呂曉萌 胡彤 俞婷 崔艷華

抗菌肽最早發(fā)現(xiàn)于惜古比天蠶蛹中，隨著研究的深入，人們?cè)趧?dòng)植物、微生物及人體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了抗菌肽的存在。目前為止已有上百種抗菌肽的結(jié)構(gòu)被測(cè)定。抗菌肽分子量一般較小，含有20-60個(gè)氨基酸殘基，呈現(xiàn)明顯的陽(yáng)離子特性，具有兩親性，在較高、較低的pH值條件下都有較強(qiáng)的活性，且較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性［1］。獲得抗菌肽一般通過(guò)3種途徑：分離純化天然抗菌肽、化學(xué)合成和基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽。天然存在的抗菌肽通常產(chǎn)量低，無(wú)法大量提??；化學(xué)合成費(fèi)用昂貴。因此基因工程技術(shù)是目前一種較有效獲得抗菌肽的方法［2］。目前多種抗菌肽已在細(xì)菌、酵母、植物等系統(tǒng)中成功重組表達(dá)。本文著重闡述抗菌肽在大腸桿菌、乳酸菌中重組表達(dá)的研究進(jìn)展。

1 抗菌肽在大腸桿菌中的表達(dá)

大腸桿菌由于其生長(zhǎng)速度快、遺傳背景清晰、有大量可利用的商業(yè)表達(dá)載體、易操作、費(fèi)用相對(duì)低，對(duì)蛋白質(zhì)的耐受力強(qiáng)等［2］優(yōu)點(diǎn)而備受研究者的青睞，尤其是其特有的多種質(zhì)粒、重組融合伴侶以及突變菌株更增強(qiáng)其成為宿主的可能性［3］。因此成為抗菌肽表達(dá)的首選宿主。

1.1 表達(dá)策略

1.1.1 密碼子偏愛(ài)性改造 由于大腸桿菌基因組缺乏識(shí)別某些密碼子的tRNA，導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)密碼子的使用有相當(dāng)程度的偏愛(ài)性，同一密碼子家族只有很少密碼子被反復(fù)使用。因此來(lái)自真核生物基因的表達(dá)會(huì)受到影響。通?？梢詫⒚艽a子設(shè)計(jì)成宿主偏愛(ài)的密碼子序列可以提高表達(dá)水平。Li等［4］將人β-防御素基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的密碼子改造為大腸桿菌偏愛(ài)的基因，從而獲得高效融合表達(dá)，融合蛋白占細(xì)菌總蛋白的50％以上，是野生型基因表達(dá)量的9倍。除改造外源基因外，也可以選擇合適的表達(dá)菌株。Rosetta系列宿主菌是BL21衍生菌，其可以補(bǔ)充密碼子CCC、AUA及GGA的tRNAs，從而克服了大腸桿菌的偏好性對(duì)外源基因表達(dá)的影響［5］。

研究者研究了人體防御素-5（HBD5）和防御素-6（HBD6）在大腸桿菌中的重組表達(dá)。防御素-5和防御素-6基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，每個(gè)基因分別與一個(gè)硫氧還蛋白A構(gòu)建成表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到Escherichia coli BL21（DE3）菌株并且在MBL培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果得到高體積產(chǎn)率的HBD5和HBD6融合蛋白，分別為1.49g/L和1.57g/L。純HBD5和HBD6的回收率分別為38％和35％。兩種表達(dá)蛋白對(duì)大腸桿菌均有抗菌活性［6］。

Wang等［7］首次提出通過(guò)基因工程的方法將人類(lèi)α-防御素 6（HD6）在大腸桿菌中高效生產(chǎn)。HD6主要在人體消化道內(nèi)的上皮細(xì)胞中表達(dá)，在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。編碼成熟HD6的mHD6序列根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行了優(yōu)化。將優(yōu)化后的序列omHD6克隆到表達(dá)載體pET32a（+）上，該表達(dá)載體含有硫氧還蛋白（TrxA）。在這種優(yōu)化表達(dá)的情況下，融合蛋白TrxA-omHD6可溶性較高（＞60％），產(chǎn)量大約為1.69g/L，重組mHD6（rmHD6）的理論產(chǎn)量大約為0.38g/L。經(jīng)過(guò)一系列分離純化rmHD6，體外試驗(yàn)表明，rmHD6對(duì)單純的皰疹病毒-2具有較強(qiáng)的抑菌作用。

Wang等［8］根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性合成了buforin II的模擬物buforin IIb，將其克隆到載體pET32a中，獲得了重組質(zhì)粒pET32a-buforinIIb。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得了重組buforin IIb。經(jīng)純化后得到純度＞99％的活力為3.1mg/L的重組buforin IIb，其活力與化學(xué)合成的buforin IIb相似。

1.1.2 串聯(lián)表達(dá) 由于抗菌肽的分子量較小，對(duì)其表達(dá)純化等都會(huì)造成一定的負(fù)面影響，因此為了解決這一問(wèn)題，從源頭上提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，人們采用了基因多拷貝同向串聯(lián)融合表達(dá)的策略。例如，成熟的人體內(nèi)的抗菌肽β-防御素-2在串聯(lián)表達(dá)的情況下，產(chǎn)量提高 6倍［9］。2007年，沈益等［10］將天然腫瘤壞死因子TNFa的3'端與抗菌肽cecropin-Xm基因串聯(lián)在一起，在菌株BL21中誘導(dǎo)融合表達(dá)，融合蛋白經(jīng)純化后用CNBr（Cianogen Bromide）切割，體外活性試驗(yàn)顯示其具有抗菌性及抗腫瘤活性。同時(shí)此策略也有效地避免抗菌肽對(duì)宿主菌的毒性。

預(yù)測(cè)水源地持續(xù)20年后水位下降值和5年、10年相近(圖3)，觀測(cè)井受水源地影響較小(下降值0.11～0.25 m)。預(yù)測(cè)地下水位在初期將可能伴隨急劇下降，經(jīng)過(guò)地下水的調(diào)蓄，在3～4年里，水源地運(yùn)行相對(duì)穩(wěn)定。

Rao等［11］設(shè)計(jì)了肽抗生素hPAB-beta的串聯(lián)重復(fù)多聚體，并且分別構(gòu)建了含有1-8個(gè)拷貝hPAB-beta基因的重組質(zhì)粒。含有重組pQE-hPAB-beta 1-8重組體的8個(gè)基因工程菌能夠分別以包涵體形式表達(dá)hPAB-beta多聚體，蛋白表達(dá)量達(dá)到總蛋白量的2.6％-28％。hPAB-beta 三聚體具有較高的表達(dá)水平（27.8％），細(xì)胞濕重產(chǎn)量達(dá)到3.15±0.45g/L。融合蛋白包涵體溶解于8mol/L的尿素中，經(jīng)過(guò)純化后，獲得重組hPAB-beta對(duì)微生物臨床菌株的最小抑菌濃度為31-250mg/mL，結(jié)果證明重組hPAB-beta保持了其生物活性。

1.1.3 融合表達(dá) 抗菌肽的表達(dá)會(huì)遇到兩個(gè)挑戰(zhàn)：一是由于其分子量小及高陽(yáng)離子特性，對(duì)蛋白酶敏感，易被宿主菌中的蛋白酶降解；二是抗菌肽的抗菌特性對(duì)宿主細(xì)胞具有潛在的殺傷力［12］。為了避免上述情況的發(fā)生，一般采用以融合蛋白的形式在大腸桿菌中表達(dá)抗菌肽基因，即在抗菌肽的N端連接一段蛋白質(zhì)序列，這樣表達(dá)出的融合蛋白對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)影響且提高了表達(dá)水平，最后目標(biāo)抗菌肽可以通過(guò)酶學(xué)或化學(xué)的裂解劑在融合位點(diǎn)釋放出來(lái)［13］。

載體蛋白通常分為兩類(lèi)：（1）一類(lèi)是提升溶解性的載體蛋白如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）、 硫 氧 還 蛋 白（Thioredoxin，Trx）、小泛素修飾物（Small ubiquitinlike modifier，SUMO）等。其中麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）和N-利用物A（NusA）也被用作載體，尤其是在易形成包涵體的蛋白質(zhì)中［2，3］。硫氧還蛋白是當(dāng)前抗菌肽表達(dá)中應(yīng)用最為廣泛的載體蛋白，占已報(bào)道融合表達(dá)的抗菌肽的20％以上，成功表達(dá)了Cecropin CM-4、β-防 御 素 3、Hinnavin II、Indolicidin、Lactoferricin和 Perinerin 等不同來(lái)源的抗菌肽［2，3，12］。硫氧還蛋白作為二硫鍵還原酶，可以有效地催化二硫鍵在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中形成，同時(shí)其也顯現(xiàn)出類(lèi)似分子伴侶的活性。以上特性利于二硫鍵的形成和抗菌肽的正確折疊。SUMO是一種與泛素結(jié)構(gòu)相關(guān)但功能不同的小蛋白，約由100個(gè)氨基酸組成。SUMO表面親水性，內(nèi)部呈現(xiàn)疏水性，因此其具有高度可溶性。作為融合蛋白伴侶，SUMO可以有效改善目標(biāo)蛋白的折疊、可溶性及表達(dá)量。在體外用SUMO蛋白酶合理的去除SUMO標(biāo)簽可以方便帶有N末端的目標(biāo)蛋白的產(chǎn)生。由于其在真核生物中的生理相關(guān)性，因此SUMO可以作為一種合適的在真核生物原核生物中提高蛋白表達(dá)的生物技術(shù)工具［14］。近年SUMO已經(jīng)成功用于 Brazzein、Exendin-4、hEGF、Urodilatin、Cecropin CM-4和β-防御素4等抗菌肽的表達(dá)［2，12］。（2）另一類(lèi)是促進(jìn)聚合的載體蛋白以加速融合蛋白包涵體的形成，如PurF片段、甾酮異構(gòu)酶（Ketosteroid isomerase）、TAF12組蛋白折疊域、類(lèi)固醇異構(gòu)酶及PAP3.30等［13］。此類(lèi)載體蛋白利用是基于不溶表達(dá)可有效的防護(hù)抗菌肽對(duì)宿主細(xì)胞的毒害，并且保護(hù)其免受宿主蛋白酶的降解的認(rèn)識(shí)。該類(lèi)融合表達(dá)蛋白利于快速純化，并且不含半胱氨酸的抗菌肽不需要復(fù)性。

1.1.4 雜合表達(dá) 將來(lái)源不同的抗菌肽進(jìn)行雜合表達(dá)是當(dāng)今抗菌肽表達(dá)研究的熱點(diǎn)之一。最初雜合抗菌肽由化學(xué)合成的方法獲得［15］。最早雜合抗菌肽的1-11氨基酸來(lái)自cecropin A，12-37氨基酸來(lái)自cecropin D，結(jié)果顯示其抗菌活性是cecropin D的5-55倍［15］。這一結(jié)果，給研究者很大的啟發(fā)。近年來(lái)研究者成功在大腸桿菌中表達(dá)了一系列不同來(lái)源的雜合抗菌肽，如 CA-MA、hin/MSH 和 LFT33等［16-18］。研究者將家蠅的泛素序列克隆到質(zhì)粒pQE30中，構(gòu)建載體pQEUBI。而后將大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子合成編 碼 CA-MA［cecropinA（1-8）-magainin2（1-12）］的cDNA片段，克隆到載體pQEUBI中，雜合抗菌肽CA-MA與泛素融合表達(dá)。融合蛋白以可溶性形式高效表達(dá)，占總蛋白的36％。融合蛋白切除泛素后，產(chǎn)生的 CA-MA具有較高抗菌活性［16］。

編碼hinnavin II/α-黑色素細(xì)胞刺激素雜合肽hin/MSH克隆到pET32a（+）。雜合肽在大腸桿菌BL21中以融合蛋白形式表達(dá)，50％的重組蛋白以可溶形式表達(dá)，切除Trx-hin/MSH后，具有廣譜的抗菌活性［17］。

與親本相比，現(xiàn)已表達(dá)的雜合抗菌肽均顯示了更為廣譜的抗菌能力和更強(qiáng)的抗菌活性。新型雜合抗菌肽LFT33 由源于牛乳鐵蛋白N端的LfcinB 和昆蟲(chóng)抗真菌肽thanatin衍生而來(lái)。LfcinB和thanatin均具有廣譜的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌及真菌具有抑制作用。LFT33整合了LfcinB的1-15氨基酸和thanatin的4-21氨基酸。其cDNA片段以大腸桿菌偏好性密碼子進(jìn)行化學(xué)合成，并構(gòu)建到pET32a（+）載體上，成功在大腸桿菌中融合表達(dá)［18］。

1.2 抗菌肽在大腸桿菌中的表達(dá)

目前，研究者已經(jīng)利用大腸桿菌為宿主，表達(dá)了大量不同來(lái)源的抗菌肽。謝芳等［19］利用pGEX-3X作為載體，將牛蛙皮膚抗菌肽ranalexin基因插入載體中，建立表達(dá)載體，將表達(dá)條件優(yōu)化至IPTG終濃度為1.0mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為5-6h，并確定其對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著的體外抑制作用。韓宗璽等［20］將雞舌組織中的Gal-9基因與大腸桿菌表達(dá)載體結(jié)合后再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，37℃培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)重組蛋白占菌體總蛋白的40％，且經(jīng)純化后的重組蛋白對(duì)生長(zhǎng)中期的大腸桿菌和致病性鏈球菌均有抑制作用。Tapia等［21］將雜合基因編碼為Ap-S后轉(zhuǎn)錄到大腸桿菌BL21中，純化后的重組Ap-S被用于抗真菌劑，在菌絲結(jié)構(gòu)中其具有很強(qiáng)的抑制活體營(yíng)養(yǎng)型和死體營(yíng)養(yǎng)型真菌的活性。這項(xiàng)技術(shù)可以用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。Wu等［22］將雜合肽MVF-EGFR237-267編碼序列分別克隆到pET-21b和pET-32a中，單獨(dú)表達(dá)或者與硫氧還蛋白、His6-tag形成融合蛋白的形式表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)形式無(wú)法表達(dá)，而融合形式可過(guò)量表達(dá)。這種重組的雜合肽產(chǎn)量較高，且可用于針對(duì)二聚表皮生長(zhǎng)因子受體的治療性抗菌肽疫苗。

2 抗菌肽在乳酸菌中的表達(dá)

乳酸菌是一類(lèi)可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的總稱(chēng)，廣泛應(yīng)用于酸奶、泡菜及其他發(fā)酵食品的生產(chǎn)。部分乳酸菌存在于人類(lèi)體內(nèi)具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，改善人胃腸道功能；抑制有害細(xì)菌的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等益生功效［23］。乳酸菌作為世界公認(rèn)安全（Generally recognized as safe，GRAS）的食品級(jí)微生物，與大腸桿菌相比，其更具直接應(yīng)用于食品及臨床領(lǐng)域的潛力［24］。除此以外，將乳酸菌替代大腸桿菌作為基因工程的宿主菌具有很多其他優(yōu)勢(shì)，如乳酸菌具有高度可調(diào)控的啟動(dòng)子系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)外均可表達(dá)外源基因并能將其分泌到胞外培養(yǎng)基中［25］。Christiaens等［26］證實(shí)了乳酸菌的染色體組經(jīng)改造后幾乎不分泌蛋白，適合外源基因的表達(dá)。

2.1 乳酸菌的表達(dá)系統(tǒng)

2.1.1 表達(dá)宿主 乳酸乳球菌是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的乳酸菌重組表達(dá)宿主。作為乳酸菌的模式菌，該菌是最早完成全基因組測(cè)序的乳酸菌［27］。當(dāng)前已經(jīng)完成多株乳酸乳球菌的全基因組測(cè)序，其中包括當(dāng)前常用的宿主菌株Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363和NZ9000。上述乳酸菌全基因組序列的解析，為在全基因組水平，獲得該菌基因轉(zhuǎn)錄、代謝調(diào)控信息；明確其遺傳背景；構(gòu)建適宜載體、提高外源基因表達(dá)效率，奠定了基礎(chǔ)。分子遺傳操作工具相對(duì)完善，使得乳酸乳球菌廣泛用于外源基因的表達(dá)。當(dāng)前已有大量外源基因，其中包括Acidocin A、Enterocin A、Lactacin F和Pediocin PA-1等多種抗菌肽基因在乳酸乳球菌中成功表達(dá)［24，28］。

植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）［29-33］、沙克乳桿菌（Lactobacillus sakei）［31-33］、冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）［33］、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）［32］和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）［32］等也被用作外源基因的表達(dá)載體。

2.1.2 表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)系統(tǒng)依據(jù)啟動(dòng)子的不同可分為組成型表達(dá)系統(tǒng)和誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)載體pMG36e是組成型表達(dá)的代表，其具有強(qiáng)啟動(dòng)子p32，以及來(lái)自廣宿主乳球菌質(zhì)粒pWV01的復(fù)制子［34］。該質(zhì)粒大小適中，為3.6 kb，便于遺傳操作；且具有紅霉素抗性，利于篩選?？咕膃nterocin P［35］、enterocin A［36］、Sakacin A［37］等由 pMG36e 的衍生質(zhì)粒pMG36c在乳酸乳球菌中均成功表達(dá)，可以有效抑制李斯特菌。

組成型表達(dá)系統(tǒng)中，連續(xù)的高產(chǎn)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累、聚集，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害。因此一般選擇誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。其中Nisin調(diào)控的表達(dá)系統(tǒng)（Nisin-controlled gene expression system，NICE）是最為常用的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)。NICE系統(tǒng)是基于抗菌肽nisin生物合成的自我調(diào)節(jié)機(jī)制而建立，該系統(tǒng)具有精細(xì)調(diào)控和高度誘導(dǎo)能力，是當(dāng)今最為成熟的乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)［38］。在NICE系統(tǒng)中，定位于細(xì)胞膜上組氨酸蛋白激酶NisK感知誘導(dǎo)信號(hào)nisin，并且發(fā)生自我磷酸化，接著將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白NisR，后者激活nisA啟動(dòng)子，進(jìn)而下游基因表達(dá)。NICE系統(tǒng)可以通過(guò)Lactobacillus、Streptococcus、Enterococcus、Bacillus、Leuconostoc lactis和Lactobacillus helveticus等革蘭氏陽(yáng)性菌過(guò)量表達(dá)蛋白，尤其是乳酸乳球菌L. lactis。

抗菌肽Apidaecin以與泛素融合的方式利用NICE系統(tǒng)成功表達(dá)，融合蛋白的產(chǎn)量高達(dá)宿主整個(gè)可溶性蛋白的7.2％；切除融合蛋白泛素后，表現(xiàn)出明顯抗菌活性［39］。分離自Pediococcus acidilactici的IIa型抗菌肽pediocin PA-1對(duì)李斯特菌具有很強(qiáng)的抑菌能力。研究者利用NICE系統(tǒng)成功表達(dá)了具有抗菌活性的 pediocin PA-1［40］。Renye 等［41］利用nisin誘導(dǎo)表達(dá)載體pMSP3535H3，在Streptococcus thermophilus，L. lactis ssp. lactis 和 L. casei等 多 個(gè)乳酸菌宿主中表達(dá)了抗菌肽pediocin，均對(duì)Listeria monocytogenes Scott A具有明顯抑菌活性。

雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（Two-component regulatory system，TCS）普遍存在于革蘭氏陽(yáng)菌的抗菌肽的合成調(diào)控中。因此相繼在沙克乳桿菌（L.sakei）［42］、 腸 球 菌（Enterococcus）［43］、 植 物 乳 酸菌（L. plantarum）［44］等乳酸菌中建立了類(lèi)似NICE的表達(dá)系統(tǒng)。同時(shí)基于IIa類(lèi)抗菌肽sakacin A或者sakacin P的啟動(dòng)子和調(diào)控基因建立了一系列表達(dá)載體pSIP［31，45］。除了NICE誘導(dǎo)型表達(dá)載體外，還有pH、乳糖、溫度敏感型誘導(dǎo)系統(tǒng)等誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。

2.1.3 信號(hào)肽 大多數(shù)由乳酸菌產(chǎn)生的抗菌肽，通過(guò)相應(yīng)的ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和其輔助蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外。而許多分泌型的原核蛋白和少數(shù)的抗菌肽（如enterocin P、hiracinJM79）在N端具有所謂的Sec型信號(hào)肽。此類(lèi)信號(hào)肽被信號(hào)肽酶所識(shí)別，并被切除。成熟蛋白或者肽通過(guò)一般分泌系統(tǒng)（General secretory pathway，GSP）或者 Sec-依賴(lài)型途徑被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，最終導(dǎo)致成熟蛋白或者肽釋放到細(xì)胞外。因此分泌蛋白N端的信號(hào)肽在外源表達(dá)中，可以引導(dǎo)融合的成熟蛋白或者肽進(jìn)行分泌表達(dá)［46，47］。

為提高外源蛋白的分泌表達(dá)，利于蛋白分泌的信號(hào)肽被應(yīng)用。當(dāng)前，來(lái)自乳酸乳球菌MG1363主要胞外蛋白Usp45的信號(hào)肽被廣泛應(yīng)用，并顯示較好的促進(jìn)分泌表達(dá)的效果［48-50］。Usp45的信號(hào)肽由27個(gè)氨基酸組成，這27個(gè)前導(dǎo)肽殘基序列揭示了信號(hào)肽的3重特征：擁有一個(gè)帶正電的N末端；一個(gè)中央疏水核心及一個(gè)C末端裂解區(qū)域［48］。

Sec-依賴(lài)型的抗菌肽enterocin P、hiracin JM79的信號(hào)肽也被用于外源基因的分泌表達(dá)中，尤其是抗菌肽的分泌表達(dá)中。Usp45、enterocin P、hiracin JM79的信號(hào)肽SPusp45、SPentP和SPhirJM79分別與成熟的enterocin A和免疫蛋白EntiA融合，被克隆在表達(dá)載體pNZ8048和 pMSP3545（誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PnisA）和pMG36c（組成型啟動(dòng)子P32）上，轉(zhuǎn) 化 到 Lactococcus lactis、Enterococcus faecium、E.faecalis、L. sakei和P. acidilactici等不同乳酸菌中。研究發(fā)現(xiàn)enterocinA的表達(dá)量、抗菌活性和特異抗菌活性依信號(hào)肽、表達(dá)載體、宿主不同而存在差異。其中重組L. lactis NZ9000（pNZUAI）和L. lactis NZ9000（pNZHAI）的上清中過(guò)量表達(dá)的enterocin A，對(duì)不同的李斯特菌的抗菌活性是enterocin A原始分泌菌株E. faecium T136的1.2-5.1倍［51］。可見(jiàn)，信號(hào)肽的添加促進(jìn)了外源抗菌肽的分泌表達(dá)。

2.2 抗菌肽在乳酸菌中的重組表達(dá)

周緒霞［52］通過(guò)對(duì)蜜蜂抗菌肽的結(jié)構(gòu)分析，以乳酸乳球菌為表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了蜜蜂抗菌肽在乳酸乳球菌中的分泌表達(dá)。李樸等［53］采用PCR方法合成bactenecin7基因及其相關(guān)調(diào)控基因，克隆到載體pMG36e中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到乳酸菌中后發(fā)現(xiàn)該乳酸菌能分泌表達(dá)bactenecin7，并具有抑菌作用。

O’Keeffe等［54］將一段 10.5kb 含有 enterocin A生物合成的所有基因和調(diào)控區(qū)域的片段，克隆到大腸桿菌-乳酸乳球菌穿梭性載體pCI372中。攜帶重組質(zhì)粒pENT03的E. faecalis OG1X轉(zhuǎn)化子，在固體培養(yǎng)基中產(chǎn)生了enterocin A和其誘導(dǎo)因子。在液體培養(yǎng)基中，僅在加入外源的誘導(dǎo)因子后才發(fā)現(xiàn)enterocin A的合成。研究者推測(cè)這個(gè)結(jié)果是由于缺乏調(diào)節(jié)enterocin A合成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)表達(dá)。

為了獲得更加廣譜的抗菌能力，研究者嘗試將多個(gè)不同抗菌肽在乳酸菌中共同表達(dá)，但是效果不盡理想。Martínez等［55］研究了在乳酸乳球菌IL1403中共同表達(dá)pediocin PA-1和enterocin A。攜帶有pediocin PA-1的結(jié)構(gòu)基因和免疫基因的pMG36c和攜帶有enterocin A的結(jié)構(gòu)基因和免疫基因的pHB04被共同轉(zhuǎn)化到L. lactis IL1403中。獲得轉(zhuǎn)化子上清中的pediocin PA-1和enterocin A濃度較低，僅為野生型的4％和5％。因此，并不適合共同表達(dá)。II型抗菌肽Acidocin A分離自嗜酸乳桿菌TK9201，該菌為生產(chǎn)發(fā)酵乳的發(fā)酵劑［56］。決定Acidocin A生物合成的基因位于一個(gè)45kb的質(zhì)粒pLA9201上。一段0.9kb包含Acidocin A結(jié)構(gòu)和免疫的基因片段被克隆到大腸桿菌-乳酸菌穿梭性載體pULA105E中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不產(chǎn)acidocin A的突變株TK9201-1中，未能產(chǎn)生Acidocin A。同樣的研究，克隆pLA9201限制片段側(cè)翼的acdA，表明結(jié)構(gòu)基因的上游區(qū)域?qū)cidocin A 合成是必要的［56］。

除了大腸桿菌和乳酸菌，其他細(xì)菌也被應(yīng)用于抗菌肽的外源表達(dá)。革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌作為宿主，成功表達(dá)了天蠶素A和D雜合肽［57］。李麗等［58］將蜜蜂抗菌肽Abaecin基因插入表達(dá)載體pGplat，而后轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中以表達(dá)重組蛋白，結(jié)果表明表達(dá)蛋白對(duì)大腸桿菌及沙門(mén)氏菌均有抑制作用。也有研究表明費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）同樣可以作為抗菌肽的表達(dá)宿主［58］。Brede 等［59］基于 P. freudenreichii中滾環(huán)復(fù)制且攜帶氯霉素抗性的pLME108質(zhì)粒，構(gòu)建了大腸桿菌和P. freudenreichii間的穿梭性載體；并利用此系統(tǒng)成功表達(dá)了來(lái)自Propionibacterium thoenii的抗菌肽基因。

3 小結(jié)

抗菌肽的重組表達(dá)涉及多種表達(dá)宿主，其中大腸桿菌因其易培養(yǎng)、費(fèi)用低、操作方便等特點(diǎn)而成為抗菌肽在原核生物中表達(dá)的主要表達(dá)宿主。大腸桿菌表達(dá)中主要存在抗菌肽分子量小不利于純化，且表達(dá)蛋白對(duì)宿主產(chǎn)生毒害等問(wèn)題。在乳酸菌中的重組表達(dá)也較為廣泛，且與大腸桿菌相比，更適合應(yīng)用于食品領(lǐng)域，因此具有較大的研究與應(yīng)用潛力。但目前對(duì)乳酸菌的遺傳背景了解相對(duì)較少，表達(dá)系統(tǒng)并不十分完善，存在表達(dá)效率低和不穩(wěn)定等問(wèn)題。因此，建立高效表達(dá)、便于后期純化的表達(dá)系統(tǒng)，仍是抗菌肽異源表達(dá)研究的重點(diǎn)。

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