林波 孟海玲 吳勇 邴暉 長孫東亭 羅素蘭

（海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點實驗室 ?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c實驗室，?？?570228）

靜水椎螺乙酰膽堿結(jié)合蛋白在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達、純化與結(jié)晶

林波 孟海玲 吳勇 邴暉 長孫東亭 羅素蘭

（海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點實驗室 海口市海洋藥物重點實驗室，海口 570228）

表達、純化靜水椎螺（Lymnaea stagnalis）乙酰膽堿結(jié)合蛋白（Ls-AChBP）并得到晶體。將靜水椎螺乙酰膽堿結(jié)合蛋白cDNA 序列克隆到表達載體pFastBac1上，構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pFastBac1-Ls-AChBP-His，經(jīng)重組子篩選，得到重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid，采用CellfectinⅡ脂質(zhì)體，把帶有外源基因的桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid 轉(zhuǎn)染到昆蟲細胞中，經(jīng)鎳柱和凝膠色譜柱對重組蛋白進行純化得到五聚體，并用機器人進行結(jié)晶篩選獲得其蛋白晶體。重組蛋白Ls-AChBP在Bac-to-Bac表達系統(tǒng)中得到高效表達并被純化，結(jié)晶篩選得到晶體。

靜水椎螺乙酰膽堿結(jié)合蛋白 Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng) 重組表達 純化 結(jié)晶

煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）是配體門控的離子通道蛋白（Ligand-gated ion channel），nAChRs的研究在成癮、神經(jīng)痛、阿爾茨海默氏病，精神分裂癥和帕金森氏病等疾病治療和機理研究中具有十分重要的作用。然而到目前為止，人們尚未能清楚解析這些膜蛋白的X-ray結(jié)構(gòu)。乙酰膽堿結(jié)合蛋白（AChBPs）與nAChRs的膜外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有同源性，具有五聚體結(jié)構(gòu)。多年來，通過AChBPs及其與配體結(jié)合的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)的解析，使我們理解nAChRs的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，為新藥開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)［1-3］。

目前，已從軟體動物螺里純化與鑒別出來3種乙酰膽堿結(jié)合蛋白（AChBPs），它們的結(jié)構(gòu)基本相同，分別來自靜水椎螺（Lymnaea stagnalis），海兔（Aplysia californica），淡水蝸牛（Bulinus truncates），分別簡稱 為Ls-AChBP，Ac-AChBP和Bt-AChBP。AChBPs已經(jīng)被證明與nAChRs具有相類似的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和相同藥理特性［4-6］，所以AChBPs的晶體結(jié)構(gòu)可作為研究nAChRs的工具。Ls-AChBP是三種乙酰膽堿結(jié)合蛋白中重要的一種，也是第一個被發(fā)現(xiàn)的AChBPs。本研究重組表達可溶蛋白Ls-AChBP，得到其晶體，旨在為研究nAChRs的結(jié)構(gòu)和功能及其藥理學(xué)機制提供結(jié)構(gòu)模板。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及基因 靜水椎螺乙酰膽堿結(jié)合蛋白基因根據(jù)NCBI提供的序列（GenBank number AF364899.1）設(shè)計而成，由上海生工公司合成，并測序，在兩端分別引入BamH I、XhoI酶切位點。大腸桿菌（E. coli）DH5α，轉(zhuǎn)化用大腸桿菌宿主菌DH10Bac、表達載體pFastBac1、昆蟲細胞Sf9（Spodoptera frugiperda）由本實驗室保存。

1.1.2 酶和試劑 限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI，PCR所用的dNTP和Taq酶，DNA Marker（DI5000），T4 DNA連接酶等為NEB公司產(chǎn)品。IPTG（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷），氨芐青霉素（Ampicillin），還原劑DDT（2-巰基蘇糖醇），蛋白質(zhì)Marker購自上海生工公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。昆蟲細胞培養(yǎng)基（Insect Xpress）購自Lonza公司、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體CellfectinⅡ為Invitrogen公司產(chǎn)品。PEG/Ion1，PEG/ Ion2，Index，Cystal Scree，SalRX結(jié)晶池液試劑購自HAMPTON RESEARCH 公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建表達載體 Ls-AChBP基因與經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI雙酶切后的pFastBac1載體進行連接，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFastBac1-Ls-AChBP轉(zhuǎn)化到E. coliDH10Bac中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行藍白斑篩選，利用白斑擴增得到Bacmid。

1.2.2 Bacmid的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前，先將處于對數(shù)生長期的大約密度為2×106個/mL Sf9細胞，均勻放置于平板中，每個孔中加入2 mL培養(yǎng)基，27℃靜置1 h，讓細胞貼壁，在顯微鏡下觀察到細胞要80%鋪滿平板。同時準(zhǔn)備以下溶液，溶液A：把5 μL重組Ls-AChBP/Bac加到100 μL的昆蟲細胞培養(yǎng)基，混勻。溶液B：每次轉(zhuǎn)染，把8 μL 脂質(zhì)體CellfectinⅡ加到100 μL的培養(yǎng)基中，混勻。再把溶液B加入到溶液A中混合，在室溫孵育30 min。棄去平板中的培養(yǎng)基，注意不要吸出細胞。加入2 mL培養(yǎng)基到脂質(zhì)體CellfectinⅡ與Ls-AChBP/Bac 混合液中，混勻后移至Sf9 細胞表面，27℃培養(yǎng)5 h。棄去脂質(zhì)體CellfectinⅡ與Ls-AChBP/Bac混合液，向細胞中加入8 mL培養(yǎng)基，27℃潮濕條件孵育7 d后，提取P1病毒株，把P1病毒株按1∶500擴增，5 d后獲得P2病毒株，同樣方法獲得P3病毒株。

1.2.3 重組蛋白的表達 用P3病毒感染處于對數(shù)生長期的Sf9細胞（大約細胞密度為2×106個/mL），接種量為1∶100，搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為27℃，48 h后收獲蛋白。

1.2.4 重組蛋白分離純化和鑒定 由于蛋白為分泌表達，所以將培養(yǎng)基與細胞混和物3 000 r/min離心15 min后，取上清濃縮后換溶液，溶液為50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris（pH8.0）。再高速13 000 r/min離心30 min后，掛鎳柱，用300 mmol/L的咪唑沖洗。最后用凝膠色譜（AKAT，spudex200柱）純化，流動相為50 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris（pH8.0），流速為0.5 mL/min。

1.2.5 Ls-AChBP的蛋白結(jié)晶 將純化的Ls-AChBP濃縮至約10 mg/mL。使用坐滴蒸氣擴散法在291 k長晶體。在96孔板中，用HAMPTON RESEARCH試劑PEG/Ion1，PEG/Ion2，Index，Cystal Scree，Sal tRX當(dāng)池液，用機器人CRYSTAL GRYPHON（Art robbins instrusmets）點樣，將濃縮蛋白與池液1∶1混合點坐滴，點樣量為0.15 μL，在顯微鏡下觀察晶體生長［8，9］。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建表達載體

Ls-AChBP基因N端帶有前導(dǎo)肽，能夠指導(dǎo)它分泌表達，前導(dǎo)肽的序列為MRRNIFCLACLWIVQACLS。Ls-AChBP基因C端帶有6×His，有利于它的分離純化，將帶有前導(dǎo)肽的Ls-AChBP-His經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I、和XhoⅠ雙酶切的pFastBac1載體進行連接，得到pFastBac 1-Ls-AChBP載體（圖1）。

把含載體pFastBac 1-Ls-AChBP的E. coliDH5α菌，按1∶100 的比例轉(zhuǎn)接于100 mL含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取表達質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶BamH I、和XhoⅠ進行雙酶切再次驗證。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2）表明，所切下的目的片段Ls-AChBP與預(yù)期大小708 bp一致，說明表達載體構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒送上海生工公司測序，并用NCBI ORF finder分析測序結(jié)果，分析結(jié)果（圖3）表明目的基因Ls-AChBP已正確插入到pFastBac 1中，開放閱讀框正確。

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFastBac 1-Ls-AChBP轉(zhuǎn)化到E. coliDH10Bac中，在Heper 質(zhì)粒的幫助下，pFastBac 1-Ls-AChBP質(zhì)粒中Ls-AChBP基因重組到Bacmid中，產(chǎn)物經(jīng)藍白斑篩選，將鑒定正確的白斑菌落擴增后，用堿裂解法提取E. coliDH10Bac的質(zhì)粒，并用0.5%瓊脂糖凝膠電泳（圖4）鑒定，Bacmid在點樣口附近，Heper 質(zhì)粒在中間，pFastBac 1-Ls-AChBP在最下面，約5 000 bp處。

2.2 Ls-AChBP融合蛋白在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達與純化

將bacmid擴增和純化后，用脂質(zhì)體CellfectinⅡ把Bacmid轉(zhuǎn)染進入Sf9細胞，得到P1第一代病毒，將P1傳代為P2第2代病毒，再傳代為P3第3代病毒，從而獲得高滴度的病毒株。用P3病毒株去感染大約密度為2×106個/mL Sf9細胞，接種比例為1∶100，27℃培養(yǎng)60 h后，離心收集其上清。分泌的重組蛋白Ls-AChBP的C-端帶6×His標(biāo)簽，所以用鎳柱初步純化其上清液。

分泌表達的上清液經(jīng)鎳柱初步純化后，進一步用凝膠色譜法純化。圖5-A顯示Ls-AChBP的凝膠純化色譜。Ls-AChBP的出峰位置在12.5 mL，根據(jù)Superdex200柱（GE Healthcare）的說明，峰位置為12.5 mL表示大約為130 kD的相對分子量。

從不同的峰位置A-DC收集組分作進一步的SDS-PAGE分析（圖5-B）。圖5-B中 A-C是重組蛋白Ls-AChBP原始狀態(tài)時的SDS-PAGE膠圖，SDSPAGE分析上樣時，沒有加還原劑和煮沸樣品。RARC所示是還原狀態(tài)的SDS-PAGE膠圖，即上樣時，加還原劑DDT和煮沸樣品樣5 min。

A，B，C條帶在SDS-PAGE膠頂部（圖5-B），顯示它們原始狀態(tài)形成五聚體，相對分子量約為130 kD，結(jié)果與凝膠色譜法出峰位置在12.5 mL一致。RA，RB和RC的條帶在SDS-PAGE膠中，分子量約為26 kD；正好是表達出來的重組蛋白五聚體分子量的1/5，表示它們的還原狀態(tài)為單體。

2.3 rLs-AChBP的蛋白結(jié)晶

將純化的rLs-AChBP濃縮至約10 mg/mL。使用坐滴蒸氣擴散法在291 k長晶體，點完晶體后，3 d觀察到晶體生長出來（圖6）。機器人篩選出長晶體的池液的配比如下：0.05 mol/L的檸檬酸，0.05 mol/L Bis-Tris-三丙烷，pH為5.0，16%（W/V）PEG3350。

3 討論

已知Ls-AChBP基因cDNA 序列開放閱讀框長度為690 bp（包括前導(dǎo)肽），編碼230個氨基酸，由氨基酸序列推斷的基因編碼蛋白的等電點為4.9，相對分子質(zhì)量為26 kD［7］。本研究將Ls-AChBP-6×His基因開放閱讀框序列（708 bp，含6個組氨酸）克隆到pFastBac 1載體中，成功構(gòu)建出表達質(zhì)粒pFastBac 1-Ls-AChBP-6×His，轉(zhuǎn)化E. coliDH10Bac，并轉(zhuǎn)染Sf9細胞，純化后得到五聚體蛋白，還原后的相對分子量約為26 kD，與預(yù)先設(shè)計的理論相對分子量相符。在構(gòu)建表達載體時，將His-tag連接在Ls-AChBP蛋白序列的C-端，產(chǎn)生6×His融合表達載體，主要是便于利用親和層析鎳柱進行純化，大大提高了純化效率。Hansen等［7］在哺乳動物細胞（HEK細胞）表達了C端帶有His-tag，和不帶Histag的Ls-AChBP，它們也形成五聚體，通過與不同配體結(jié)合，證明了帶His-tag和不帶His-tag的Ls-AChBP活性相似。但是，在哺乳動物細胞里表達Ls-AChBP 容易被糖基化而不易得到蛋白晶體。

已知與nAChRs結(jié)合的激動劑和競爭性拮抗劑如乙酰膽堿，尼古丁，筒箭毒堿和α-銀環(huán)蛇毒素，α-芋螺毒素等都可與AChBPs結(jié)合。AChBPs是水溶性蛋白，較易得到晶體，而且它們的晶體結(jié)構(gòu)和特性與nAChRs的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似，具有同源五聚體結(jié)構(gòu)［10-14］。本研究利用Bac-to-Bac系統(tǒng)成功表達了可溶性Ls-AChBP蛋白，并得到了蛋白晶體。該研究方法和結(jié)果為后續(xù)研究AChBPs與其特殊配體進行共結(jié)晶提供了前提和奠定物質(zhì)基礎(chǔ)?？梢杂枚舅鼗蛩幬锱菰谝训玫降木w中，或者把毒素或藥物與蛋白按一定的摩爾比混合點樣，可得到共同結(jié)晶體，然后收集X-ray晶體數(shù)據(jù)，分析受體-配體之間相互作用的機制及其藥理學(xué)關(guān)系。為開發(fā)治療與nAChRs相關(guān)的疾病藥物設(shè)計奠定理論基礎(chǔ)［15-18］。2014年是晶體學(xué)年，是晶體學(xué)創(chuàng)始人之一勞厄獲得諾貝爾獎100周年，可以預(yù)期，在隨后的幾年里，晶體學(xué)的研究將進入一個新的高潮，AChBPs與不同的藥物共結(jié)晶的研究也將是這個高潮中的一個亮點。

4 結(jié)論

成功在Bac-to-Bac昆蟲表達系統(tǒng)中高效表達靜水椎螺乙酰膽堿結(jié)合蛋白（Ls-AChBP），經(jīng)鎳柱和凝膠色譜柱對重組蛋白Ls-AChBP進行純化，得到其具有活性的五聚體，并用機器人進行結(jié)晶篩選獲得該蛋白晶體。

致謝：

感謝清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王新泉教授指導(dǎo)與幫助。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Expression，Purification，Crystallization of Acetylcholine Binding Proteins from Lymnaea stagnalis in Bac-to-Bac System

Lin Bo Meng Hailing Wu Yong Bing Hui Zhangsun Dongting Luo Sulan
（Key Lab for Tropical Biological Resources，Ministry of Education，Key Lab for Marine Drugs of Haikou，Hainan University，Haikou 570228）

It was to construct a recombinant bacmid that expresses acetylcholine binding protein from Lymnaea stagnalis（Ls-AChBP）and express the Ls-AChBP functional genes in Bac-to-Bac expression system to obtain the crystal. Synthesized Ls-AChBP cDNA was inserted into the correct position of the baculovirus expression vector pFastBac1. After the positive recombinant bacmid was screened, the recombinant bacmid was transfected into the insect cells to generate restructured baculovirus for high expression of the recombinant protein Ls-AChBP（rLs-AChBP）, which was captured by nickel-charged resin, and further purified by gel filtration chromatography. The rLs-AChBP pentamer was obtained and performed crystallization by robot screen. Recombinant Ls-AChBP expression in Bac-to-Bac system was successfully and we got Ls-AChBP crystal. Ls-AChBP is one of the AchBPs. The crystal structure of rLs-AchBP is an available template of description of nAChRs structure and function.

Ls-AChBP Bac-to-Bac expression system Recombinant expression Purification Crystallization

2013-12-17

國家自然科學(xué)基金項目（41366002），國家國際科技合作專項（2011DFR31210），海南省社會發(fā)展科技專項（SF201328），?？谑兄攸c科技計劃項目（2013-16），長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT1123），海南省研究生創(chuàng)新科研課題（B201305，B201306）作者簡介：林波，男，博士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；E-mail：linbo_752@163.com

羅素蘭，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：海洋藥物與生物技術(shù)；E-mail：luosulan2003@163.com；長孫東亭，男，副研究員. 研究方向：海洋藥物與生物技術(shù)；E-mail：zhangsundt@163.com