液備用。

2.2.2.2 測定方法 精密量取供試品溶液 15 mL， 按電位滴定法 （ 《中國藥典》 2010 年版一部附錄ⅧA）， 用已標定濃度的 NaOH標準液 （0.056 8 mol/L） 滴定至終點。 利用Origin 6.0 Professional軟件繪制滴定曲線， 由二級微商內插法計算滴定終點，以蘋果酸計，按下式計算各提取物中可滴定總有機酸量。

式中： C為氫氧化鈉標準溶液濃度 （mol/L）， V為計量點時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積 （mL）， V0為空白時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積 （m L）， M為蘋果酸摩爾質量（g/mol）， W為提取物質量 （g）。

2.2.3 福林-酚比色法測定總多酚

2.2.3.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取 “2.1” 項下提取方法所制得的提取物 0.15 g， 至錐形瓶中， 精密加水30mL， 放置過夜， 超聲 10 min， 濾過， 棄去初濾液， 續(xù)濾液備用。

2.2.3.2 沒食子酸對照品溶液的制備 精稱沒食子酸對照品適量，置棕色量瓶中，加水溶解、稀釋至刻度，得每1 m L含沒食子酸 0.322 mg。

2.2.3.3 測定方法 按 《中國藥典》 2010 年版一部附錄ⅩB總酚測定法， 精密量取供試品溶液2mL至25 mL量瓶中， 加磷鉬鎢酸 1.0mL、 水 10.0mL， 用 7.5%Na2CO3定容至 25mL， 暗處放置 3 h， 照紫外-可見分光光度法 （ 附錄ⅤA）， 在 400 ～800 nm波長范圍內掃描紫外吸收光譜，于最大吸收波長 763 nm處測定各樣品吸光度， 利用標準曲線法計算各提取物中總多酚的量。

2.2.3.4 標準曲線的繪制 分別精密量取沒食子酸對照品溶液 0.030、 0.070、 0.20、 0.40、 0.80、 1.0 mL至 25 mL量瓶中， 加磷鉬鎢酸 1.0 mL， 再加水至 13 mL， 用 7.5% Na2CO3定容至刻度， 暗處放置 3 h， 以相應試劑溶液為空白， 在 763 nm 處 測 定 吸 光 度。 得 到 回 歸 方 程 為 Y= 114.85X+0.103 1， r=0.999 5， 沒食子酸在 0.386 ～12.9 μg/mL質量濃度范圍內與吸光度線性關系良好。

2.2.4 硫酸-苯酚法測定總多糖［13］

2.2.4.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取 “2.1” 項下提取方法所制得的提取物 0.45 g， 至錐形瓶中， 精密加水30 mL， 超聲 30 min， 冷卻至室溫， 稱重， 加水補足減失的質量， 抽濾， 棄去初濾液， 精密量取續(xù)濾液 2 mL至 10 mL離心管中， 加無水乙醇 8mL； 離心 （4 000 r/min） 1 h， 棄去上清液， 沉淀加水溶解， 定容至25mL量瓶中， 備用。

2.2.4.2 葡萄糖對照品溶液的制備 精稱葡萄糖對照品適量， 置量瓶中， 加水溶解、稀釋至刻度， 得每1 mL含葡萄糖0.099 2 mg。

2.2.4.3 測定方法 精密量取供試品溶液 1 mL至具塞試管， 加 5%苯酚 1.0 mL， 混勻； 加濃硫酸 6.0 mL， 立即搖勻； 沸水浴加熱 10min， 冷卻至室溫； 照紫外-可見分光光度法 （附錄ⅤA） 在 400 ～800 nm波長范圍內掃描紫外吸收光譜， 于最大吸收波長 485 nm處測各樣品吸光度， 利用標準曲線法計算各提取物中總多糖的量。

2.2.4.4 標準曲線的繪制 精密量取葡萄糖對照品溶液0.10、 0.20、 0.40、 0.80、 1.0 mL至具塞試管中， 加水至1.0 mL， 加 5%苯酚 1.0 m L混勻， 加濃硫酸 6.0 mL， 立即搖勻， 沸水浴 10min， 冷卻至室溫， 以相應試劑溶液為空白， 在 485 nm處測吸光度。 得回歸方程 Y=4.260 8X+ 0.114 1， r=0.999 4， 葡萄糖在 9.92 ～99.20 μg/mL質量濃度范圍內與吸光度線性關系良好。

2.3 AHP法確定多指標權重系數(shù) 層次分析法 （ Analytical Hierarchy Process， AHP）［14］是 將評價目標分 為 若 干層次和若干指標，依照不同權重進行綜合評價的方法。本研究將評價體系設計為三層， 如圖2。 引入九分位的相對重要的比例標度［15］， 由評估主體確定各指標的相對重要性， 并將結果形成判斷矩陣，結果見表1。

圖2 宣木瓜最佳提取方法層次結構模型

表1 宣木瓜提取方法優(yōu)選指標層的矩陣

使用AHP分析軟件進行具體計算， 求得齊墩果酸和熊果酸、總有機酸、總多酚及總多糖各指標權重系數(shù)為：0.564、 0.263、 0.118 和 0.055。 隨機一致性比率 CR=CI/ RI， 當 CR＜0.1 時， 判斷矩陣具有滿意的一致性及權重計算正確性。 本次試驗的一致性比率為 CR=0.043 ＜0.1， 表明權重計算正確。

2.4 結果

2.4.1 提取物得率 按 “2.1” 項下不同提取方法制備提取物， 得率見表2。

表2 不同提取方法所得提取物的得率

2.4.2 多指標成分測定結果 按 “2.2” 項下測定方法對提取物進行分析檢測，相同測定平行兩次，以平均值表示；并采用 AHP法確定的權重系數(shù)進行綜合評價， 結果見表3。

3 結論與討論

3.1 最佳提取方法的確立 從表 3 中可以看出提取物中可滴定總有機酸、總多酚含有量高低順序為：回流法＞超聲法＞滲漉法； 總多糖含有量高低順序為： 回流法 ＞滲漉法＞超聲法；齊墩果酸和熊果酸總含有量高低順序為：超聲法 ＞回流法 ＞滲漉法。 基于 AHP的綜合評分法得到的評分高低順序為： 回流法＞超聲法＞滲漉法。 由表2可見，3種不同的提取方法提取物得率順序為：回流法＞滲漉法＞超聲法；由此確立宣木瓜的最佳提取方法為回流提取法。

表3 宣木瓜不同提取方法的綜合評價

3.2 提取溶劑的選擇 在宣木瓜提取物的制備中， 兼顧傳統(tǒng)中藥的提取溶劑， 參考 《中國藥典》 2010 年版一部關于中藥成方制劑制備中的飲片提取工藝，在前期實驗的基礎上， 建立先用 75%乙醇提取， 再用水提取的工藝流程， 以期最大程度保持宣木瓜水溶性和脂溶性有效成分的整體性。

3.3 本實驗對各指標成分的定量測定方法均采用文獻報道的成熟方法，其方法學考察同文獻報道。在提取物考察指標的選擇上，結合對宣木瓜傳統(tǒng)的評價標準 “以味酸者為佳” 以及 《中國藥典》 2010 年版一部木瓜質量標準含量測定指標成分，選擇齊墩果酸和熊果酸、總有機酸為考察指標；并綜合考慮宣木瓜中酚酸類和黃酮類化合物藥效學活性及多糖的活性，增加總多酚和多糖作為共同的考察指標。

［ 1 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典： 2010 年版一部［S］.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010： 57.

［2］ 李 娜，金敬紅，姜洪芳， 等.宣木瓜總有機酸的純化及鎮(zhèn)痛抗炎作用［J］.中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（1） ：113-119.

［3］ 袁志超，汪芳安，王慧溪， 等.皺皮木瓜提取物增強體內免疫活性研究［J］.武漢工業(yè)學院學報， 2007， 26 （2）：22-26.

［4］ 孔勁松，楊興海，柳 蔚.皺皮木瓜總黃酮對胃腸平滑肌的松弛作用及其機制分析［J］.時珍國醫(yī)國藥， 2007， 18（9）： 2123-2124.

［5］ 劉 捷，王 文，盧 奎， 等.皺皮木瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐， 2008， 22（6）： 76-79.

［6］ 吳 虹，戴 敏，魏 偉， 等.木瓜中不同提取物的藥效學研究［J］.中國中醫(yī)藥科技， 2004， 11（2）： 98-99.

［7］ 劉朝霞，胡士德，鄒 坤， 等.資木瓜乙醇提取物的體外抗氧化活性研究［J］.三峽大學學報：自然科學版 ， 2008，30（4）： 72-75.

［8］ 王旭東， 董 明， 李 娜， 等.宣木瓜粗提物抑菌作用的研究［J］.食品工業(yè)科技， 2011， 32（12）： 175-179.

［9］ 郎和東， 陳 卡， 唐 勇， 等.木瓜提取物及牛磺酸復合制劑抗疲勞隨機雙盲對照研究［ J］.重慶醫(yī)學， 2012， 41（10）： 940-941.

［10］ 閆慶松， 楊 悅， 于志斌.提高我國植物提取物產業(yè)國際競爭 力 之 探 討 ［ J］.中 國 新 藥 雜 志， 2012， 21 （ 2 ）：119-123.

［11］ 呂美紅， 謝曉梅， 查孝柱， 等.反相高效液相色譜法測定木瓜藥材及飲片中齊墩果酸和熊果酸含量［J］.安徽中醫(yī)學院學報， 2010， 29（3）： 72-75.

［12］ 朱晨晨， 程菁菁， 謝曉梅， 等.中藥木瓜水溶性總有機酸含量比較 ［J］.現(xiàn)代中藥研究與實 踐， 2011， 25 （3）：75-76.

［13］ 劉勁松， 劉金旗.不同質地木瓜中多糖含量測定［J］.安徽醫(yī)藥， 2008， 12（7）： 607-608.

［14］ 王 暉， 陳 麗， 陳 墾， 等.多指標綜合評價方法及權重系數(shù)的選擇 ［ J］.廣東藥學院學 報， 2007， 23 （5）：583-589.

［15］ 任愛農， 盧愛玲， 田耀洲， 等.層次分析法用于中藥復方提取工藝的多指標權重研究［J］.中國中藥雜志， 2008，33（4）： 372-374.

R284.2

： B

： 1001-1528（2014）03-0643-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.047

2013-04-12

國家十二五科技支撐計劃 （2011BAI04B06） ； 安徽高校省級自然科學研究項目 （ KJ2012A188）

查日維 （1989—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥質量分析。 Tel： （0551） 65169230， E-mail： 351772334@qq.com

*通信作者： 謝曉梅， 女， 教授， 碩士生導師。 Tel： （0551） 65169230， E-mail： xiexiaomei9401@sina.com