劉晶晶 陶妍 文雅

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

尼羅羅非魚Hepcidin成熟肽的cDNA克隆及真核表達載體的構(gòu)建

劉晶晶 陶妍 文雅

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

Hepcidin是一類由動物肝臟細胞表達，具有調(diào)節(jié)鐵代謝功能并具有抗菌作用的小分子陽離子抗菌肽，富含半胱氨酸，它們在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用，被認為是抗生素的理想替代品。TH1-5屬莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）3種Hepcidin cDNA序列中的一種。參考莫桑比克羅非魚Hepcidin TH1-5的cDNA序列，以尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）肝臟Hepcidin全長 cDNA為模板，通過PCR擴增到編碼22個氨基酸的類似于TH1-5的尼羅羅非魚Hepcidin成熟肽片段“mTH”；通過設計含Xba I和Xho I酶切位點以及信號肽酶切位點的引物，將目的片段成功連接至pGAPZ-A真核表達載體，并轉(zhuǎn)化進畢赤酵母菌GS115。經(jīng)鑒定，重組真核表達載體“pGAPZ-A-mTH”已被成功構(gòu)建，目的片段已整合進酵母染色體中。

Hepcidin 成熟肽 cDNA克隆 真核表達 畢赤酵母

抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMP）是生物防御外來病菌時，在體內(nèi)迅速合成的具有抗菌或殺菌活性的肽類物質(zhì)。自從1972年瑞典科學家Boman等首先從惜古比天蠶蛹（Hyalophora cecropia）的免疫血淋巴中分離得到高效抗菌肽cecropin以來，至今已經(jīng)有千余種抗菌肽被分離［1，2］，它們是一些內(nèi)源性的具有廣譜抗菌活性的天然小分子肽，廣泛存在于生物體中，屬非特異性免疫進化過程中的重要組成［3］?？咕耐ǔ閴A性小分子，富含帶正電荷的氨基酸，N端親水，C端疏水，具有雙親性質(zhì)［4］。此外，部分抗菌肽還能夠耐胰蛋白酶或胃蛋白酶水解，并對真菌、原蟲、病毒及癌細胞等具有一定的殺傷作用。因此，抗菌肽已越來越成為研究的熱點。

Hepcidin又稱LEAP-1（Liver-experssed antimicrobial peptide 1），是一種主要由肝細胞產(chǎn)生和分泌的小分子陽離子肽，具有廣譜抗菌活性和調(diào)節(jié)鐵代謝功能。其最初由Kruase等［5］從人血清中分離得到，之后又由Park等［6］從人尿液中分離到，然后從兩棲動物和魚類中亦發(fā)現(xiàn)了類似于Hepcidin的同源基因［7-9］。根據(jù)以往的報道，無論高等還是低等的脊椎動物，它們的Hepcidin成熟肽區(qū)域都含有6或8個半胱氨酸殘基，在空間上能夠形成3或4對二硫鍵，與其生物學活性有關。2007年，Huang等［10］確定了莫桑比克羅非魚（Oreochromis niloticus）3種Hepcidin抗菌肽的全長cDNA序列，并化學合成了它們的3種成熟肽形式：TH1-5、TH2-2和TH2-3；其中，含22個氨基酸的TH1-5和含26個氨基酸的TH2-3顯示了抗菌活性，而TH2-2則沒有活性。然而，化學合成成本高，無法大量獲得，重組DNA技術無疑是制備Hepcidin抗菌肽的最佳方法。

我們參考莫桑比克羅非魚Hepcidin TH1-5的 cDNA序列，已經(jīng)從尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）肝臟中克隆到類似于TH1-5成熟肽的基因，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了成功的融合表達，融合蛋白經(jīng)腸激酶切割后釋放出的重組肽“mTH”顯示了對革蘭氏陽性和陰性菌的良好抑菌活性［11］。但是，通過原核表達系統(tǒng)表達的目的蛋白經(jīng)常以包涵體形式存在，產(chǎn)物純化困難，且翻譯后折疊修飾體系不完善，很難得到生物活性高的目的蛋白。眾所周知，真核表達系統(tǒng)是適合于真核基因表達的良好的表達體系。據(jù)此，本研究以上述尼羅羅非魚Hepcidin TH1-5的成熟肽為目標，選擇pGAPZ-A為真核表達載體、XbaI和XhoI為限制性酶切位點，構(gòu)建真核重組表達載體；并以畢赤酵母GS115為工程菌，構(gòu)建真核表達體系，以期為獲得真核表達的具生物學活性的尼羅羅非魚Hepcidin 成熟肽奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 用于質(zhì)粒復制和cDNA克隆的大腸桿菌菌株DH5α購自北京天根生物科技公司；克隆質(zhì)粒pMD19-T購自TaKaRa公司（日本）；真核表達載體pGAPZ-A及畢赤酵母GS115購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司（美國）；ExTaqDNA 聚合酶、T4DNA連接酶、XhoI和XbaI限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司（日本）；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、DNA分子量marker和蛋白質(zhì)分子量marker購自北京天根生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對Hepcidin TH1-5成熟肽的cDNA片段添加酶切位點的PCR擴增 尼羅羅非魚成魚（體重0.3 kg）購自上海市浦東匯侖特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場，其肝臟Hepcidin TH1-5的全長cDNA克隆同文雅等［11］。以此全長cDNA為模板，設計1個含XhoI酶切位點（單下劃線區(qū)域）和信號肽酶切位點（雙下劃線區(qū)域）的正向引物H-MQF（5'-CCGCTCGAGAAAAGAGGCA TCAAGTGTCGC-3'）以及含XbaI酶切位點（單下劃線區(qū)域）的反向引物H-MQR（5'-CTAGTCTAGATC AGAACCTGCAGCAAACTCC-3'），用于擴增Hepcidin TH1-5成熟肽的cDNA片段。PCR反應體系和條件如下：2.5 μL全長cDNA、各4.0 μL 10 μmol/L的正向和反向引物、1.0 μLTaq plusDNA polymerase（5 U/μL）、10 μL Taq plus Buffer、8.0 μL dNTP Mixture，用無菌水將反應液調(diào)至100 μL；94℃預變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min；最終72℃延伸5 min，反應共進行30個循環(huán)。經(jīng)DNA純化試劑盒純化的目的片段“mTH”與pMD19-T質(zhì)粒按3∶1比例、在T4 DNA連接酶的作用下，16℃保溫2 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，37℃培養(yǎng)過夜；挑取經(jīng)菌落PCR鑒定后確定的5個陽性克隆由上海生工生物工程有限公司進行DNA測序。

1.2.2 Hepcidin氨基酸序列的多重比對及分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建 用于多重比對的Hepcidin全長氨基酸序列來自NCBI網(wǎng)站，它們的序列號分別為：尼羅羅非魚（nile tilapia，ID：AAU25840.2）、鱸魚（perch，ID：AAT09138.1）、斑點叉尾鮰（channel catfish，ID：ABA43709.1）、長鰭叉尾鮰（blue catfish，ID：AAX-39714.1）、斑馬魚（zebrafish，ID：AAN10302.1）、鰱魚（silver carp，ID：AGZ15358.1）、黃鱔（ricefieldeel，ID：ADK79123.1）、犬（dog，ID：AAT95397.1）、豬（pig，ID：AAM77745.1）、人（human，ID：NP_06-6998.1）、羊（sheep，ID：ADK56130.1）、家鼠（house mouse，ID：AAH21587.1）、狒狒（baboon，ID：ABU75213.1）、長臂猿（gibbon，ID：NM_001112914）、猩猩（orangutan，ID：NP_001127676.1）。分子系統(tǒng)樹根據(jù)上述生物Hepcidin成熟肽的氨基酸序列構(gòu)建，采用MEGA5.05臨位相聯(lián)法（Neighbor-Joinging），各結(jié)點的置信度由自引導值估計，重復次數(shù)為1 000。

1.2.3 pGAPZ-A-mTH真核重組表達載體的構(gòu)建及陽性重組子的篩選 上述含“pMD19-mTH”重組質(zhì)粒的陽性克隆經(jīng)LB液體培養(yǎng)過夜后，用質(zhì)粒小提試劑盒進行質(zhì)粒提純，然后對其進行XbaI和XhoI雙酶切，反應體系和條件如下：“pMD19-mTH”重組質(zhì)粒16 μL、10×Buffer 2 μL、XbaI 1 μL、XhoI 1 μL，37℃保溫反應3 h后，用10×Loading Buffer終止反應，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段。另一方面，對pGAPZ-A真核表達載體進行同樣的雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，切下線性質(zhì)粒條帶進行DNA純化。將含酶切位點的目的片段“mTH”與線性的pGAPZ-A載體按7∶1比例在以下條件16℃保溫16 h：“mTH”片段7 μL、pGAPZ-A載體1 μL、10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL；連接液轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜。挑取抗博來霉素陽性的單菌落為模板，正向引物和反向引物序列均來自pGAPZ-A載體，PCR反應條件同1.2.1，除了退火溫度改為56℃。另一方面，對經(jīng)菌落PCR鑒定的陽性重組子進行雙酶切處理和電泳鑒定。挑取2個陽性重組子由上海生工生物工程有限公司進行DNA測序。

1.2.4 pGAPZ-A-mTH真核重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 重組表達質(zhì)?！皃GAPZ-A-mTH”經(jīng)BamH I酶切線性化后經(jīng)DNA純化試劑盒純化，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，方法如下：將5-10 μL線性重組子加入80 μL酵母感受態(tài)細胞中，一并轉(zhuǎn)入預冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰上放置5 min后進行電轉(zhuǎn)，條件：1.5 kV、25 μF、200 ohm、5 ms；電轉(zhuǎn)之后加入600 μL預冷的1 mol/L山梨醇，將此溶液轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中，30℃靜置1-2 h；采用含博來霉素0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的YPD平板篩選高拷貝工程菌；提取高拷貝酵母菌落的總DNA，以此為模板，采用載體上的通用引物，通過PCR檢驗目的片段是否與酵母染色體整合。

2 結(jié)果

2.1 添加限制性酶切位點和信號肽酶切位點的尼羅羅非魚Hepcidin成熟肽的cDNA克隆

以尼羅羅非魚肝臟Hepcidin全長cDNA為模板，通過設計含XbaI和XhoI限制性酶切位點以及信號肽酶切位點的引物，擴增得到1個85 bp的片段“mTH”（圖1）。經(jīng)DNA測序確證，上述酶切位點已被成功添加（圖4-A），除去這些酶切位點，該片段編碼了由22個氨基酸殘基組成的Hepcidin成熟肽，8個保守的半胱氨酸殘基位于成熟肽內(nèi)。

2.2 尼羅羅非魚與其他生物之間Hepcidin一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列比較

采用Clustal W軟件對尼羅羅非魚Hepcidin與其他魚類以及哺乳動物的Hepcidin一級結(jié)構(gòu)進行比對，由圖2可見，不同來源Hepcidin氨基酸序列顯示了16個保守的氨基酸殘基（灰色和黑色陰影），其中9個殘基位于成熟肽區(qū)域內(nèi)，尤其是與Hepcidin抗菌活性有關的高度保守的8個半胱氨酸殘基（黑色陰影），由此證明成熟肽區(qū)域主要承擔了Hepcidin的生物學功能。由表1可見，魚類中，與尼羅羅非魚同源性最高的是鱸魚（perch），為86%；而哺乳動物與尼羅羅非魚之間的同源性則都低于30%。

2.3 基于Hepcidin成熟肽氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹分析

由圖3可見，在基于Hepcidin成熟肽氨基酸序列的分子系統(tǒng)樹中，一共有3大組。兩個大組分別屬于魚類和哺乳動物，分別由自引導值98和92支持；一個小組由尼羅羅非魚和鱸魚（perch）組成，由自引導值97支持，證明它們兩者的親緣關系最近，而與它們兩者關系最近的是斑馬魚（zebrafish）。這些結(jié)果與上述基于Hepcidin全長氨基酸序列的同源性比對結(jié)果基本上是一致的。

2.4 pPICZ-A-mTH真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

將含XbaI和XhoI酶切位點的“mTH”片段與事先用這兩種酶處理過的pGAPZ-A連接，得到重組表達質(zhì)?！皃GAPZ-A-mTH”（圖4-B）。通過菌落PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)在約671 bp處有清晰條帶（5-A），與理論相符，初步確定為陽性菌落；進一步對陽性菌落中的質(zhì)粒進行提純，通過XbaI和XhoI對質(zhì)粒進行雙酶切處理，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)存在大、小分子量的兩條譜帶，其中一條約85 bp的小分子量譜帶屬于目的片段（圖5-B）。最終通過對陽性克隆的測序，證明目的片段“mTH”已正確連接至pGAPZ-A真核表達載體，并且核苷酸序列未發(fā)生任何堿基突變。另一方面，酵母菌總DNA的PCR結(jié)果（圖6）。證明了經(jīng)BamH I酶切線性化的重組表達質(zhì)?！皃GAPZ-A-mTH”已順利嵌合進酵母染色體中。

3 討論

由于近年來水域環(huán)境嚴重污染，導致抗生素的過量使用，給水產(chǎn)食品安全帶來了極大的隱患，因此，開發(fā)能夠部分替代抗生素和提高水產(chǎn)生物免疫功能的天然抗菌劑勢在必行。先天免疫機制是魚類抵御感染的第一道防線，而抗菌肽在魚類的免疫系統(tǒng)中起到了關鍵的作用。雖然昆蟲來源和兩棲動物來源的抗菌肽研究已有很多報道［12-14］，但對于魚類來源抗菌肽的報道較少，至于魚類抗菌肽真核表達方面的研究報道則更少。我們已經(jīng)成功獲得了基于大腸桿菌原核系統(tǒng)表達的具有良好抗菌活性的尼羅羅非魚重組體Hepcidin成熟肽“mTH”?？紤]到翻譯后折疊、表達量、產(chǎn)物的后續(xù)處理等問題，本研究在原核表達的基礎上，選擇pGAPZ-A作為真核表達載體，該載體可隨機嵌合進酵母染色體中，以獲得高拷貝的重組轉(zhuǎn)化子，有利于提高外源蛋白的表達量［15］；在結(jié)構(gòu)上，它含有組合型的-GAP啟動子和α-MF信號肽序列，無需甲醇誘導即可表達外源蛋白并能有效的分泌到胞外，防止了外源蛋白對細胞產(chǎn)生毒害作用。此外，它只需用博來霉素進行篩選，大大方便了操作，更適合于生產(chǎn)上大規(guī)模的制備。我們設計正向引物時，在其C端添加了信號肽的酶切位點，以確保表達產(chǎn)物在分泌到胞外時其N端的信號肽被自動切除，繼而得到天然序列的目的蛋白。試驗結(jié)果證明真核表達載體“pGAPZ-A-mTH”已被成功構(gòu)建，酵母總DNA的PCR擴增結(jié)果也證明了目的片段已整合進酵母染色體中，為后期在畢赤酵母GS115中的表達奠定了良好的基礎。

4 結(jié)論

本研究以通過RT-PCR獲得的尼羅羅非魚肝臟Hepcidin全長 cDNA為模板，參考莫桑比克羅非魚Hepcidin TH1-5的cDNA序列，設計一對含XbaI和XhoI酶切位點以及信號肽酶切位點的引物，通過PCR擴增到編碼22個氨基酸的類似于TH1-5的尼羅羅非魚Hepcidin成熟肽片段“mTH”；目的片段被成功連接至pGAPZ-A真核表達載體，并轉(zhuǎn)化進畢赤酵母菌GS115。經(jīng)鑒定，重組真核表達載體“pGAPZA-mTH”已被成功構(gòu)建。

［1］Boman HG, Nilsson I, Rasmuson B. Inducible antibacterial defense system in Drosophila［J］. Nature, 1972, 237：232-235.

［2］ 李冠楠, 夏雪娟, 隆耀航, 等. 抗菌肽的研究進展及其應用［J］.動物營養(yǎng)學報, 2014, 26（1）：17-25.

［3］陳勇, 蘇永全, 吳常文, 等. 大黃魚Piscidin-like抗菌肽基因部分cDNA的克隆與序列分析［J］.廈門大學學報：自然科學版, 2008, 47（40）：575-579.

［4］Papagianni M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties：biosynthesis, structure, function, and applications［J］. Biotechnology Advances, 2003, 21（6）：465-499.

［5］Krausea A, Neitz S, Magerth J. LEAP-1, a novelhighly disulfidebonded human peptide, exhibits antimicrobial activity［J］. FEBS Letters, 2000, 480：147-150.

［6］Park CH, Valore EV, Waring AJ, et al. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver［J］. Biological Chemistry, 2001, 276：7806-7810.

［7］田汶佳, 劉炯宇, 江建平. 無指盤臭蛙皮膚抗菌肽Odorgrin A真核表達載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化［J］.應用與環(huán)境生物學報, 2010, 16（2）：222-227.

［8］ 黨曉偉, 李夢云, 常娟. Hepcidin的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學, 2010, 38（7）：3351-3353.

［9］Douglas SE, Gallant JW, Liebscher RS. Identification and expression analysis of hepcidin-like antimicrobial peptides in bony fish［J］. Developmental and Comparative Immunology, 2003, 27（6-7）：589-601.

［10］Huang PH, Chen JY, Kuo CM. Three different hepcidins from tilapia, Oreochromis mossambicus：Analysis of their expressions and biological functions［J］.Molecular Immunology, 2007, 44（8）：1922-1934.

［11］文雅, 陶妍. 尼羅羅非魚Hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達及其抗菌活性［J］.上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版, 2012, 4：68-75.

［12］李建民, 馬志飛, 曹勤洪, 等.中國家蠶抗菌肽CBM1、CBM2的克隆和表達研究［J］.生物技術通訊, 2005, 16（4）：367-370.

［13］姜麗麗, 尚德靜. 蛙類皮膚及其分泌物中生物活性肽的研究進展［J］.中國生化藥物雜志, 2005, 4：246-249.

［14］Woodhams DC, Rollins-Smith LA, Carey C, et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs［J］. Oecologia, 2006, 146：531-540.

［15］Wang AP, Wang S, Shen MQ, et al. High level expression and purification of bioactive human-defensin 5 mature peptide in Pichia pastoris［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 84：877-884.

（責任編輯 李楠）

cDNA Cloning and Construction of Eukaryotic Recombinant Expression Vector for Hepcidin Mature Peptide from Tilapia（Oreochromis niloticus）

Liu Jingjing Tao Yan Wen Ya
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Hepcidin is a small cysteine-rich cationic antimicrobial peptide with the regulative function for iron metabolism. It is expressed predominantly in the liver of animals. Hepcidin plays an important role in the host’s immune response against microbial invasion. Thus, it is considered to be good substitutes for traditional antibiotics. TH1-5, one of the three different hepcidin cDNAs from tilapia（Oreochromis mossambicus）. The cDNA encoding hepcidin mature peptide（mTH）containing 22 residues was cloned from hepcidin full-length cDNA of tilapia（Oreochromis niloticus）liver by PCR. The forward and reverse primers were designed with reference to the nucleotide sequence of O. mossambicus hepcidin TH1-5. This cDNA fragment carrying Xba I and Xho I sites was inserted into pGAPZ-A plasmid with the same restriction sites to construct a recombinant expression plasmid “pGAPZ-A-mTH”. The colony PCR, Xba I and Xho I restriction endonuclease digestion and DNA sequencing demonstrated that the “pGAPZ-A-mTH” recombinant expression plasmid was constructed successfully. In addition, the recombinant expression plasmid was transformed into Pichia pastoris GS115 by an electroporation system. PCR using yeast DNA as template demonstrated that the recombinant expression plasmid was inserted into the yeast chromosome.

Hepcidin Mature peptide cDNA cloning Eukaryotic expression Pichia pastoris

2014-01-19

上海市教育委員會重點創(chuàng)新基金項目（11ZZ148）

劉晶晶，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)生物分子生物學；E-mail：liujingjing0424@foxmail.com

陶妍，女，教授，碩士生導師，研究方向：水產(chǎn)生物分子生物學；E-mail：ytao@shou.edu.cn