劉 悅， 龔蘇曉， 張鐵軍*， 王思路， 胡 喬

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)， 天津 300070； 2.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥物代謝動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193； 3.天津藥物研究院中藥現(xiàn)代制劑與中藥質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家和地方工程實(shí)驗(yàn)室， 天津 300193）

頭痛滴丸不同提取工藝指紋圖譜比較研究

劉 悅1，2，3， 龔蘇曉2，3， 張鐵軍2，3*， 王思路1，2，3， 胡 喬1，2，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)， 天津 300070； 2.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥物代謝動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193； 3.天津藥物研究院中藥現(xiàn)代制劑與中藥質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家和地方工程實(shí)驗(yàn)室， 天津 300193）

目的 優(yōu)選頭痛滴丸 （川芎、藁本、 菊花、 白芷、 鉤藤） 最佳提取方法。方法 采用高效液相色譜法， 建立頭痛滴丸的化學(xué)成分指紋圖譜的測(cè)定方法，以阿魏酸、木犀草苷、藁本內(nèi)酯3種對(duì)照品進(jìn)行色譜峰指認(rèn)，確定特征色譜峰的藥材歸屬， 比較頭痛滴丸的水回流提取、 傳統(tǒng)水煎煮、 80%乙醇回流提取、 80%乙醇滲漉提取 4 種提取方法的特征色譜峰數(shù)目和相對(duì)峰面積大小， 優(yōu)選出最佳提取方法。 結(jié)果 醇滲漉提取工藝樣品中共標(biāo)記了45個(gè)色譜峰， 其中有21個(gè)藥材特征峰， 且醇滲漉提取工藝相比其他提取工藝， 特征色譜峰的數(shù)量和相對(duì)峰面積均具有明顯優(yōu)勢(shì)， 其中有19個(gè)藥材特征峰相對(duì)峰面積最大。 結(jié)論 通過(guò)頭痛滴丸4種不同的提取工藝的對(duì)比， 確定醇滲漉提取工藝優(yōu)于其他工藝。

頭痛滴丸；化學(xué)成分；指紋圖譜；提取工藝

頭痛滴丸方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，由川芎、藁本、菊花、白芷、鉤藤等8味藥組成，具有疏風(fēng)止痛、清熱平肝熄風(fēng)的功效，臨床常用來(lái)治療偏頭痛。川芎、藁本中的有機(jī)酸和揮發(fā)油類成分，菊花中黃酮及苷類成分，白芷中的揮發(fā)油和香豆素類成分以及鉤藤中的生物堿類成分均為治療頭痛的主要指標(biāo)成分［1-5］。 方中川芎、 藁本為君藥， 阿魏酸、 藁本內(nèi)酯是兩藥的共有成分，阿魏酸能夠抗凝血，具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用［6］。 藁本內(nèi)酯具有鎮(zhèn)靜、 鎮(zhèn)痛、 解痙、抗驚厥等作用，被認(rèn)為是治療偏頭痛的物質(zhì)基礎(chǔ)［7］。 菊花為臣藥， 疏散清熱，主要藥效成分為木犀草苷， 具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用［8］。 中藥藥效是多成分、多靶點(diǎn)整體作用的結(jié)果，在對(duì)中藥的提取工藝篩選過(guò)程中，若只采用某單一化學(xué)成含有量為指標(biāo)，不能較全面地表征出復(fù)方全貌的特點(diǎn)，具有一定的局限性。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜法建立了頭痛滴丸不同提取工藝的化學(xué)成分指紋圖譜，盡可能多的得到各成分的色譜峰，相對(duì)完整地反映出全方的化學(xué)成分，以不同提取工藝的特征峰面積的數(shù)量和相對(duì)峰面積 （以相應(yīng)對(duì)照藥材色譜圖為基準(zhǔn)計(jì)算）的大小為依據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)不同提取工藝的優(yōu)劣，并用各單一對(duì)照藥材對(duì)全方化學(xué)成分指紋圖譜峰進(jìn)行鏡像比對(duì)，以確定不同特征峰歸屬。

1 儀器與試藥

Dionex Summit高效液相色譜儀 （美國(guó)戴安公司）； Lab Alliance高效液相色譜儀 （ 美國(guó)蘭博公司）； 超聲波提取器 AS3120 （江蘇漢邦科技有限公司） ； AB204-N電 子 天 平 （ 萬(wàn) 分 之 一， Mettler-Toledo）； BP211D電子天平 （ 十萬(wàn)分之一，Sarlorius）；R501B星海旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （無(wú)錫市星海王生化設(shè)備有限公司）； 電加熱套 PTHW型 （河南豫華儀器有限公司）。

阿魏酸對(duì)照品 （批號(hào) 110773-200611， 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）、木犀草苷對(duì)照品 （批號(hào)11720-201106， 購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院）、藁本內(nèi)酯對(duì)照品 （自制， 批號(hào) 20130301）。 甲醇（天津市康科德科技有限公司） 為分析純和色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

方中各味藥材均購(gòu)自天津中藥飲片廠，經(jīng)天津藥物研究院張鐵軍研究員鑒定， 均符合 2010 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品的制備 精密稱取阿魏酸、 木犀草苷、藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量， 置于25 m L量瓶中， 加甲醇溶解，定容并稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照貯備液； 取其中1 mL貯備液置10 m L量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 得每 1 m L含阿魏酸20.56 μg、木犀草苷 26.80 μg、 藁本內(nèi)酯 34.10 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 工藝 1 樣品的制備 稱取 6 倍處方量的川芎、 藁本、 白芷、 菊花等藥材， 砸碎， 10 倍量水冷浸 60 min， 回流提取 3 次， 每次 1.5 h， 合并 3次提取液放冷，減壓濃縮得稠膏，作為樣品1 （每1 g稠膏約含2 g生藥）。

2.2.2 工藝 2 樣品的制備 稱取 6 倍處方量的川芎、藁本、白芷、菊花等藥材，砸碎，加水冷浸30 min， 加水量為沒(méi)過(guò)藥材 5 cm， 煎煮 2 次， 第 1煎 30 min， 加水量為 2 000 m L， 紗布過(guò)濾。 第 2 煎20 min， 加水量為 1 200 mL， 紗布過(guò)濾。 合并兩次濾液， 減壓濃縮至稠膏， 作為樣品2 （每1 g稠膏約含2 g生藥）。

2.2.3 工藝 3 樣品的制備 稱取 6 倍處方量的川芎、 藁本、 白芷、 菊花等藥材， 砸碎， 10 倍量80%乙醇冷浸 60 min， 回流提取 3 次， 每次 1.5 h，合并3次提取液放冷，減壓濃縮得稠膏，作為樣品3 （每1 g稠膏約含2 g生藥）。

2.2.4 工藝 4 樣品的制備 稱取 6 倍處方量的川芎、藁本、白芷、菊花等藥材，粉碎成粗粉，過(guò)10 目篩， 3 倍量 80%乙醇浸泡過(guò)夜后， 開(kāi)始滲漉，滲漉體積流量為 5 m L/（ min·kg）， 溶劑用量為 14倍量，收集滲漉液，混勻，減壓濃縮得稠膏，作為樣品4 （每1 g稠膏約含2 g生藥）。

2.2.5 對(duì)照藥材溶液制備 稱取川芎對(duì)照藥材，按照混合提取工藝中相應(yīng)工藝進(jìn)行提取，制得川芎對(duì)照藥材溶液；同法制得藁本、菊花、白芷、鉤藤、全蝎、郁金、細(xì)辛對(duì)照藥材溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Dikma Diamonsil-C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 流動(dòng)相為甲醇 （A）-0.05%磷酸溶液 （B） 梯度洗脫 （0 ～14 min， 35%→50%A； 14 ～16 min， 50% →75%A；16 ～35 min， 75% →77%A； 35 ～36 min， 77%→35%A； 36 ～40 min， 35%A）。 柱溫 30 ℃， 體積流量 1 mL/min， 波長(zhǎng) 282 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取工藝 4 樣品，連續(xù)進(jìn)樣 6次， 按 “2.3” 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定， 計(jì)算各特征色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD值，結(jié)果分別為 0.65% ～1.86%、1.23% ～2.34%，表明該儀器精密度良好 （相對(duì)峰面積以 39 號(hào)峰藁本內(nèi)酯為參比峰）。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取工藝 4 樣品， 室溫放置， 分別于 0、 2、4、 8、 16、 24 h 取樣， 按 “2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，每次進(jìn)樣量均為 10 μL， 計(jì)算各特征色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD值，結(jié)果分 別為 0.78% ～1.92%、 1.42% ～2.44%，表明供試品溶液室溫放置 24 h 內(nèi)穩(wěn)定 （相對(duì)峰面積以 39 號(hào)峰藁本內(nèi)酯為參比峰）。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取工藝 4 樣品， 按供試品溶液制備方法制備 6 份， 按 “2.3” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各特征色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積 的 RSD 值，結(jié) 果 分 別 為 0.87% ～1.76%、1.56% ～2.63%， 表明該方法的重復(fù)性良好 （相對(duì)峰面積以 39 號(hào)峰藁本內(nèi)酯為參比峰）。

2.5 樣品測(cè)定

2.5.1 不同提取工藝樣品指紋圖譜比較 取等生藥量樣品， 溶于 25 mL甲醇中， 超聲處理 30 min，過(guò) 0.45 μm微孔濾膜， 備用。 按 “2.3” 項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定， 并進(jìn)行主要色譜峰的指認(rèn)。 如圖1、2所示。

圖1 混合對(duì)照品色譜圖Fig.1 Chromatogram ofm ixed reference substances

圖2 頭痛滴丸不同提取方法的 HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerPrints of Toutong DroPPing Pills sam Ples w ith d ifferent extraction methods

2.5.2 特征峰的藥材歸屬 醇滲漉工藝共標(biāo)記了45個(gè)色譜峰， 以醇滲漉提取工藝為基準(zhǔn)， 分別對(duì)各藥材工藝樣品進(jìn)行鏡像比對(duì)，確定了21個(gè)色譜峰的藥材歸屬，如圖3～8所示。歸屬的特征峰如表1所示。

圖3 頭痛滴丸醇滲漉提取和川芎鏡像圖Fig.3 Ethanol Percolation extraction of Toutong DroPPing Pills and Chuanxiong Rhizoma comParison chart

圖4 頭痛滴丸醇滲漉提取和藁本鏡像圖Fig.4 Ethanol Percolation extraction of Toutong DroPPing Pills and Ligustici Rhizoma com Parison chart

圖5 頭痛滴丸醇滲漉提取和白芷鏡像圖Fig.5 Ethanol Percolation extraction of Toutong D roPPing Pills and Angelica dahurica Rhizoma com Parison char t

圖6 頭痛滴丸醇滲漉提取和菊花鏡像圖Fig.6 Ethanol Percolation extraction of Tou tong DroPPing Pills and Chrysanthem i Flos com-Parison chart

2.5.3 不同工藝樣品特征峰的相對(duì)峰面積比較以相應(yīng)的對(duì)照藥材色譜圖為基準(zhǔn)，計(jì)算4個(gè)不同工藝樣品相應(yīng)特征峰的相對(duì)峰面積，如表2所示。

圖7 頭痛滴丸醇滲漉提取和鉤藤鏡像圖Fig.7 Ethanol Percolation extraction of Toutong DroPPing Pills and Uncaria rhynchophylla com Parison char t

2.5.4 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)藥材歸屬和各工藝特征峰的相對(duì)峰面積的計(jì)算，得出工藝4樣品的特征色譜峰數(shù)目和相對(duì)峰面積均具有明顯優(yōu)勢(shì)。工藝3和工藝4的特征色譜峰為 16個(gè)。 疏風(fēng)止痛類藥材共歸屬了11個(gè)色譜峰， 其中工藝4樣品 9個(gè)峰的相對(duì)峰面積最大， 2個(gè)峰的相對(duì)峰面積略小于工藝3。清熱平肝熄風(fēng)類藥材共歸屬了 12個(gè)色譜峰， 其中工藝4樣品8個(gè)峰的相對(duì)峰面積最大，2個(gè)峰的相對(duì)峰面積略小于工藝3， 另2個(gè)峰的相對(duì)峰面積略小于工藝 1。溫經(jīng)散寒類藥材共歸屬了 4個(gè)色譜峰，其中工藝4樣品3個(gè)峰的相對(duì)峰面積最大，1個(gè)峰的相對(duì)峰面積略小于工藝一。

圖8 頭痛滴丸醇滲漉提取和細(xì)辛鏡像圖Fig.8 Ethanol Percolation extraction of Toutong DroPPing Pills and Asari Herba com Parison chart

表1 色譜峰的藥材歸屬Tab.1 ChromatograPhic Peaks belonging to herbs

表2 不同提取方法樣品色譜峰相對(duì)峰面積比較Tab.2 Relative Peak areas of different sam Ples

續(xù)表2

3 結(jié)論與討論

3.1 在中藥復(fù)方提取工藝的篩選過(guò)程中， 目前多以干浸膏得率、單體含有量和化學(xué)部位含有量為指標(biāo)評(píng)價(jià)不同工藝的優(yōu)劣，此種方法不能較全面地表征出中藥復(fù)方的全貌，具有一定局限性。指紋圖譜技術(shù)是目前公認(rèn)的能較全面反映中藥整體化學(xué)特征的手段［9］。 本實(shí)驗(yàn)建立了頭痛滴丸方不同提取工藝的指紋圖譜，測(cè)定了復(fù)方提取液的高效液相色譜（HPLC） 指紋圖譜數(shù)據(jù)， 并結(jié)合功效類別對(duì)其進(jìn)行信息提取和統(tǒng)計(jì)，較之于以往可以更全面地掌握復(fù)方多成分的信息。

3.2 本實(shí)驗(yàn)的復(fù)方化學(xué)成分較多，各特征峰吸收波長(zhǎng)不一致， 通過(guò)DAD檢測(cè)器， 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 282 nm下色譜峰信息較全面， 故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為 282 nm。

3.3 根據(jù)復(fù)方中各藥材的化學(xué)成分及其藥理作用，初步擬定了4種不同的提取工藝，建立了不同提取工藝的 HPLC圖譜， 之后進(jìn)行了藥材歸屬。 通過(guò)圖譜可知，醇滲漉提取和醇回流提取工藝的特征色譜峰多于傳統(tǒng)水煎和水回流提取工藝，醇滲漉提取工藝的特征色譜峰數(shù)目和相對(duì)峰面積明顯優(yōu)于其他工藝，故初步確定醇滲漉提取工藝為最佳提取工藝，為后期的制劑工藝和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

3.4 雖然此化學(xué)成分指紋圖譜可以提供較為豐富的中藥提取物信息，但本實(shí)驗(yàn)采用紫外檢測(cè)器，只能提供提取液中具有紫外吸收的成分的相對(duì)含量信息，且色譜峰所對(duì)應(yīng)成分的藥效作用尚不完全清楚，今后有待于建立藥液的液質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜，借助質(zhì)譜等更加靈敏、通用的檢測(cè)系統(tǒng)，進(jìn)行全成分的高效分析、檢測(cè)，提高中藥復(fù)方的提取效率，為制劑的前處理提供更多的理論依據(jù)。

［ 1 ］ 裴艷霞.川芎的藥理作用及臨床應(yīng)用 ［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2011， 9（34）： 197-198.

［ 2 ］ 唐 忠.藁本化學(xué)成分及藥理研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2011， 9（30）： 34-35.

［3］ 張曉媛，段立華，趙 丁.菊花化學(xué)成分及藥理作用的研究［ J］ .時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2008， 19（7） ： 1702-1704.

［4］ 崔秋兵， 張 藝， 蘭 莎.白芷鎮(zhèn)痛作用物質(zhì)基礎(chǔ)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2010， 16（12）： 102-104.

［5］ 葉 齊， 齊荔紅.鉤藤的主要成分及生物活性研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志， 2012， 27（5）： 508-510.

［ 6 ］ 曲培向.川芎藥理作用研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010， 3： 78-79.

［7］ 左愛(ài)華，王 莉，肖紅斌.藁本內(nèi)酯藥理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)研究 進(jìn) 展 ［ J］. 中 國(guó) 中 藥 雜 志， 2012， 37 （ 22 ）：3350-3353.

［8］ 劉 圓，李園園， 馮婷婷， 等.木犀草素鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí) 驗(yàn) 研 究 ［ J］. 齊 齊 哈 爾 醫(yī) 學(xué) 院 學(xué) 報(bào)， 2010， 31（15）： 2370.

［ 9 ］ Sun G X， Bi K S.Effect of fingerprintology of traditional Chinesemedicine（ TCM） in the innovative development of TCM［ J］ .Chin JChromatogr， 2008， 26（2） ： 172-179.

Com Parison of fingerPrints of different extraction Processes of Toutong DroPPing Pills

LIU Yue1，2，3， GONG Su-xiao2，3， ZHANG Tie-jun2，3， WANG Si-lu1，2，3， HU Qiao1，2，3
（1.Tianjin University of Traditional ChineseMedicine， Tianjin 300073， China； 2.Tianjin Instituteof Pharmaceutical Research， State Key Laboratory of Drug Delivery Technologies and Drug Metabolism， Tianjin 300193， China； 3.Tianjin Instituteof Pharmaceutical Research， The National and Local Engineering Laboratory of the Modernized Chinese Medicine and Chinese Medicine Quality Control Techniques， Tianjin 300193， China）

Toutong Dropping Pills； chemical constituent；chromatographic fingerprint； extraction process

R284.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0085-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.021

2013-03-14

劉 悅 （1987—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥制劑。 Tel： 15822365678， E-mail： ldkmeng@sina.com

*通信作者： 張鐵軍 Tel： （022） 23006848