于鶴云， 劉漢清*， 劉 嘉， 唐海濤， 張 平， 張 堅

（1.南京中醫(yī)藥大學， 江蘇 南京 210046； 2.江蘇建康職業(yè)學院， 江蘇 南京 210029； 3.江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司， 江蘇 姜堰 225500）

D-101 型大孔吸附樹脂純化黃蜀葵花總黃酮的工藝研究

于鶴云1， 劉漢清1*， 劉 嘉2*， 唐海濤3， 張 平3， 張 堅1

（1.南京中醫(yī)藥大學， 江蘇 南京 210046； 2.江蘇建康職業(yè)學院， 江蘇 南京 210029； 3.江蘇蘇中藥業(yè)集團股份有限公司， 江蘇 姜堰 225500）

目的 優(yōu)選 D-101 型大孔吸附樹脂純化黃蜀葵花總黃酮的工藝參數(shù)。 方法 以總黃酮、 金絲桃苷、 異槲皮苷、楊梅素、蘆丁和槲皮素的回收率、總黃酮純度為指標，采用Z分綜合評分法，通過正交試驗優(yōu)選黃蜀葵花總黃酮的純化工藝。 結(jié)果 確定最優(yōu)條件為藥液總黃酮質(zhì)量濃度 4.23 mg/mL， pH 4.17， 上樣體積流量 2 BV/h （BV為柱體積），5 BV水和 3 BV5%乙醇除雜， 7 BV 70%乙醇洗脫， 洗脫體積流量 2 BV/h。 結(jié)論 該工藝條件對黃蜀葵花總黃酮的純化效果較好。

大孔吸附樹脂；黃蜀葵花；總黃酮；純化工藝

黃蜀葵 Abelmoschusmanihot（L.） Medic是錦葵科秋葵屬植物［1］， 其花中主要含有黃酮類、鞣質(zhì)類、 有機酸類和 長烴類等化合物［2］， 黃酮類物質(zhì)是目前所知的主要有效成分，黃葵膠囊即是從黃蜀葵花中提取有效成分制成的膠囊劑，臨床主要用于治療各類慢性腎臟?。?］。 工藝生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)黃葵干浸膏中間體易吸濕，并且膠囊服用劑量較大（一天3 次， 一次 5 粒）， 為此本實驗研究大孔吸附樹脂純化富集總黃酮部位，去除部分易吸濕的雜質(zhì)，減小膠囊服用量。

1 儀器和材料

Ultimate 3000 高效 液相色譜儀 （ 美國 Dionex公司）； Lambda 25 紫外可見分光光度計 （美國PerkinElmer公司） ；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 （ 金壇富華儀器有限公司）； RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（ 鄭州亞榮儀器有限公司） ； Molelement 1710V超純水機 （ 上海摩勒生物科技有限公司）； GT10-1高速臺式離心機 （北京時代北利離心機有限公司）。

金絲 桃 苷 （ 111521-201004， 純 度 以 93.9%計）、 蘆丁 （100080-200707，純度以 90.5% 計）、槲皮素 （100081-200907， 純度以 96.5%計） 均購于中國食品藥品檢定研究院；楊梅素 （上海同田生物技術(shù) 有 限 公司， 批 號 為 11012622， 純度 ≥98%）、異槲皮苷 （四川維克奇生物科技有限公司， 批號為 201010， 純度≥98%）。 D-101 型大孔吸附樹脂 （天津市海光化工有限公司）。乙腈， 色譜純；其余試劑均為分析純。黃蜀葵花 （產(chǎn)地為興化）經(jīng)南京中醫(yī)藥大學談獻和教授鑒定為錦葵科的黃蜀葵。

2 方法和結(jié)果

2.1 紫外分光光度法測定總黃酮的標準曲線繪制精密稱取減壓干燥 12 h以上的 金 絲 桃苷對照品適量， 用無水乙醇定容配制成質(zhì)量濃度為0.128 4 mg/mL的對照品溶液， 精密移取對照品溶液 1、 2、3、 4、 5、 6 mL于 25 mL量 瓶 中， 加 蒸 餾 水 至 6 mL， 分 別 準 確 加 入 5 mL醋 酸 鹽 緩 沖 液 （2 mol/L醋酸液∶2 mol/L醋酸鈉溶 液 =3 ∶1） 和 0.1 mol/L的三氯 化 鋁 溶 液 3 m L， 用 蒸 餾 水 定 容 到 刻 度， 混勻， 放置 30 min， 另取 6 mL蒸 餾 水 同 法 制 備 空 白對照溶液， 在 402 nm波長處測定吸光度， 以 吸光度值為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線［4］， 得線 性 方 程 為 A=0.029 9C+0.015 3， r= 0.999 9， 金 絲 桃苷在 5.136 ～30.816 μg/mL范 圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 HPLC法同時測定 5 種成分的標準曲線繪制

2.2.1 色 譜 條件 Thermo scientific Hypersil GOLD色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） ， 檢 測 波 長 為360 nm，柱溫 30 ℃， 體 積 流 量 為 0.8 mL/min，流動相為乙腈 -0.2%磷酸水， 按表 1 進行梯度洗脫，此條件下對照品與樣品均達到較好的分離效果［5］，見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution p rogram

2.2.2 標準曲線繪制 精密稱取減壓干燥 12 h 以上的金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、蘆丁和槲皮素對照品適量，用甲醇定容配制成質(zhì)量濃度分別為1.615、 1.227、 0.543、 0.091、 0.178 mg/mL的對照品溶液， 精密移取上述對照品溶液各1 mL于10 m L量瓶中， 用甲醇定容即得金絲桃苷 0.161 5 mg/mL、 異槲皮苷0.122 7 mg/mL、 楊梅素0.054 3 mg/mL、蘆 丁 0.009 1 mg/mL、槲 皮 素 0.017 8 mg/mL的混合對照溶液。 取混合對照溶液分別稀釋成初始質(zhì)量濃度的 1、 1/2、 1/4、 1/8、 1/16、 1/32的系列混合對照溶液， 分別進樣 10 μL， 以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得線性方程為： 金絲桃苷 Y1=0.325 15X1+0.117 66，r1=0.999 99； 異槲皮苷 Y2=0.297 47X2+0.070 86，r2=0.999 99； 楊梅素 Y3=0.523 25X3-0.098 16， r3=0.999 97；蘆丁 Y4=0.238 01X4-0.003 64，r4=0.999 98； 槲皮素 Y5=0.680 8X5-0.108 3，r5=0.999 9。 金絲桃苷在 5.048 ～161.528 μg/mL范圍內(nèi)、 異槲皮苷在 3.833 ～122.655 μg/mL范圍內(nèi)、 楊梅素在1.697 ～54.292 μg/mL范圍內(nèi)、 蘆丁在 0.283 ～9.050 μg/mL范圍內(nèi)、 槲皮素在0.556 ～17.795 μg/m L范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

圖1 混合對照品 （A） 與樣品 （B） 的 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s ofm ixed reference substances（A） and sample（B）

2.3 樣品溶液的配制方法 稱取黃蜀葵花適量，加入20 倍量 70%乙醇提取 3 次， 每次 1 h， 合并提取液后濃縮至無醇味，加適量蒸餾水稀釋，離心去除水不溶性雜質(zhì)， 制得含總黃酮為 12.10 mg/mL的樣品溶液。

2.4 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 取 D-101 大孔吸附樹脂適量， 用 95%乙醇浸泡 24 h 后， 濕法裝柱，用 95%乙醇沖洗至流出液加水無渾濁現(xiàn)象， 再用蒸餾水沖洗至無醇味，備用。

2.5 Z分綜合評價法 本實驗選取總黃酮、 金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、蘆丁、槲皮素回收率以及總黃酮純度為指標，采用Z分綜合評價法將多指標進行歸一化處理［6］， 計算公式如下：

Zi=/Si其中：Xi為指標值為指標值的平均值，Si為指標值的標準差［7］。

2.6 分離純化實驗的單因素考察

2.6.1 上樣質(zhì)量濃度的考察 量取 350 mL總黃酮質(zhì)量濃度為 12.10 mg/mL樣品溶液 5 份，分別稀釋成 1.13、4.23、 6.72、 8.63、12.10mg/mL的樣品溶液。 量取 100 m L經(jīng)過預(yù)處理的 D-101 型樹脂，濕法裝柱，將上述5份樣液分別濕法上樣，上樣體積流量為4 BV/h， 用 5 BV蒸餾水沖洗， 再用 5 BV 70%乙醇以 4 BV/h 的體積流量進行解吸附， 收集乙醇洗脫液， 按 “2.1”、 “2.2” 項下方法分別測定總黃酮和5種成分的回收率，另取乙醇洗脫液50 mL于蒸發(fā)皿中， 105 ℃干燥至恒定質(zhì)量， 利用差量法測定含固量，計算總黃酮純度，實驗重復(fù)3次取其平均值， 結(jié)果見表2。

黃酮回收率%=洗脫液中黃酮量/樣品溶液中黃酮量 ×100%

總黃酮純度%=洗脫液中黃酮量/洗脫液的總含固量 ×100%

表2 不同上樣質(zhì)量濃度的考察結(jié)果Tab.2 Resu lts of different concentrations of sam p le solution

由表 2 可知， 藥液的總黃酮質(zhì)量濃度在4.23 ～6.72 mg/mL范圍內(nèi)純化效果較好。

2.6.2 上樣藥液 pH的考察 量取 5 份總黃酮質(zhì)量濃度為 4.23 mg/mL樣品溶液各 1L， 分別調(diào) pH值為 2.18、 4.17、 6.01、 8.00、 9.98， 同法上樣、洗脫、 檢測，其結(jié)果見表3。

表3 不同藥液 pH的考察結(jié)果Tab.3 Results of different pH values of sample solution

由表 3 可知， 藥液 pH在2.18 ～4.17 范圍內(nèi)純化效果較好。

2.6.3 上樣體積流量的考察 量取 4 份總黃酮質(zhì)量濃度為 4.23 mg/mL樣品溶液各 1 L分別以 2 BV/h、 4 BV/h、 6 BV/h、 8 BV/h 的體積流量上樣， 同法洗脫、 檢測， 其結(jié)果見表4。

由表 4 可知， 上樣體積流量為 2 BV/h、 4 BV/h時純化效果較好。

表4 不同上樣體積流量的考察結(jié)果Tab.4 Resu lts of different flow rates of sam p le solution

2.6.4 不同體積分數(shù)乙醇洗脫的考察 量取 5 份總黃酮質(zhì)量濃度為 4.23 mg/mL樣品溶液各 1 L依法上樣、 水洗， 再分別用 5 BV 的 30%、 50%、70%、80%、95%乙醇進行解吸附，收集洗脫液依法檢測， 其結(jié)果見表5。

表5 不同體積分數(shù)乙醇的考察結(jié)果Tab.5 Results of different con tents of ethanol

由表 5 可知， 乙醇洗脫體積分數(shù)在 70% ～95%范圍內(nèi)純化效果較好。

2.6.5 乙醇洗脫體積的考察 量取 4 份總黃酮質(zhì)量濃度為4.23mg/mL樣品溶液各1L依法上樣、水洗，分別用 1BV、 3BV、 5BV、 7BV的 70%乙醇進行解吸附， 收集洗脫液依法檢測， 其結(jié)果見表6。

由表6可知， 當乙醇用量達到 5 BV以后，各指標值均較高。

2.6.6 乙醇洗脫體積流量的考察 量取 4 份總黃酮質(zhì)量濃度為 4.23 mg/mL樣品溶液各 1 L同法上樣、 水洗，再用 5 BV 70%乙醇分別以 2、 4、 6、 8 BV/h 的體積流量進行解吸附， 收集洗脫液依法檢測， 其結(jié)果見表7。 由表7可知， 乙醇洗脫體積流量為 2、 4 BV/h 時純化效果較好。

2.6.7 除雜洗脫條件的考察 量取 4 份總黃酮質(zhì)量濃度為 4.23 mg/mL樣品溶液各 1 L同法上樣，分別用 5 BV蒸餾水、 8 BV蒸餾水、 5 BV蒸餾水 +3 BV5%乙醇、 5 BV蒸餾水 +5 BV10%乙醇進行沖洗后， 再用 70%乙醇解吸附， 收集洗脫液依法檢測， 其結(jié)果見表8。

表8 不同除雜洗脫條件的考察結(jié)果Tab.8 Results of different parameters of washing p rogram

由表 8 可知， 用 5BV水和 5BV水 +3BV5%乙醇沖洗雜質(zhì)，純化效果較好。

2.7 正交試驗 以單因素實驗結(jié)果確定的各因素較優(yōu)范圍， 按 L8（27） 正交表進行實驗， 因素水平見表 9， 實驗結(jié)果見表 10， 其直觀分析見表 11，方差分析見表 12。

表9 因素水平Tab.9 Factors and levels

表 10 正交試驗結(jié)果Tab.10 Results of orthogonal experiment

表 11 正交試驗結(jié)果的直觀分析Tab.11 Intuitive analysis table

表 12 正交試驗結(jié)果的方差分析Tab.12 Analysis of variance table

由表 11、 12 可知，上樣流量和上樣 pH具有顯著性差異 （P＜0.05）， 因素影響大小為： A＞ B＞G ＞ D ＞ E ＞ C ＞ F， 最 佳 工 藝 為A1B2C1D2E1F2G2， 即上樣體積流量為 2 BV/h， 上樣 pH為 4.17， 上樣質(zhì)量濃度為 4.23 mg/m L， 乙醇體積分數(shù) 70%， 乙醇洗脫體積流量為 2 BV/h，除雜洗脫條件為 5 BV+3 BV5%乙醇，乙醇洗脫體積為7 BV。

2.8 驗證試驗 量取 3 份已經(jīng)過預(yù)處理的 D-101樹脂300 mL， 濕法裝柱， 取 3 份總黃酮質(zhì)量濃度為 4.23 mg/mL的樣品溶液 3 L均調(diào)節(jié) pH至 4.17，濕法上樣， 上樣流量為 2 BV/h， 用 5 BV水和 3 BV5%乙醇除去雜質(zhì)，再用 5 BV的 70%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，與正交試驗同法檢測，結(jié)果見表 13。

表 13 驗證試驗結(jié)果Tab.13 Results of verification tests

由結(jié)果可知，按優(yōu)選出的方案純化黃蜀葵花總黃酮能達到很好的效果。

3 討論

3.1 本 實 驗 考 察 了 AB-8、 D-101、 HPD-100、NKA-9 四種不同型號的樹脂對黃蜀葵花總黃酮的純化效果，以靜態(tài)吸附率、靜態(tài)解吸率、動態(tài)吸附率和動態(tài)解吸率為指標優(yōu)選出 D-101 型樹脂， 其純化效果較好。3.2 黃葵膠囊中活性成分為總黃酮， 藥典中以金絲桃苷的量為指標，本實驗以總黃酮、異槲皮苷、楊梅素、蘆丁和槲皮素的回收率為綜合指標，能更全面客觀的說明 D-101 型大孔吸附樹脂純化黃蜀葵花總黃酮方法的可行性和科學性。3.3 根據(jù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)楊梅素和槲皮素的回收率很高， 甚至大于 100%， 一方面原因是 D-101 對楊梅素和槲皮素的吸附和解吸附效果很好，另一方面可能的原因是部分金絲桃苷、槲皮苷等類似母核的黃酮類成分在酸性條件下水解成槲皮素等［8］， 具體原因有待進一步研究。

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Purification of total flavonoids from Abelmoschusmanihot（ L.） M edic by D-101 m icroporous resin

YU He-yun1， LIU Han-qing1*， LIU Jia2*， TANG Hai-tao3， ZHANG Ping3， ZHANG Jian1
（1.Nanjing University of Traditional ChineseMedicine， Nanjing 210046， China； 2.Jiangsu Jiankang Vocational College， Nanjing 210029， China；3.Jiangsu Suzhong Pharmaceutical Group Co.， Ltd， Taizhou 225500， China）

microporous resin； abelmoschusmanihot（ L.） Medic； total flavonoids； purification process

R284.2

： A

： 1001-1528（2014）03-0520-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.016

2013-05-16

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項資金項目 （BA2012131）

于鶴云 （1989—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥藥劑學。 Tel： 18362315623， E-mail： 517193174@qq.com

*通信作者： 劉漢清 （1947—） ， 男， 教授， 研究方向： 藥物新劑型與新工藝。 Tel：（025）85811517， E-mail： nzyhqliu@126.com劉 嘉 （1983—）， 男， 講師， 研究方向： 藥物劑型與信息。 Tel： 13770704461