陳亞冰蘭道亮林寶山黃偲黃勇李鍵，

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041）

牦牛不同組織TLR3、TLR5mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)定量研究

陳亞冰1蘭道亮2林寶山1黃偲1黃勇1李鍵1，2

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041）

參考牦牛TLRs基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物，建立檢測(cè)牦牛TLRs相對(duì)表達(dá)量的熒光定量PCR方法，分析TLR3及TLR5基因在牦牛不同器官組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示兩基因具有不同的表達(dá)譜及表達(dá)量，其中TLR3基因除在乳腺組織外，在其它組織器官中均有轉(zhuǎn)錄，其中在心、大腸、胃和肌肉組織中表達(dá)量較高；TLR5基因則在心、肺、大腸、小腸、胃、肌肉、卵巢組織中具有較高的表達(dá)量。該試驗(yàn)結(jié)果表明，TLRs在不同組織器官轉(zhuǎn)錄水平差異較大，可能與其對(duì)病原體的識(shí)別有關(guān)；同一個(gè)基因在不同組織中存在差異性，這可能與基因作用機(jī)理相關(guān)。

牦牛 轉(zhuǎn)錄水平 TLRs 相對(duì)定量

病原微生物感染宿主后，宿主細(xì)胞通過體內(nèi)廣泛表達(dá)的病原分子模式識(shí)別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）檢測(cè)病原相關(guān)分子模式（Pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）的存在，激活宿主的天然免疫應(yīng)答［1］。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一種重要的模式識(shí)別受體，通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，刺激信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終啟動(dòng)了機(jī)體的天然免疫和引起獲得性免疫反應(yīng)［2-4］。不同TLRs可以識(shí)別相應(yīng)的PAMPs：TLR3識(shí)別病毒雙鏈RNA（Double strand RNA，dsRNA）、單鏈RNA病毒的復(fù)制中間產(chǎn)物dsRNA以及聚肌甘酸［poly（I：C）］［5，6］，TLR5主要識(shí)別微生物鞭毛蛋白［3］，兩種受體在識(shí)別微生物感染感染中起著關(guān)鍵作用。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被用于檢測(cè)TLRs在不同物種、不同組織、不同細(xì)胞中的表達(dá)量［7-10］。然而，采用定量方法研究牦牛體內(nèi)TLRs表達(dá)分布還沒有相關(guān)報(bào)道［11-14］。

牦牛是世代生活在高原環(huán)境下的特殊物種，其機(jī)體早已適應(yīng)了高原的低氧、嚴(yán)寒等惡劣天氣，對(duì)牦牛的抗病分子機(jī)制進(jìn)行研究，一方面可以深入理解高原動(dòng)物特有的免疫機(jī)制；另一方面也為牦牛的抗病育種奠定理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)前期克隆了牦牛TLR3及TLR5基因序列，基因序列分析結(jié)果表明牦牛TLRs基因和其它物種相應(yīng)基因具有較高的同源性，因此，下一步要重點(diǎn)比較分析TLRs基因在牦牛體內(nèi)表達(dá)模式。本研究基于SYBR Green I RT-CR技術(shù)，檢測(cè)并分析TLR3、TLR5基因在不同組織中的表達(dá)水平，為后續(xù)研究牦牛體內(nèi)的相關(guān)免疫機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 5頭牦牛（母，平均年齡4歲）來自甘南藏族自治州夏河縣安，均屬于麥洼牦牛。采集11種組織樣本（心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、卵巢和乳腺）均放入液氮中送回實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀及普通PCR儀均是Bio-Rad公司產(chǎn)品；Trizol購自Invitrogen公司；RT反轉(zhuǎn)錄酶及SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取及DNA膠回收試劑盒購于Axygen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的牦牛TLR3及TLR5全長(zhǎng)序列，依據(jù)定量引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)定量引物，普通PCR檢驗(yàn)引物特異性，引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.2 組織RNA提取 稱量約200 mg組織樣品后迅速轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中，研杵研磨組織，直至研磨成粉末狀。加入1 mL的Trizol，室溫靜置直至樣品完全融化，吸取1 mL至無RNA酶的離心管中，加入200 μL的氯仿，劇烈振蕩，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心15 min；小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min；12 000 r/min離心10 min；棄上清，沉淀加入1 mL 75%的乙醇洗滌，12 000 r/min離心5 min；棄上清，室溫干燥沉淀，加入30 μL DEPC水溶解RNA，檢測(cè)RNA的純度及完整性。

1.2.3 cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成 RNA需要進(jìn)行去除基因組的處理：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA 1 μL，RNA 2 μg，Rnase Free dH2O補(bǔ) 足 到10 μL，42℃ 2 min 進(jìn)行DNA去除試驗(yàn)并得到反應(yīng)液1。采用20 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：反應(yīng)液1 10 μL，PrimeScript RT Enzyme MixI 1.0 μL，Primer Mix 1.0 μL，5× PrimeScript Buffer2 4.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL。按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃、15 min；85℃、5 s，生成的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4TLR3、TLR5基因熒光定量PCR檢測(cè)方法及組織表達(dá)譜建立

1.2.4.1 引物特異性鑒定 選取牦牛脾臟組織cDNA為模板首先進(jìn)行普通PCR反應(yīng)來檢驗(yàn)引物的特異性，選擇特異性較好的引物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)溶解曲線的單一性選擇最近定量引物。

1.2.4.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 熒光定量PCR的循環(huán)條件進(jìn)行了兩步法和三步法的摸索；退火溫度從55℃依次遞增至65℃，每次遞增1℃，確定最佳退貨溫度；最終確定采用三步法進(jìn)行定量反應(yīng)，TLR3最佳退火溫度是58℃，TLR5及β-actin最佳退火溫度是60℃。Real-time PCR反應(yīng)體系為15 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII 7.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，dH2O 5.5 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，39個(gè)循環(huán)，添加熔解曲線；每個(gè)組織樣品添加3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)同時(shí)添加一個(gè)以dH2O為模板的陰性對(duì)照。

1.2.4.3TLR3、TLR5及β-actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 提取陽性菌液質(zhì)粒，將獲得的質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定，用EASY dilution進(jìn)行10倍倍比稀釋，置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ赃B續(xù)10倍倍比稀釋（1×101-1010copies/μL）的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，并制作各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.4 定量PCR檢測(cè)TLR3、TLR5基因在各組織中的表達(dá)分布 分別以5頭母牦牛11種組織cDNA為模板，進(jìn)行定量PCR反應(yīng)檢測(cè)目的基因的表達(dá)量，采用Pfaffl method計(jì)算出基因在各組織的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)應(yīng)用SPSS 18.0軟件計(jì)算重復(fù)樣品之間Ct均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差，最后使用excel制圖功能繪制出基因在牦牛各組織中的相對(duì)表達(dá)柱狀圖。

Etarget：目的基因擴(kuò)增效率；Ereference：內(nèi)參基因擴(kuò)增效率；control：對(duì)照組；experiment：試驗(yàn)組。

2 結(jié)果

2.1 RNA完整性檢測(cè)

提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，可明顯地看到28S、18S及5.5S rRNA 3條帶，說明提取的 RNA無降解，可用于反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)定量試驗(yàn)。

2.2 引物特異性檢驗(yàn)

以牦牛脾臟組織cDNA為模板、TLR3-S、TLR3-A、TLR5-S、TLR5-A、Actin-S、Actin-A為引物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。基因的熔解曲線見圖2，從圖2可以看出，Actin基因在Tm=（82±0.5）℃、TLR3在溶解溫度為Tm=（83.5±0.5）℃，TLR5在溶解溫度Tm=（85±0.5）℃時(shí)出現(xiàn)單一的特異性峰，表明該引物特異性良好。菌液測(cè)序結(jié)果正確，證明擴(kuò)增片段是目的片段。

2.3 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

對(duì)兩基因陽性標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋（1×101-1010copies/μL），作為標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的模板，按照各基因不同稀釋度的Ct值，選擇最佳檢測(cè)范圍，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。從圖3可以看出，質(zhì)粒濃度為1×102-108copies/μL時(shí)，TLR3基因擴(kuò)增效率達(dá)到了95%，相關(guān)系數(shù)為0.999；質(zhì)粒濃度為1×101-108copies/μL時(shí)，TLR5基因擴(kuò)增效率達(dá)到了94.3%，相關(guān)系數(shù)為0.999；質(zhì)粒濃度范圍為1×102-108copies/μL時(shí)，β-actin基因擴(kuò)增效率達(dá)到了95.4%，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.4 熒光定量PCR檢測(cè)TLR3、TLR5基因在牦牛組

織中的表達(dá)分布

以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用Pfaffl method，以小腸基因表達(dá)量作為對(duì)照組，分析TLR3、TLR5基因在牦牛不同組織中的表達(dá)量水平。其中TLR3在心臟，大腸，胃，肌肉及卵巢等組織表達(dá)量較高（圖4）；TLR5在心，肺，大腸，小腸，胃，肌肉，卵巢，肌肉，乳腺等組織表達(dá)量較高（圖5）。

3 討論

目前，常用的定量PCR檢測(cè)方法有Taqman熒光探針方法和SYBR Green I染料方法，其中SYBR Green I熒光嵌合染料因具有無需設(shè)計(jì)、標(biāo)記熒光探針和操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，深受研究者們青睞［15］。本試驗(yàn)中，擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)特異性較好的單峰，測(cè)序結(jié)果證實(shí)為相應(yīng)的目的片段，表明引物特異性良好。本試驗(yàn)采用相對(duì)定量法，利用β-actin來校準(zhǔn)目的基因的表達(dá)量，β-actin和目的基因定量具有相似的擴(kuò)增效率，均在95%左右，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

TLRs作為一種重要的模式識(shí)別受體，不僅在天然免疫中起重要作用，同時(shí)也是天然免疫和獲得性免疫的連接點(diǎn)，其可以介導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答［16］。TLRs的研究為闡明天然免疫機(jī)制及尋找由于免疫失調(diào)所致疾病的治療提供新的思路［17］。牦牛是青藏高原上的一個(gè)特有物種，其機(jī)體可能存在特殊的抗病免疫機(jī)制，因此對(duì)其免疫機(jī)制研究就具有一定的必要性。本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)牦牛TLR3、TLR5基因與其它平原哺乳動(dòng)物相應(yīng)基因具有較高的同源性。因此，分析比較它們的組織表達(dá)模式差異可以為理解牦牛機(jī)體免疫機(jī)制提供了新的思路。TLR3是識(shí)別dsRNA的特異性受體，當(dāng)病毒感染機(jī)體時(shí)，會(huì)在機(jī)體的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生dsRNA，TLR3可以識(shí)別dsRNA，并將信號(hào)向下游傳遞，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)，并繼而激發(fā)獲得性免疫反應(yīng)［5，6］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TLR3表達(dá)具有一定的組織特異性，其中在心臟、大腸、胃、肌肉及卵巢等組織表達(dá)量較高，這可能與局部組織對(duì)病原體的識(shí)別和抵抗能力有關(guān)。TLR5基因通過識(shí)別、結(jié)合入侵病原菌的鞭毛蛋白，激活特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)合成細(xì)胞因子，啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)，并誘發(fā)獲得性免疫反應(yīng)［4］。本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)牦牛器官及組織進(jìn)行TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，為進(jìn)一步TLRs免疫機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。當(dāng)然，僅檢測(cè)TLRs mRNA轉(zhuǎn)錄水平不能完全代表Toll樣受體蛋白的表達(dá)水平，TLRs在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平差異是否影響到蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而影響下游與配體的結(jié)合能力、下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞因子的釋放，有待下一步的研究。下一步同時(shí)將重點(diǎn)針對(duì)不同品種、不同海拔以及不同年齡段牦牛體內(nèi)組織器官轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)TLR5具有一個(gè)分布廣泛組織表達(dá)譜，同時(shí)在心、肺、大腸、小腸、胃、肌肉、卵巢及乳腺等組織表達(dá)量較高，這可能與病原體侵入機(jī)體途徑多樣化相關(guān)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Relative Quantification of mRNA Transcription of TLR3 and TLR5 in Different Tissues of Yak

Chen Yabing1Lan Daoliang2Lin Baoshan1Huang Cai1Huang Yong1Li Jian1，2
（1. College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041；2. College of Tibetan Plateau Research，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

According to the sequences of yak TLR3 and TLR5, the real-time PCR primers were designed to establish a method for the detection of mRNA transcription of TLRs by Real-time quantitative PCR, and the transcription level of TLRs in different tissues of yak was analyzed. The results showed that two genes have different expression pattern and expression level in tissues. The TLR3 mRNA was detected in examined tissues except mammary gland, and it was expressed at a higher level in heart, large intestine, stomach and muscle. The TLR5 mRNA level was higher in heart, lung, large intestine, small intestine, stomach, muscle and ovary. The results indicated that there exists difference in the transcription level of TLRs in tissues, which may be associated with the recognition of pathogens. For the same gene, the mechanism of gene may bring difference in expression level in different tissues.

Yak Transcriptional level TLRs Relative quantification

2014-03-15

中央高校青年教師基金項(xiàng)目（2014NZYQN37）

陳亞冰，男，碩士研究生，研究方向：高原動(dòng)物免疫分子機(jī)制；E-mail：cybxc923410296@126.com

李鍵，男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物生殖調(diào)控；E-mail：lijian@swun.cn；蘭道亮，男，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物免疫機(jī)理；E-mail：landaoliang@163.com