冉曉卓 李鈁

（國家海洋局第三海洋研究所 國家海洋局生物遺傳資源重點實驗室，廈門 361005）

對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因的研究進展

冉曉卓 李鈁

（國家海洋局第三海洋研究所 國家海洋局生物遺傳資源重點實驗室，廈門 361005）

對蝦白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原之一。WSSV在侵染宿主細胞的過程中，極早期基因（immediate-early gene）對病毒復制增殖起著非常重要的作用。在這個過程中，一方面極早期基因編碼的蛋白通過與細胞調控因子相互作用，調節(jié)細胞信號通路，為病毒的增殖提供更合適的環(huán)境；另一方面，極早期蛋白直接調控病毒基因的轉錄和表達。綜述列舉了WSSV的21個極早期基因，并將重點介紹其中5個研究比較深入的基因：ie1、wsv051、wsv083、wsv249和wsv403。

WSSV極早期基因 ie1 wsv051 wsv083 wsv249 wsv403

對蝦白斑綜合癥病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是對蝦的主要病原之一，具有極強的感染力和致死性［1］。自從1992年WSSV第一次被科學家檢測出，WSSV已經傳播至世界各地，對對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了極大的危害［2］。現(xiàn)有的研究結果表明，WSSV是雙鏈環(huán)狀DNA病毒，隸屬于線性病毒科（Nimaviridae），白斑病毒屬（Whispovirus）［3］。對于雙鏈DNA病毒而言，其基因組的表達呈時序性，可分為極早期（Immediate-early），早期（Early）和晚期（Late）。在病毒感染的極早期，沒有病毒DNA復制，沒有新病毒蛋白合成的情況下，少數(shù)病毒基因可以被宿主細胞內的“轉錄機器”啟動，并利用宿主細胞RNA聚合酶II進行轉錄。這些基因的表達依賴于宿主細胞的轉錄翻譯系統(tǒng)，并且不需要新病毒蛋白的合成，被定義為病毒極早期基因（Immediate-early gene）。極早期基因編碼的蛋白，即極早期蛋白，通常是一些調控因子，在病毒的復制過程中對病毒自身和宿主細胞起著非常重要的調控作用。一方面極早期蛋白參與調控病毒早期基因和晚期基因的表達；另一方面，極早期蛋白可以與宿主細胞內的調控因子相互作用，調控宿主細胞的生理狀態(tài)或者幫助病毒躲避宿主免疫系統(tǒng)的識別和清除，從而為病毒增殖創(chuàng)造合適的環(huán)境。例如，皰疹病毒HSV-1極早期蛋白ICP0（Infected-cell protein 0）既可以激活病毒下游基因的表達，也可以與宿主細胞ND10（Nuclear domain 10）結合，破壞ND10的結構，引導細胞內蛋白的降解，干擾宿主的免疫反應［4］。由此可見，極早期蛋白在病毒增殖過程中起著至關重要的作用。

通常實驗室中采用抑制細胞內蛋白質合成的方法來篩選病毒的極早期基因。放線菌酮（Cycloheximide，CHX）是一種可以干擾蛋白質合成中的延長步驟而有效地抑制細胞內蛋白合成的化合物。實驗中通常將細胞用CHX處理一段時間，阻斷新蛋白合成，然后進行病毒感染。病毒極早期基因可以利用已經存在的宿主細胞轉錄因子及RNA聚合酶II進行轉錄，所以其轉錄不會受到CHX處理的影響。而病毒其他基因的轉錄由于需要病毒極早期蛋白的調控，因此會受到CHX的抑制。利用這個原理，2005年，中國臺灣研究人員Liu等［5］第一次用基因芯片技術結合RT-PCR，篩選并鑒定出3個WSSV極早期基因，并將它們命名為ie1、ie2和ie3。2009年，李鈁等［6］也利用這種方法鑒定出了16個極早期基因，包括wsv051、wsv069（ie1）、wsv078、wsv079、wsv080、wsv083、wsv091、wsv094、wsv098、wsv099、wsv100、wsv101、wsv103、wsv108、wsv178和wsv249。2011年，林梵宇等［7］使用EGFP作為報告基因檢測啟動子活性，結合CHX處理實驗再次鑒定出wsv056、wsv403和wsv465三個WSSV極早期基因。到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的WSSV的極早期基因已經達到21個，如表1所示。

盡管對WSSV的研究有了很大的進展，但是人類對WSSV極早期基因的了解仍然有限。目前對WSSV極早期基因的研究主要分為兩個方面，一是對于極早期基因轉錄調控的研究，還有一方面是對極早期蛋白功能的研究。研究的比較多的是WSSV極早期基因ie1、wsv051、wsv083、wsv249和wsv403。

1 對極早期基因iel、wsv051、wsv083、wsv-249和wsv403的相關研究

1.1 對極早期基因ie1的相關研究

ie1是目前研究得最深入的WSSV極早期基因。在病毒入侵宿主細胞的過程中，細胞內的抗病毒機制被激活。在這樣的條件下，WSSV極早期基因ie1由于自身的一些特殊結構，能選擇性的利用各種調節(jié)因子增強自身的表達。同時，ie1編碼的極早期蛋白可以通過與其他轉錄因子相互作用來調節(jié)細胞功能。

1.1.1 對WSSV極早期基因ie1轉錄調控的研究 WSSV極早期基因ie1的啟動子具有很強的啟動子活性。這種強啟動子活性不光存在于宿主細胞內，還存在于非宿主細胞內（sf-9細胞）。曾經有研究者把ie1的啟動子活性和CMV（Cytomegalovirus immediate-early）啟動子進行過比較發(fā)現(xiàn)，在sf-9細胞中，ie1的啟動子活性比CMV還要強［14］。這種強啟動子活性主要存在于從-92到-74的這一段序列。如果這一段序列發(fā)生缺失或者突變，那么啟動子的活性喪失。ie1的啟動子上存在著一系列的轉錄因子結合位點，ie1啟動子通過與細胞轉錄因子的作用來增強IE1的表達。

1.1.1.1ie1利用信號轉導因子和轉錄激活因子（Signal transducer and activator of transcription，STAT）增強自身的轉錄 在宿主細胞中，STAT在宿主抵抗病毒侵染的過程中起著很重要的作用。STAT蛋白中與其功能密切相關的結構包括它的蛋白結合區(qū)域，DNA結合區(qū)域，SH結合區(qū)域和一個C端Tyr殘基。當STAT的Tyr殘基被磷酸化的時候，STAT被運送到細胞核中，與相關DNA結合，激活下游基因的轉錄［15］。在這個過程中，JAK-STAT通路（通常認為與細胞內抗病毒機制有關）會被激活，引起氧化應激反應［16］。當WSSV侵入宿主細胞時，STAT本身被活化定位到細胞核中，結合到ie1啟動子上STAT結合區(qū)域，即從-84到-64的這段序列（ATTCCTAGAAA），直接增強IE1的表達［17］。但是這個結合的過程并不破壞STAT的結構，STAT仍然保持原有的活性，能夠激活JAK-STAT通路［18］。上述研究表明，極早期基因ie1可以利用宿主細胞的JAK-STAT通路來增強自身表達。

1.1.1.2ie1利用PHB2增強自身轉錄 PHB2（Prohibitin 2）蛋白既可以存在于線粒體內，也可以存在于細胞核內。在脊椎動物細胞中它可以作為共作用因子通過與其他轉錄因子的相互作用來調節(jié)下游基因的轉錄活性［19］。研究表明，在對蝦細胞中，PHB2的C端存在一個DNA結合位點（Helix-turnhelix domain，HTH domain），因此它還可以作為轉錄因子直接結合到ie1啟動子上調節(jié)基因轉錄。ie1啟動子的-78到-66這一段序列可以與PHB2的HTH domain結合，增強IE1的表達［20］。

1.1.1.3ie1利用NF-κB增強自身轉錄 IKKβ（IκB kinase β）和IKKε（IκB kinase ε）是NF-κB（Nuclear factor κB）通路最關鍵的調控因子。NF-κB通路的活化涉及到一系列的磷酸化和泛素化反應，釋放出炎癥因子，召集相關的免疫細胞來清除入侵的病原體。IKKβ通過調節(jié)IκBα（Inhibitor of NF-κBα）的磷酸化，開啟NF-κB通路。IKKε 則是通過調節(jié)細胞內的AMP（Antimicrobial peptide genes）表達，開啟NF-κB通路［21］。IKKβ和IKKε的過表達都會導致NF-κB通路的活化。研究表明WSSV可以利用IKKNF-κB信號通路來促進病毒基因的轉錄，其中包括了極早期基因ie1、wsv051和wsv083［22］。體外實驗已證實對蝦的NF-κB同源蛋白LvRelish可以直接結合到ie1啟動子上，激活ie1轉錄［23］。

1.1.2 對極早期基因ie1編碼的蛋白的研究 WSSV極早期蛋白IE1是由極早期基因ie1編碼的蛋白，全長224個氨基酸。在IE1上面存在著多個蛋白結合位點和DNA結合位點。在C端有DNA結合位點和硫氧化還原蛋白（Thioredoxin，Trx）結合位點，在靠近N段的位置有TATA box結合蛋白（TATA-binding protein，TBP）和成視網膜瘤蛋白（Retinoblastoma protein，RB）結合位點。IE1可以通過與細胞轉錄因子結合，參與調節(jié)細胞內各種生化反應。

1.1.2.1 IE1具有轉錄因子的特性 很多病毒極早期基因可以編碼轉錄調節(jié)因子來調節(jié)下游基因的表達。轉錄因子通常具有以下功能結構域：DNA結合結構域（DNA binding domain，DBD）和轉錄激活結構域（Transactivation domain，TAD）。DBD可以使轉錄激活因子結合到目標序列上，TAD可以和轉錄機器相互作用促進目標基因的轉錄。研究表明，IE1同時具有轉錄激活和DNA結合的能力，其轉錄激活結構域存在于蛋白質C端前80個氨基酸中，而DNA結合結構域位于C端第81個氨基酸到第224個氨基酸之間。此外當IE1與DNA結合時，IE1可以自身發(fā)生相互作用，形成二聚體［24］。因此IE1可能以同源二聚體形式發(fā)揮轉錄調節(jié)的作用。

1.1.2.2 IE1與對蝦TATA box結合蛋白PmTBP結合促進病毒基因的表達 在真核細胞中，轉錄因子TFⅡD（Transcription factorⅡD）對于DNA的轉錄是必須的。TFⅡD由一個TATA box結合蛋白（TATA-binding protein，TBP）和TBP相關因子（ TATA-binding protein associated factors，TAFs）組成［25］。根據現(xiàn)有的研究表明，很多病毒極早期蛋白，如腺病毒的E1A（A viral oncoprotein of adenvirus）和皰疹病毒的Zta（A viral transcription factor of EBV）都是通過與TBP的結合來促進自身的轉錄［26，27］。WSSV 極早期蛋白IE1也可以與對蝦TATA-box結合蛋白（Penaeus monodonTATA box-binding protein，PmTBP）結合。IE1的81-180位氨基酸可以分別與PmTBP的171-230位和111-300位氨基酸發(fā)生相互作用。RNA干擾實驗證明，這種結合促進了病毒早期基因DNA polymerase gene的表達，因此IE1和PmTBP的相互作用能夠影響病毒在宿主細胞內的增殖［8］。

1.1.2.3 IE1可以與成視網膜瘤蛋白結合調節(jié)細胞周期 成視網膜瘤蛋白（Retinoblastoma protein，RB）是調控細胞周期的關鍵蛋白，RB與E2F轉錄因子的相互作用可以調控細胞周期從G0/G1期進入S期。當RB與E2F結合形成蛋白復合體時，E2F的活性被抑制；當RB與某些調控蛋白結合后，RB-E2F復合體解離，釋放出E2F蛋白，使之能夠結合到靶基因的啟動子上，啟動下游基因的轉錄［28］。E2F調控的下游蛋白通常與細胞周期調控有關，包括 DNA polymerase subunitⅡ、PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）、Thymidilate synthetase，cdc2、cyclin E、UNG（Uracil-N-glycosylase）、BRCA1（Breast cancer 1）、MCM2（Minichromosome maintenance protein 2）和MCM6（Minichromosome maintenance protein 6）［29］。這些蛋白的表達會促使細胞從G0/G1期進入S期。對WSSV的研究表明，IE1蛋白可以通過其C末端的“LxCxE”結構域與RB結合；這種相互作用導致RB-E2F復合體的解離，使E2F活化?；罨腅2F調節(jié)下游基因的表達，從而導致宿主細胞從G0/G1期進入S期［9］。

1.1.2.4 硫氧化還原蛋白可以修復IE1結合DNA的能力 硫氧化還原蛋白（Thioredoxin，Trx）是一個12 kD大小的蛋白，其主要的功能是氧化還原。實驗證明，在WSSV感染細胞48 h后，細胞內谷胱甘肽含量明顯下降，細胞內產生大量的活性氧，IE1遇到活性氧被氧化，喪失了結合DNA的能力。被氧化的IE1可以與Trx結合，結合的位點是在62位的Cys。IE1通過與Trx的結合可以修復IE1結合DNA的能力，恢復其原有的功能，有利于病毒的增殖［30］。

1.2 對極早期基因wsv051的相關研究

極早期基因wsv051經過轉錄翻譯后產生極早期蛋白WSV051。WSV051是一個由196個氨基酸組成的蛋白，科學家推測其可能是一個轉錄因子。WSV051蛋白中存在兩個小泛素相關修飾（Small ubiquitin-like modification，SUMOylation）位點。小泛素相關修飾是一種翻譯后蛋白共價修飾，對蛋白功能起著微調的作用。E2結合酶UBC9（SUMO ubiquitin-conjugating enzyme 9 ）是小泛素相關修飾過程中最重要的蛋白分子［31］。在該過程中，活化E1激活酶后，小泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-like modifier，SUMO）小分子轉移到UBC9的第93位Cys，然后SUMO從UBC9傳遞到底物上［32］。很多病毒極早期蛋白，如皰疹病毒極早期蛋白IE2，通過參與SUMO化，調節(jié)細胞內活動［33］。在WSSV侵染的過程中，極早期蛋白WSV051被UBC9調節(jié)的SUMO化作用修飾，這一修飾可以避免該蛋白被細胞內的泛素化途徑降解。RNA干擾結果證明如果UBC9或者SUMO的表達受到抑制，則WSSV早期和晚期基因的表達也會受到抑制。根據這個結果科學家推測WSV051通過SUMO化修飾延長自身在細胞中的半衰期，進而可能促進病毒早期和晚期基因的表達，有利于WSSV在宿主細胞內的增殖［10］。

1.3 對極早期基因wsv083的相關研究

1.3.1 對極早期基因wsv083轉錄調控的研究wsv-083的啟動子含有一段TGACGT（G/C）A的序列，可以與對蝦的XBP（X-box binding protein 1）蛋白結合啟動下游基因的轉錄。內質網是細胞內負責蛋白的折疊以及蛋白的修飾的細胞器。當病毒入侵宿主細胞的時候，在內質網中會產生大量無法正常折疊的蛋白，這種由外部干擾因素導致內質網功能失常的現(xiàn)象，稱為內質網壓力（ER-stress）［34］。真核生物細胞中存在一套完整的非折疊蛋白反應機制（Unfolded protein response，UPR）來應對內質網壓力。UPR涉及3個信號轉導途徑：（1）IRE1-XBP1通路（Inositol-requiring 1/X box binding protein 1 pathway）；（2）PERK-eIF-2α通路（Double-stranded RNA-activated protein kinase（PER）-like endoplasmic reticulum kinase/Eukaryotic initiation factor 2α pathway）；（3）ATF6通 路（Activating transcription factor 6 pathway）［34，35］。UPR通過減少蛋白的翻譯、增加分子伴侶表達，促進錯誤折疊的蛋白降解［36］等途徑來減少細胞內非正確折疊的蛋白的含量，保持細胞活力。實驗證明，在WSSV侵染宿主細胞的過程中，LvXBP是對蝦細胞內最主要的UPR通路調控因子。LvXBP含有一個BRLZ功能結構域，可以促進極早期基因wsv083的轉錄。因此，WSSV可能通過調節(jié)UPR通路，選擇性的使用UBP轉錄因子來增強自身基因的表達［37］。

1.3.2 對極早期基因wsv083編碼的蛋白的研究 WSV083是一個由581個氨基酸組成的蛋白，含有Ser/Thr磷酸化激酶功能結構域。實驗表明WSV083可以通過抑制Tyr的磷酸化，降低FAK的活性。由于FAK是一種與細胞黏附性有關的蛋白，F(xiàn)AK活性的降低會導致細胞黏附性的下降。而無脊椎動物細胞的黏附性在免疫機制中起著重要的作用。因此，WSV083對FAK通路的調控可能使病毒更加容易攻擊宿主免疫系統(tǒng)［11］。

1.4 對極早期基因wsv249的相關研究

極早期基因wsv249經過轉錄翻譯后產生極早期蛋白WSV249。WSV249是一個由783個氨基酸組成的蛋白。通常在真核細胞中，依賴泛素的蛋白水解是用來調控蛋白豐度，從而在細胞周期，信號轉導，轉錄調控，DNA修復和炎癥反應等過程中起到調節(jié)作用［38］。在泛素化過程中，通常會有3種酶參與作用，它們分別是泛素活化酶E1（Ubiqutin-activating enzyme），泛素結合酶E2（Ubiqutin-conjugating enzyme）和泛素連接酶E3（Ubiqutin-ligase enzyme）［38］。通常E3連接酶都是含有環(huán)指結構（Ring finger）的蛋白，而環(huán)指結構又分為兩大類RING-HC和RING-H2［39，40］。WSV249含有RING-H2結構域，可以與PvUbc（Ubc homology inPenaeus vannamei）結合，使底物泛素化，因此是一種泛素連接酶［12］。許多病毒能夠直接利用細胞內的泛素化途徑降解細胞內蛋白，從而有利于自身的增殖［41］。因此WSV249可能在WSSV感染中起到類似的作用。

1.5 對極早期基因wsv403的相關研究

極早期基因wsv403經過轉錄翻譯后產生極早期蛋白WSV403。WSV403是一個由641個氨基酸組成的蛋白，包含了一個RING-H2環(huán)指結構，也是一種E3泛素化連接酶，可以被E2泛素結合酶活化。實驗表明wsv403是一種與病毒潛伏期有關的基因，該基因在潛伏期和復制期皆有表達，而且隨著復制感染的進程表達量逐漸提高。鑒于WSV403可以和對蝦細胞內蛋白磷酸酶（Protein phosphatase，PPs）結合，研究者推測WSV403的表達有可能通過影響細胞內蛋白的磷酸化水平來對病毒潛伏期-復制期的轉換進行調控［13］。

2 對WSSV極早期基因啟動子的研究

目前，除了對WSSV極早期基因轉錄調控和結構功能有所研究外，對極早期基因啟動子活性的研究也有一定的進展。正如前面提到的在2008年就有研究者把ie1的啟動子活性和CMV進行比較發(fā)現(xiàn)ie1的啟動子活性在某些細胞內比CMV強［14］。在2011年，林梵宇等［7］采用EGFP作為報告基因篩選極早期基因發(fā)現(xiàn)，wsv056、wsv403和wsv465的啟動子可以直接被細胞內轉錄因子激活。隨后在2013年，他們對現(xiàn)有極早期基因的啟動子做了詳細的分析，使用EGFP作為報告基因結合流式分析技術，通過構建突變體找出這些啟動子的核心區(qū)域。在這篇報告中，他們確定了8個核心功能區(qū)域，其中cyclic AMP respnse element（CRE），即TGACGTCA這一段序列，在這些調控區(qū)中出現(xiàn)頻率很高。如果CRE功能結構域發(fā)生突變，wsv403和wsv465的啟動子活性就會喪失。這說明CRE元件在極早期基因轉錄上有著重要的作用［42］。

3 結語

經過20多年的研究，人們對WSSV的形態(tài)結構、基因組、結構蛋白組組成等方面有了較深入的認識，但是對WSSV感染調控機制的研究還處于起步階段。極早期蛋白是DNA病毒中最主要的一類調控因子，現(xiàn)有研究結果表明，一些WSSV極早期蛋白能夠與細胞內的調控因子相互作用，調節(jié)細胞的生理生化過程，為病毒的增殖創(chuàng)造良好的環(huán)境。此外，WSSV極早期基因可以選擇性的利用細胞內的轉錄因子增強自身的轉錄。鑒于極早期蛋白是病毒增殖過程中一類重要調控因子，對WSSV極早期基因功能的深入研究有助于揭示WSSV的感染機制，并能夠為抗病毒藥物的設計奠定理論基礎，為WSSV的防治，減少對蝦養(yǎng)殖產業(yè)造成損失作出貢獻。

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（責任編輯 狄艷紅）

A Review of Development in WSSV Immediate-early Gene Research

Ran Xiaozhuo Li Fang
（Third Institute of Oceanography，Key Laboratory of Marine Genetic Resourse，State Ocean Administration，Xiamen 361005）

White spot syndrome virus is one of the main pathogens which causes great damage to the shrimp aquaculture. During the infection, WSSV immediate-early genes（IE genes）utilize the host cell transcription regulators to increase their own transcription. Regulatory proteins encoded by IE genes are critical for the virus life cycle. The IE proteins may either regulate the expression of viral genes, or interact with regulators in the host cells to create a proper environment for viral replication. Here we reviewed the recent progress in WSSV IE gene research and especially focused on five most-studied WSSV immediate-early genes：ie1, wsv051, wsv083, wsv249 and wsv403. The function of IE proteins and the transcription regulation of their genes were discussed.

WSSV immediate-early genes ie1 wsv051 wsv083 wsv249 wsv403

2013-12-26

國家自然科學基金資助項目（41276176）

冉曉卓，男，碩士研究生，研究方向：對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因；E-mail：absolut21@126.com

李鈁，女，副研究員，研究方向：對蝦白斑綜合癥病毒極早期基因；E-mail：lifang@tio.org.cn