羅衛(wèi)民+劉越峰+羅湘玉+等

羅衛(wèi)民1 劉越峰2 羅湘玉1 張 軍1

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院心胸外科，湖北十堰 442000；

2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院眼科，湖北十堰 442000

[摘要] 目的 觀察金櫻子（Rosa Laevigata Michx，RLM）對(duì)阿霉素（Doxorubicin，DOX）誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)作用。 方法 Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（8只）、DOX模型組（15只）、RLM和DOX聯(lián)合用藥組（每個(gè)劑量組30只）。空白對(duì)照組僅給予等體積生理鹽水，DOX模型組大鼠用DOX腹腔注射，使其累計(jì)劑量達(dá)15 mg/kg。聯(lián)合用藥組在DOX組基礎(chǔ)上每千克體重分別用1，2和5 g RLM灌胃。處理結(jié)束后，測(cè)量血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、肌酸激酶（creatine kinase，CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、總膽固醇（total cholesterol，TC）的含量，同時(shí)采用比色法測(cè)量還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（myocardial lipid peroxide，MDA）、腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）及caspase-3的含量。 結(jié)果 DOX能顯著增高大鼠血清中AST，LDH，CK-MB和TC水平，5 g/L RLM處理能將血清中AST降至（6.73±0.18）U/L，LDH降至（251.34±33.08）U/L，CK-MB降至（53.62±4.45）U/L，TC降至（67.82±9.47）mg/dL，與DOX模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。DOX也降低還原型GSH水平，能增加MDA，TNF-α及caspase-3的含量。而給予RLM處理后，每毫克組織中GSH水平增加至（1.06±0.11）mg/g，MDA降至（0.82±0.14）nmol/mg，TNF-α降至（3.49±0.05）pg/mg，caspase-3 OD值降至（0.83±0.02），與DOX模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 RLM通過(guò)其抗氧化、抗炎癥及抗凋亡機(jī)制發(fā)揮對(duì)DOX誘導(dǎo)的心肌毒性的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 金櫻子；阿霉素；氧化應(yīng)激

[中圖分類(lèi)號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）03（a）-0015-04

Antioxidant and antiapoptosis effect of Rosa Laevigata Michx. on Doxorubicin-induced cardiac injury rats

LUO Weimin1 LIU Yuefeng2 LUO Xiangyu1 ZHANG Jun1

1.Department of Cardiothoracic Surgery， the Taihe Hospital of Shiyan Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 2.Department of Ophthalmology， the People's Hospital of Shiyan Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China

[Abstract] Objective To evaluate the cardioprotective effects of Rosa Laevigata Michx. （RLM） on DOX-induced heart injury in rats. Methods Wistar rats were randomized divided into control group， Doxorubicin model group and RLM groups. Rats in control group （n=8） were injected by normal saline injection， while the Doxorubicin model group were administrated by intraperitoneal injection （n=15） in a cumulative dose of 15 mg/kg for two weeks. For the RLM groups， 1， 2， 5 g/kg of ALM were given after DOX injection （n=30 in each dose group）. Activities and levels of aspartate transaminase （AST）， creatine phosphokinase isoenzyme （CK-MB）， lactate dehydrogenase （LDH）， total cholesterol （TC） and triglyceride （TG） in serum were detected. The level of reduced glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA）， tumour necrosis factor-alpha （TNF-α） and caspase-3 levels in cardiac tissue were detected by a colorimetric method. Results DOX significant increased the AST， CK-MB， LDH， and TC level in serum. 5 g/L RLM treatment could decrease AST to （6.73±0.18） U/L， LDH to （251.34±33.08） U/L， CK-MB to （53.62±4.45） U/L， TC to （67.82±9.47） mg/dL， there were statistical significances as compared with those in DOX modec group （P < 0.05）. DOX could also decrease the reduced GSH， and accumulation of MDA， TNF-α and caspase-3. After treatment with RLM， the content of GSH in each milligram of protein increased to （1.06±0.11） mg/g， MDA decreased to （0.82±0.14） nmol/mg， TNF-α decreased to （3.49±0.05） pg/mg， and decreased the OD value of caspase-3 OD to （0.83±0.02）. There were statistical significances as compared with those in DOX group （P < 0.05）. Conclusion RLM mediates their protective effect against DOX-induced cardiac injury through antioxidant， anti-inflammatory and antiapoptotic mechanisms.

[Key words] Rosa Laevigata Michx.； Doxorubicin； Oxidative stress

[基金項(xiàng)目] 湖北省十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃（指導(dǎo)）項(xiàng)目（Ⅱ）（編號(hào)2009S48）。

[作者簡(jiǎn)介] 羅衛(wèi)民（1978.3-），男，湖北十堰人，碩士；研究方向：心肌保護(hù)。

通訊作者

阿霉素（Doxorubicin，DOX） 是一種廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的蒽環(huán)類(lèi)抗生素。盡管其對(duì)包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有抑制作用，但其蓄積性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。DOX導(dǎo)致的毒性心肌病原因很多，其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制之一[2]。因此，在DOX治療的同時(shí)預(yù)防性使用抗氧化藥物干預(yù)，有望降低其副作用[3]。近年來(lái)，某些藥用植物在心血管疾病的預(yù)防過(guò)程中具有一定的預(yù)防作用[4]，金櫻子為薔薇科金櫻子（Rosa Laevigata Michx.，RLM）的果實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)它具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基能力[5-6]。本研究旨在觀察RLM對(duì)DOX誘發(fā)的心臟毒性的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DOX購(gòu)自意大利Pharmacia公司（批號(hào)：8NB002-A），血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Quimica Clinica Aplicada。血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和肌酸激酶（creatine kinase，CK-MB）試劑盒為Stanbio產(chǎn)品。還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）及丙二醛（myocardial lipid peroxide，MDA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所。心肌腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）ELISA試劑盒和caspase-3的比色測(cè)定試劑盒購(gòu)自Quantikine。分析純?cè)噭┲饕?gòu)自Sigma-Aldrich公司。

金櫻子購(gòu)于十堰市中草藥材公司，經(jīng)去籽后用煎藥機(jī)進(jìn)行熬煎。金櫻子的鑒定由湖北醫(yī)藥學(xué)院肖勝全教授完成，其提取液濃度為2.0 g/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

成年雄性Wistar大鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，體重（250±5）g，在SPF環(huán)境下給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的水和食物飼養(yǎng)2周。大鼠隨機(jī)分成5組：空白對(duì)照組（8只），大鼠接受等體積的生理鹽水作為陰性對(duì)照；DOX模型組（15只），大鼠連續(xù)兩周每間隔48 h注射DOX（2.5 mg/kg，ip）共6次，使其累積劑量達(dá)15 mg/kg。RLM高、中、低劑量組（每組各30只）：在DOX模型組的基礎(chǔ)上，大鼠每日給予RLM（1、2、5 g/kg）灌胃，DOX停止后，持續(xù)RLM灌胃4周。

1.3 血清及心肌組織的獲取

大鼠處理結(jié)束后，獲取血液標(biāo)本，8000×g離心10 min獲取血清用于測(cè)定TC、AST、LDH和CK-MB。隨后解剖大鼠，分離心臟，生理鹽水漂洗2次。將心臟組織剪切，制備成20%的勻漿后，二喹啉甲酸法測(cè)定其總蛋白濃度及AST、LDH、CK-MB活性、TC水平（mg/dL）。

1.4 心肌MDA測(cè)定

心臟勻漿與等體積2.3%的KCl混合，600×g，4℃離心15 min，獲取上清用于測(cè)定MDA。其原理基于脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物與硫代巴比妥酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，生成粉紅色的有色絡(luò)合物，從而用分光光度計(jì)以四甲氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品，532 nm和520 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其OD值。結(jié)果用nmol/mg表示。

1.5 心肌GSH測(cè)定

將等體積的心臟勻漿和預(yù)冷7.5%5-磺酸基水楊酸緩沖液以沉淀蛋白。隨后4℃，600×g離心10 min，獲取上清用于測(cè)量還原型GSH。其原理基于還原型GSH能與5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）反應(yīng)，產(chǎn)物在421 nm波長(zhǎng)處能形成最大吸收峰。含量用mg/g組織表示。

1.6 TNF-α和caspase-3測(cè)定

50 mg心肌組織加入0.8 mL pH 7.4的裂解緩沖液中制成勻漿，10 000×g，4℃離心15 min。獲取上清用于TNF-α和caspase-3測(cè)定。其中TNF-α根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行，采用固相夾心ELISA法，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）法顯色并于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度，用pg/mg蛋白表示。采用間接法測(cè)定caspase-3活性，基于caspase-3切除底物分子DEVD-pNA中的發(fā)光基團(tuán)pNA，隨后在405 nm處用測(cè)量其吸光度，用OD值表示，從而間接反應(yīng)其活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并采用單因素方差分析數(shù)據(jù)，行t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血生化指標(biāo)情況

心臟功能和血脂參數(shù)顯示，DOX注射后，血清AST、LDH、CK-MB、TC水平顯著增高。而同時(shí)給予RLM干預(yù)后，這些參數(shù)隨著RLM濃度的增高而不斷改善，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度金櫻子處理對(duì)阿霉素心肌損傷大鼠

血生化指標(biāo)的影響（x±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與DOX模型組比較，#P < 0.05；AST：血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；LDH：乳酸脫氫酶；TC：血清總膽固醇；CK-MB：肌酸激酶；RLM：金櫻子；DOX：阿霉素

2.2 不同濃度RLM對(duì)心肌DOX處理后MDA含量的影響

與空白對(duì)照組相比，DOX處理組能誘導(dǎo)心肌MDA明顯增加（P < 0.01），給予不同濃度RLM處理后，心肌MDA含量隨之降低，其中DOX+5 g/kg RLM處理后，MDA含量降低最多[（0.82±0.14） nmol/mg]。見(jiàn)圖1。

1.空白對(duì)照組；2.DOX模型組；3.DOX+1 g/kg RLM；4.DOX+3 g/kg RLM；5.DOX+5 g/kg RLM；與空白對(duì)照組比較，#P < 0.01；與DOX模型組比較，*P < 0.05；RLM：金櫻子；DOX：阿霉素

圖1 RLM對(duì)血清丙二醛含量的影響

2.3 不同濃度RLM對(duì)DOX心肌毒性大鼠GSH含量的影響

與空白對(duì)照組相比，DOX組大鼠血清總GSH含量顯著降低（P < 0.01）。而同時(shí)給予不同濃度RLM處理后，GSH含量隨之升高。5 g/kg RLM處理大鼠后，GSH含量[（1.06±0.11） pg/g]接近對(duì)照組水平（圖2）。

1.空白對(duì)照組；2.DOX模型組；3.DOX+1 g/kg RLM；4.DOX+3 g/kg RLM；5.DOX+5 g/kg RLM；與空白對(duì)照組比較，#P < 0.01；與DOX模型組比較，*P < 0.05；RLM：金櫻子；DOX：阿霉素

圖2 RLM對(duì)血清還原型谷胱甘肽含量的影響

2.4 RLM干預(yù)對(duì)大鼠血清TNF-α含量的影響

空白對(duì)照組大鼠血清中TNF-α含量較低，DOX處理后TNF-α顯著增高（P < 0.01）。RLM干預(yù)能以劑量依賴(lài)性方式降低血清中TNF-α的含量，其中DOX+5 g/kg RLM處理后，TNF-α含量降低最多[（3.49±0.05） pg/mg]，見(jiàn)圖3。

2.5 RLM抑制caspase-3活性

DOX處理后，caspase-3活性增加了近50%。同時(shí)經(jīng)1～5 g/kg RLM處理后，caspase-3活性逐漸降至正常水平，其中DOX+5 g/kg RLM處理后，caspase-3活性降低最多（0.83±0.02）。見(jiàn)圖4。

1. 空白對(duì)照組；2.DOX模型組；3.DOX+1 g/kg RLM；4.DOX+3 g/kg RLM；5.DOX+5 g/kg RLM；與空白對(duì)照組比較，#P < 0.01；與DOX模型組比較，*P < 0.05；RLM：金櫻子；DOX：阿霉素

圖4 RLM對(duì)caspase-3活性的影響

3 討論

DOX是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病均有效，一般作為第二線藥物，即在首選藥物耐藥時(shí)可考慮應(yīng)用此藥。惡性淋巴瘤，可作為交替使用的首選藥物。DOX和其他奎寧蒽環(huán)類(lèi)藥物一樣，主要的毒性反應(yīng)有：白細(xì)胞和血小板減少，60%～80%的患者可發(fā)生；100%的患者有不同程度的毛發(fā)脫落，停藥后可以恢復(fù)生長(zhǎng)；心臟毒性，表現(xiàn)為心律失常，ST-T改變，多出現(xiàn)在停藥后的1～6個(gè)月[7]。本研究通過(guò)DOX建立心肌毒性模型發(fā)現(xiàn)，血清AST、LDH和CK-MB顯著增加，這可能是由于DOX損傷心肌細(xì)胞膜后，AST、LDH和CK-MB漏出所致。本研究還發(fā)現(xiàn)，DOX還可以導(dǎo)致TC含量增高，這可能是由于DOX導(dǎo)致腎病綜合征所致[8]。RLM屬薔薇科薔薇屬常綠蔓性灌木野生果樹(shù)，其果實(shí)中總糖含量達(dá)24%，其中多糖含量約為金櫻子果實(shí)的8.73%。研究顯示，RLM的抗氧化能力與丁基羥基甲苯相當(dāng)，并能顯著清除超氧陰離子自由基、抑制羥自由基對(duì)細(xì)胞膜的破壞而引起的溶血和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的形成，從而具有顯著的抗氧化作用[9]。此外，RLM金櫻子能減輕糖尿病腎病大鼠的氧化損傷，減少過(guò)氧化質(zhì)，升高抗氧化酶活性，機(jī)制可能與干預(yù)氧化應(yīng)激、抑制核因子-κB、TNF-α表達(dá)有關(guān)。本研究顯示通過(guò)RLM灌胃后，大鼠的血清指標(biāo)得到了顯著的改善[10-13]。同時(shí)，本研究還觀察了RLM對(duì)氧化應(yīng)激的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DOX能顯著增加心肌中MDA含量，同時(shí)顯著降低GSH水平。這可能是DOX導(dǎo)致氧化應(yīng)激，大量氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致GSH減少。脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷后引起AST、LDH和CK-MB漏出至循環(huán)系統(tǒng)是由于心臟損傷[14]?？诜LM能明顯降低脂蛋白過(guò)氧化物酶而提高GSH，這表明這些藥物能清除自由基和減少細(xì)胞損傷。另一方面，氧化應(yīng)激可激活p38絲裂原激活的蛋白激酶和核因子-κB，從導(dǎo)致TNF-α大量合成，反過(guò)來(lái)加重氧化應(yīng)激狀態(tài)而使線粒體膜通透性發(fā)生改變，隨后導(dǎo)致自由基和細(xì)胞色素C從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活caspase-3而引起凋亡發(fā)生[15-17]。RLM可能通過(guò)抑制組織中的應(yīng)激反應(yīng)而降低心肌中TNF-α和caspase-3含量。

總之，本研究證實(shí)RLM對(duì)DOX導(dǎo)致的心肌損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化、抗炎和抗凋亡有關(guān)。在下一步研究中，筆者將對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2013-10-24 本文編輯：衛(wèi) 軻）

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（收稿日期：2013-10-24 本文編輯：衛(wèi) 軻）

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