李明+譚詩云

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430060

[摘要] 目的 觀察丹皮酚對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞增殖、凋亡的影響及探討可能的作用機(jī)制。 方法 用不同濃度丹皮酚處理體外培養(yǎng)的LoVo細(xì)胞24、48、72、96 h，CCK-8比色法測定其對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的活力的影響；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；根據(jù)CCK-8結(jié)果分為丹皮酚組（濃度31.25、62.50、125 mg/L）和對(duì)照組，處理48 h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化；RT-PCR和Western blot法檢測RUNX3基因表達(dá)情況。 結(jié)果 丹皮酚能顯著降低LoVo細(xì)胞存活率，呈劑量、時(shí)間依賴性；倒置顯微鏡下可觀察到典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)；丹皮酚組（濃度31.25、62.50、125 mg/L）處理細(xì)胞48 h后，凋亡率分別為（12.3±1.3）%、（22.4±1.5）%、（36.2±2.1）%，與對(duì)照組[凋亡率（2.3±0.9）%]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；丹皮酚組處理48 h后，細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度分別為（41.36±4.62），（57.51±3.83）和（69.43±3.76），與對(duì)照組[熒光強(qiáng)度（24.45±3.74）]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；丹皮酚能上調(diào)RUNX3基因的表達(dá)，呈劑量依賴性。 結(jié)論 丹皮酚能抑制LoVo細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制可能與增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量和上調(diào)RUNX3基因的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 丹皮酚；LoVo細(xì)胞；Ca2+；RUNX-3

[中圖分類號(hào)] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）03（a）-0023-05

Effects of Paeonol on cell proliferation and apoptosis in human colorectal cancer LoVo cells and its mechanisms

LI Ming TAN Shiyun

Department of Gastroenterology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Paeonol on the proliferation of colorectal cancer line LoVo and discuss its possible mechanisms. Methods LoVo cells were cultured in vitro. After treatment by Paeonol at different concentrations respectively at different time， the cell survival was determined by the CKK-8 method. The changes of cell morphology were observed by inverted microscope. Apoptosis was detected by flow cytometry. The concentration of intracellular calcium was investigated by laser confocal sanning microscope with calcium-flourecent probes-Fluo-3/AM. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used for mRNA analysis. The change of protein expression of RUNX-3 was detected by western blot. Results From the data of CCK-8， the cell proliferation of human colorectal cancer LoVo cells was inhibited by Paeonol in a dose-dependent and time-dependent manner. Typical apoptosis morphology of LoVo cells was observed by inverted microscope. Flow cytometry assays showed that Paeonol significantly induced apoptosis in LoVo cells. After treated with Paeonol for 48 h， the apoptosis rate of Lovo cells was （12.3±1.3） %， （22.4±1.5） %， and （36.2±2.1） % respectively， which showed an obvious concentration-effect relationship. The Ca2+ relative fluorescence intensity of Paeonol group was （41.36±4.62）， （57.51±3.83） and （69.43±3.76） respectively， which indicated that the concentration of intracellular calcium was significantly elevated by Paeonol. The data of RT-PCR and western blot showed that Paeonol up-regulated RUNX3 in a dose-dependent manner in LoVo cells. Conclusion Paeonol can inhibit the proliferation of LoVo cells and induce apoptosis， and the mechanism of Paeonol on apoptosis may be related to the up regulation of RUNX3 expression and the increase of concentration of intracellular calcium.

[Key words] Paeonol； LoVo cell； Ca2+； RUNX-3

研究表明，非甾體類消炎藥（non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs）能降低結(jié)腸癌的發(fā)生，減少家族性結(jié)腸息肉患者息肉數(shù)量和大小，并能預(yù)防結(jié)腸腺瘤的復(fù)發(fā)[1]。本室前期研究顯示[2]乙酰水楊酸能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系環(huán)氧合酶-2（COX-2）表達(dá)而抑制生長，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但臨床研究表明長期應(yīng)用NSAIDs可引起胃潰瘍甚至胃出血及一系列心血管不良反應(yīng)，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此尋找毒性小，而又能有效的抑制COX-2的抑制劑，是大腸癌化學(xué)預(yù)防的重要課題。

丹皮酚具有與非甾體類抗炎藥相似的藥理作用，包括解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中樞抑制作用等，且其副作用小。課題組前期[3-5]觀察了丹皮酚對(duì)大腸癌HT-29細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因的影響，發(fā)現(xiàn)丹皮酚可抑制大腸癌細(xì)胞的增殖生長，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因如Bcl-2、Bax、Fas及p53等的表達(dá)，且丹皮酚能夠影響腫瘤細(xì)胞的生長周期，并與5-Fu具有協(xié)同作用。丹皮酚與非甾體類抗炎藥均能有效下調(diào)COX-2的表達(dá)量，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討了丹皮酚對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量及RUNX-3基因的影響。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞及試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；丹皮酚注射液購于寧波天真制藥有限公司，純度≥99.9%；AnnexinV/PI試劑盒購于BENDER公司；CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、DEPC購于杭州四季青生物材料研究所；Fluo-3/AM購于日本同仁化學(xué)研究所；Trizol試劑、DEPC、異丙醇、氯仿、RT-PCR試劑盒等購于武漢谷歌生物技術(shù)有限公司；RUNX-3單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

LoVo細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8比色法檢測丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞活力的影響

取對(duì)數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞，以5×104/mL的濃度接種于96孔板，每孔200 μL，待細(xì)胞貼壁后分組，丹皮酚組加入丹皮酚終濃度分別為15.63、31.25、 62.50、125、250 mg/L的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，實(shí)驗(yàn)終止前2 h每孔加入CKK-8試劑20 μL，孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值，即A值，細(xì)胞存活率=處理組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察

取對(duì)數(shù)生長期LoVo細(xì)胞消化傳代并培養(yǎng)24 h后，換丹皮酚終濃度為15.63～250 mg/L的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡率的影響

取對(duì)數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞，以1×106/mL濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，貼壁后分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入含丹皮酚（終濃度為31.25、62.50、125 mg/L）的培養(yǎng)液，對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，離心、洗滌、固定后加入AnnexinV-FITC和PI染色。篩網(wǎng)過濾送流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

取對(duì)數(shù)生長期的LoVo細(xì)胞，以1×106/mL接種于特制培養(yǎng)皿中，分組及處理同上，培養(yǎng)48 h后，HBSS液洗滌3次，加入濃度為5 μmol/L的Fluo-3/AM工作液300 μL，孵育60 min，用HBSS液洗滌3次，加入HBSS液覆蓋細(xì)胞，孵育30 min。置于激光掃描共聚焦顯微鏡上檢測，隨機(jī)選取5個(gè)視野（放大100倍），每個(gè)視野隨機(jī)選取7個(gè)細(xì)胞，利用隨機(jī)軟件測定其熒光強(qiáng)度。其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度成正相關(guān)，可準(zhǔn)確反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。

1.7 RT-PCR法檢測丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞RUNX-3 mRNA的影響

細(xì)胞接種及分組同上，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，按Trizol試劑說明書一步法提取總RNA，計(jì)算出RNA濃度，按RT試劑盒操作說明合成cDNA，并進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。PCR反應(yīng)條件：94℃ 4min；94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 25 s；30 cycles，72℃ 4 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察并拍照。RT-PCR采用的β-actin 及RUNX3引物由南京金瑞斯合成，RUNX3上游引物為5'-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3'，下游引物為5'-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3'，β-actin上游引物為5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'，下游引物為5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'，擴(kuò)增片段長度分別為179 bp和240 bp，β-actin為內(nèi)參。

1.8 Western blot檢測丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞RUNX-3蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞接種及分組同上，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，參照細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度，蛋白樣品加入1/5體積的5×上樣緩沖液，沸水煮沸5 min后離心，以每孔20 μg/孔上樣，行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1000稀釋的兔抗人RUNX-3蛋白，4℃過夜，β-actin作為內(nèi)參，TBST洗膜3次，加入1∶1000稀釋的辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG，室溫孵育2 h，同樣洗膜3次，ECL顯色，觀察各條帶深淺變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞活力的影響

丹皮酚在15.63～250 mg/L濃度范圍內(nèi)均能有效降低結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的生存率，在相同處理時(shí)間，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生存率逐漸降低；同一藥物濃度，隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞生存率也逐漸降低，即呈顯著的劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0. 05）。見圖1。

與對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01

圖1 丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響（n = 5）

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下可見對(duì)照組細(xì)胞生長旺盛，折光率較高，胞體大，形態(tài)成梭形或多邊形，胞質(zhì)均勻透明，隨培養(yǎng)時(shí)間延長變化不大。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖減慢，且隨著丹皮酚濃度的增大和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸變小、變圓，折光率減弱，核濃縮等，部分脫落漂浮于培養(yǎng)瓶中，但細(xì)胞膜完整，最后裂解。丹皮酚濃度越高，作用時(shí)間越長，上述表現(xiàn)越明顯，漂浮細(xì)胞越多。250 mg/L丹皮酚組可見大量懸浮的細(xì)胞碎片。

2.3丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，丹皮酚濃度為0 mg/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率為（2.3±0.9）%；丹皮酚濃度分別為31.25、62.50、125 mg/L作用細(xì)胞48 h后，凋亡率分別為（12.3±1.3）%、（22.4±1.5）%、（36.2±2.1）%，與對(duì)照組[（2.3±0.9）%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），表明丹皮酚能誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。見圖2。

2.4 丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的影響

鈣離子熒光劑Fluo-3/AM能特異性與Ca2+結(jié)合，本研究所測的熒光強(qiáng)度反映的是細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的相對(duì)水平，并不代表實(shí)際細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。如圖3所示，丹皮酚作用后人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且隨著濃度的升高而增強(qiáng)。圖像分析結(jié)果顯示，對(duì)照組（丹皮酚濃度為0 mg/L）細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強(qiáng)度為（24.45±3.74），丹皮酚濃度分別為31.25、62.50、125 mg/L時(shí)作用LoVo細(xì)胞48 h后，熒光強(qiáng)度分別為（41.36±4.62），（57.51±3.83）和（69.43±3.76）；丹皮酚組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.5 丹皮酚對(duì)LoVo細(xì)胞RUNX-3 mRNA表達(dá)的影響

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RUNX-3基因的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶為179 bp，內(nèi)參β-actin條帶為240 bp，與所設(shè)計(jì)的片段大小一致，丹皮酚處理人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h后，RUNX-3基因的表達(dá)均上調(diào)，且隨藥物濃度的升高，LoVo細(xì)胞RUNX-3基因的表達(dá)量亦升高，呈明顯劑量依賴效應(yīng)。見圖4。

2.6 丹皮酚對(duì)RUNX-3蛋白表達(dá)的影響

丹皮酚處理LoVo細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示隨著丹皮酚濃度的升高，RUNX-3蛋白表達(dá)量也逐漸升高。見圖5。

3 討論

細(xì)胞凋亡是維持多細(xì)胞機(jī)體平衡的一個(gè)重要生理機(jī)制，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖之間的平衡在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]，細(xì)胞凋亡是程序化、多基因調(diào)控的細(xì)胞死亡過程，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。有研究證實(shí)，丹皮酚在體內(nèi)外均能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在15.63～250 mg/L濃度范圍，對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖均有抑制作用，隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長，抑制細(xì)胞增殖的作用亦逐步增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度效應(yīng)及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。丹皮酚處理人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞后，在倒置顯微鏡下均可見到凋亡細(xì)胞的形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而升高，呈明顯的劑量依賴效應(yīng)，表明丹皮酚可抑制結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)及凋亡等病理生理過程[9]，鈣離子在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的重要作用已經(jīng)有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)[10]，研究顯示，在細(xì)胞凋亡早期和晚期階段細(xì)胞內(nèi)Ca2+均增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚處理后，LoVo細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)，且隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組比較，有顯著差異性（P < 0.05）。LoVo細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的增加與細(xì)胞凋亡率呈平行關(guān)系，且這種效應(yīng)隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。提示LoVo細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增多與藥物作用有關(guān)，表明Ca2+升高在丹皮酚抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制中可能起重要作用，提示調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡可能是其作用機(jī)制之一。因此，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量可能成為結(jié)腸癌治療的一個(gè)作用靶點(diǎn)。丹皮酚具體參與Ca2+通道運(yùn)輸系統(tǒng)的調(diào)控及丹皮酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路還需進(jìn)一步研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能上調(diào)LoVo細(xì)胞中人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（human runt-related transcription factor 3，RUNX3）基因表達(dá)，且表達(dá)量隨著藥物濃度的升高而增加，呈明顯濃度效應(yīng)。大量研究證明，轉(zhuǎn)錄生長因子-β（transforming growth factor，TGF-β）和Wnt信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[12-13]。RUNX3參與TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)生長抑制的過程[14]。研究證實(shí)，RUNX3基因在多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌及肺癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15-16]。有證據(jù)表明，恢復(fù)RUNX3基因的表達(dá)能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及下調(diào)cyclin D1的表達(dá)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能抑制腫瘤細(xì)胞向G1期行進(jìn)和G1/S轉(zhuǎn)換（結(jié)果待發(fā)）。并且RUNX3基因表達(dá)上調(diào)趨勢與流式細(xì)胞儀檢測的凋亡率增升高趨勢是一致的。因此，推測丹皮酚能通過上調(diào)RUNX3基因表達(dá)影響細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)丹皮酚處理后，LoVo細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量與RUNX3基因表達(dá)均升高，即丹皮酚一方面能增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，另一方面又能促進(jìn)RUNX3基因表達(dá)，表明兩者可能處于同一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上。研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加參與包括基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞凋亡在內(nèi)的多種生物反應(yīng)過程[19-20]，提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量與RUNX3基因相互協(xié)調(diào)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。丹皮酚能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量及上調(diào)RUNX3基因的表達(dá)。由此推測，丹皮酚和阿司匹林可能通過增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，上調(diào)LoVo細(xì)胞RUNX3基因的表達(dá)，恢復(fù)了TGF-β信號(hào)通路生理功能，并抑制了Wnt信號(hào)通路，抑制LoVo細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

腫瘤的凋亡是一個(gè)復(fù)雜而又精確調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，Ca2+含量與RUNX3基因之間相關(guān)信號(hào)通道，是下一步要進(jìn)行的工作。

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（收稿日期：2013-11-02 本文編輯：李繼翔）

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（收稿日期：2013-11-02 本文編輯：李繼翔）