魏博 潘陽陽 禹堯 田楓 余四九

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

牦牛PAFR基因生物信息學(xué)分析及其在妊娠前后子宮中的表達(dá)

魏博 潘陽陽 禹堯 田楓 余四九

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

以牦牛血小板活化因子受體（Platelet-activating factor receptor，PAFR）基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采取西寧家養(yǎng)牦牛子宮為材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆牦牛PAFR基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用QRT-PCR方法定量檢測(cè)PAFR在牦牛子宮不同時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果表明，牦牛PAFR基因編碼區(qū)長(zhǎng)1 029 bp，編碼342個(gè)氨基酸；氨基酸序列與黃牛同源性最高為99.7%，與非洲爪蟾蜍同源性最低為59.1%，表明PAFR氨基酸在進(jìn)化過程中具有保守性；其編碼蛋白的氨基酸序列有5個(gè)跨膜區(qū)域，推測(cè)其可能為跨膜蛋白；具有親水性；未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽片段；含有G蛋白偶聯(lián)受體家族結(jié)構(gòu)域；QRT-PCR檢測(cè)PAFR在牦牛子宮中表達(dá)，妊娠期最高，卵泡期最低，黃體期居中，揭示其與胚胎附植，妊娠維持有關(guān)。

牦牛 PAFR 基因克隆 生物信息學(xué)分析 基因表達(dá)

牦牛是中國(guó)僅次于黃牛和水牛的主要牛種之一，也是牛屬動(dòng)物中能適應(yīng)高寒氣候而延續(xù)至今的珍稀畜種資源。其主要分布在我國(guó)青藏高原和甘肅等地。由于其繁殖能力不強(qiáng)，所以利用日趨完善的人工受精及胚胎移植等技術(shù)對(duì)牦牛進(jìn)行珍惜物種資源保護(hù)，提高其繁育生產(chǎn)能力必將成為未來發(fā)展趨向。

血小板活化因子（Platelet-activating factor，PAF）是一種內(nèi)源性磷脂遞質(zhì)，其化學(xué)名稱為1-O-烷基-2-乙?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿。PAF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的脂質(zhì)遞質(zhì)，它廣泛存在于各種組織［1］。PAF在生殖方面具有多種生物學(xué)活性，其在受精、附植和妊娠過程中扮演重要角色［2，3］。目前以PAF在子宮中的表達(dá)研究較多。1986年Yasuda 等［4］在小鼠子宮中發(fā)現(xiàn)PAF濃度變化，O'Neil等［5］也發(fā)現(xiàn)PAF與小鼠附植前胚胎發(fā)育關(guān)系密切。不久Angle等［6］證實(shí)了家兔子宮中PAF濃度變化與附植過程有關(guān)。而PAF的生物學(xué)活性是通過與其受體（Platelet-activating factor recepter，PAFR）結(jié)合從而表達(dá)的。PAFR是在［3H］-PAF和PAF受體拮抗劑——［3H］-WEB2086的配體結(jié)合試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的［7，8］。1991年Honda等［9］建立了豚鼠肺PAFR的cDNA克隆，并成功進(jìn)行了表達(dá)。后續(xù)研究中，在兔［10，11］、人［12］、牛［13］、犬［14］的子宮中也都檢測(cè)到了PAFR的分布，但PAFR在牦牛子宮中還未被檢測(cè)到。鑒于此，本研究對(duì)牦牛PAFR基因編碼區(qū)序列進(jìn)行克隆，對(duì)其編碼蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)其在妊娠前后牦牛子宮中的含量。以期闡明牦牛PAFR基因分子的遺傳特性，為進(jìn)一步揭示PAF在牦牛生殖過程中發(fā)揮的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 青海省西寧市定點(diǎn)屠宰場(chǎng)。分別取卵泡期、黃體期、妊娠期雌性牦牛子宮組織樣，用錫紙包裹后放入標(biāo)記好的布袋中，立即投入液氮中帶回，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要儀器和試劑 羅氏 LightCycler 480定量PCR儀，Bio-Rad常規(guī)PCR儀；引物由上海華大基因合成；柱式動(dòng)物組織RNA抽提純化試劑盒，Taq PCR Master Mix購自生工生物公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，pMDR18-T vector購自 TaKaRa公 司，Gel Extraction Kit（100）D2500-01購自O(shè)MEGA公司，TransStartTMTop Green qPCR SuperMix購自TransGen Biotech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 從GenBank 數(shù)據(jù)庫中檢索黃牛的PAFR基因（XM_005203162.1）的cDNA序列和β-actin基因（XM_004970638.1），用Primer Premier 5設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1）。其中引物1、2為用于RT-PCR的PAFR引物；引物3為用于QPCR的PAFR引物。β-actin引物作為內(nèi)參檢測(cè)引物。

1.2.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 用生工生物工程柱式動(dòng)物組織RNA抽提純化試劑盒提取總不同時(shí)期牦牛子宮RNA，具體步驟參照說明書。用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成牦牛子宮的cNDA。具體操作步驟參照說明書。采用β-actin為內(nèi)參基因，β-actin引物引自Ann-Sofi Bergqvist，PCR擴(kuò)增后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)cDNA的質(zhì)量，-20℃保存。

1.2.3 牦牛PAFR基因的擴(kuò)增與克隆 引物1、引物2及β-actin引物的擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件相同。反應(yīng)體系：上下游引物各0.5 μL（10 pmol/L），模板1 μL，Taq PCR Master Mix（生工生物公司）10 μL，無菌去離子水8 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及質(zhì)量用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將目的條帶用Gel Extraction Kit（100）D2500-01（OMEGA公司）回收純化，將純化好的cDNA與pMDR18-T vector連接，并轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液送華大基因測(cè)序。

1.2.4 牦牛PAFR基因的生物信息學(xué)分析 用MEGA5軟件對(duì)克隆測(cè)序得到的目的基因進(jìn)行拼接編輯，及基因編碼氨基酸序列的推導(dǎo)；用ORF Finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）進(jìn)行開放閱讀框分析；用在線軟件ProtParam（http：//web. expasy.org/protparam/）分析牦牛PAFR基因編碼蛋白理化性質(zhì)；用ProtScale（http：//web.expasy.org/prots cale/）軟件分析其疏水性質(zhì)。

利用NCBI的BLAST在線軟件進(jìn)行對(duì)比分析，再用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析；使用MEGA 5.1 軟件構(gòu)建PAFR基因的系統(tǒng)發(fā)生樹。用于同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析的其他物種的PAFR基因序列從GenBank中下載，各物種PAFR基因序列登錄號(hào)，見表2。

用在線軟件SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.1/）分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽位點(diǎn)；用在線軟件TMHMM Server V 2.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對(duì)預(yù)測(cè)蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析。

使用軟件Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interp ro/）預(yù)測(cè)蛋白所包含的結(jié)構(gòu)域；用在線軟件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= /NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；用在線軟件SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expas y.org/）對(duì)牦牛PAFR蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.5 妊娠前后牦牛子宮中PAFR基因的檢測(cè) 牦牛子宮按照卵泡期、黃體期、妊娠期分為3組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別為待測(cè)孔、內(nèi)參對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，每組3個(gè)重復(fù)。將各組樣品cDNA濃度均調(diào)至160 ng/μL。反應(yīng)體系（20 μL）體系：2× TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，57℃ 15 s，72℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，65℃ 1 min；40℃ 30 s。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 牦牛PAFR基因的擴(kuò)增與克隆

反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增產(chǎn)物大小與引物預(yù)期產(chǎn)物大小一致。用MEGA軟件進(jìn)行拼接編輯后，利用NCBI的BLAST軟件在線比對(duì)分析確定，PAFR與其引物設(shè)計(jì)參考序列一致性為99%，因此可以判定引物1、2經(jīng)拼接編輯得出序列為牦牛PAFR基因。并已將其提交保存到GenBank中，收錄號(hào)為KF771404。

2.2 牦牛PAFR基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 牦牛PAFR基因編碼蛋白的理化性質(zhì) 測(cè)序結(jié)果經(jīng)MEGA5軟件拼接后，獲得的PAFR基因序列用在線軟件ORF Finder，檢測(cè)到一條長(zhǎng)1 029 bp的開放閱讀框，推測(cè)可編碼342個(gè)氨基酸。使用在線軟件ProtParam 預(yù)測(cè)牦牛PAFR基因編碼蛋白的理化性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子量為39.637 kD，理論等電點(diǎn)為9.16。含有20種氨基酸，其中含量最高的是Leu（12.0%），含量最低的為Met（1.8%）、Trp（1.8%）。含有帶負(fù)電氨基酸（Asp + Glu）21個(gè)，帶正電氨基酸（Arg+ Lys）33個(gè)。利用在線軟件ProtScale分析牦牛PAFR基因氨基酸序列的親疏水性結(jié)果（圖2）表明，PAFR 氨基酸序列第199、200位Leu、Phe預(yù)測(cè)的分值最高為3.667，其疏水性最強(qiáng)；第160位Lys分值最低為-2.833，其親水性最強(qiáng)。牦牛PAFR基因編碼的整個(gè)氨基酸序列中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此整體表現(xiàn)為親水性。

2.2.2 牦牛PAFR基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析 利用DNAMAN軟件對(duì)牦牛PAFR基因的核苷酸序列與牛、人、藏羚羊、野豬、犬、虎鯨、非洲爪蟾蜍、大鼠、小鼠等物種進(jìn)行同源性對(duì)比，結(jié)果見表2。分析發(fā)現(xiàn)牦牛PAFR氨基酸序列與其它物種的相應(yīng)序列有較高的同源性，其中與黃牛的同源性最高為99.7%；其次是藏羚羊和綿羊，同源性為96.8%；與非洲爪蟾蜍的同源性最低，為59.1%。根據(jù)與其他物種的同源性對(duì)比結(jié)果，使用MEGA 5.1軟件中的最大可能性法（Maximum Likelihood methods）繪制出PAFR基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖3。

2.2.3 牦牛PAFR基因編碼蛋白信號(hào)肽、跨膜區(qū)及結(jié)構(gòu)域分析 利用SignalP軟件對(duì)牦牛PAFR進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示序列中無信號(hào)肽，如圖4。

利用TMHMM軟件對(duì)牦牛PAFR進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果顯示PAFR有5個(gè)跨膜區(qū)，有139個(gè)氨基酸殘基在細(xì)胞外，如圖5，推測(cè)PAFR可能是跨膜蛋白。

利用Interpro軟件預(yù)測(cè)牦牛PAFR蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖6所示，該序列在第32-293位氨基酸之間有G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域，同時(shí)在2-20、39-55、73-89、109-134、149-171、171-188、211-232、247-261、268-280、294-316及317-341位氨基酸之間有血小板活化因子受體（PAFR）家族蛋白功能結(jié)構(gòu)域。

2.2.4 牦牛PAFR基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SOPMA 軟件預(yù)測(cè)牦牛PAFR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖7）表明，該蛋白α-螺旋區(qū)為130個(gè)氨基酸，占38.01%；延伸鏈為85個(gè)氨基酸，占24.85%；β-轉(zhuǎn)角為5 個(gè)氨基酸，占1.46%；無規(guī)卷曲為122個(gè)氨基酸，占35.67%。

利用Swiss Model 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，提交序列至Swiss Model服務(wù)器進(jìn)行自動(dòng)建模，得到其三維結(jié)構(gòu)。如圖8所示，PAFR蛋白為一種結(jié)構(gòu)較松散的球狀蛋白。

2.3 PAFR在妊娠前后牦牛子宮中的表達(dá)

由相對(duì)定量的結(jié)果可知，PAFR基因在妊娠期子宮中的表達(dá)量最高，以妊娠期牦牛子宮△Ct平均值為基準(zhǔn)，其余兩時(shí)期的△Ct平均值分別與妊娠期△Ct平均值作差，即得到△△Ct，其他兩時(shí)期PAFR基因的表達(dá)量相對(duì)于妊娠期PAFR基因的表達(dá)量即為2-△△Ct。從表3、圖9可以看出，牦牛PAFR基因在妊娠期的表達(dá)量，約是在黃體期表達(dá)量的1.6倍，是卵泡期表達(dá)量的2.8倍。

3 討論

血小板活化因子（PAF）能夠廣泛參與排卵、附植、胚胎發(fā)育及妊娠等生殖生理活動(dòng)［15］，因其生物學(xué)活性是通過與其受體（PAFR）特異性結(jié)合從而表達(dá)，因此PAFR基因近年來備受關(guān)注。本試驗(yàn)克隆了牦牛PAFR基因，然后對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對(duì)其在妊娠前后牦牛子宮中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，PAFR基因含有一個(gè)1 029 bp的開放閱讀框，編碼342個(gè)氨基酸。其編碼氨基酸序列經(jīng)推測(cè)有5個(gè)跨膜區(qū)，說明牦牛PAFR蛋白為跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)牦牛PAFR蛋白含有G蛋白偶聯(lián)受體家族結(jié)構(gòu)域，說明其屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，這與Honda等［9］的結(jié)論相符。自1991年Richard等［16］克隆出人PAFR基因，已有10余種物種PAFR基因被克隆出來，本試驗(yàn)通過對(duì)不同物種PAFR氨基酸序列對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)牦牛PAFR氨基酸序列與黃牛PAFR氨基酸同源性最高為99.7%，與其它物種也有較高的同源性，表明PAFR氨基酸在進(jìn)化過程中具有保守性。

O’Neill等［17］認(rèn)為附植前胚胎產(chǎn)生的PAF介導(dǎo)妊娠母體對(duì)胚胎的識(shí)別，引起母體對(duì)妊娠的最初反應(yīng)，以及胚胎附植時(shí)母胎界面伴隨的炎癥可能也和PAF 密切相關(guān)。本試驗(yàn)采用QRT-PCR的方法相對(duì)定量檢測(cè)出PAFR在妊娠前后牦牛子宮中的表達(dá)量，結(jié)果顯示妊娠后子宮內(nèi)的PAFR表達(dá)量明顯高于妊娠前各時(shí)期。揭示PAFR在牦牛妊娠過程中扮演重要作用，這與O’Neill［5］、Angle等［6］在鼠和家兔子宮中的發(fā)現(xiàn)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了PAF對(duì)胚胎附植，維持妊娠起到了重要作用。本試驗(yàn)首次在牦牛子宮中克隆出PAFR，并全面地對(duì)PAFR進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為以后深入研究PAF及PAFR提供了可靠依據(jù)。

4 結(jié)論

牦牛PAFR基因，其開放閱讀框全長(zhǎng)1 029 bp，編碼342個(gè)氨基酸；與黃牛相比氨基酸同源性最高為99.7%，較保守；該蛋白為跨膜蛋白，有親水性，具有G蛋白偶聯(lián)受體家族結(jié)構(gòu)域；在牦牛子宮中PAFR表達(dá)，妊娠期高于妊娠前，說明其與胚胎附植，維持妊娠有關(guān)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Sequence Analysis of Yak PAFR Gene and Expression in Uterus Before and After Pregnancy

Wei Bo Pan Yangyang Yu Yao Tian Feng Yu Sijiu
（College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）

Platelet-activating factor receptor（PAFR）gene were cloned from uterus of domestic yak by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）. The results shows that domestic yak PAFR gene was 1 029 bp in length, encoded predicted mature protein of 342 amino acids, which encoded a hydrophilic protein. Compared with the reference sequence of PCR primer designing homology of the domestic yak PAFR coding sequence was 99.7% at the amino acid level, and also showed high homology of with other species. The PAFR has 5 transmembrane domains, features G protein-coupled receptor domains, no signal peptide. The result of the quantitative Real-time Polymerase chain reaction（QRT-PCR）shows that PAFR was highest expression in gestation and lowest in follicular phase in uterus of domestic yak. That suggested PAFR play an important role in implantation and gestation.

Yak PAFR Gene cloning Bioinformatic analysis Gene expression

2014-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32172616）

魏博，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物生殖生理；E-mail：jl_wb_cloud@163.com

余四九，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物生殖生理；E-mail：sjyu@163.com