李思熳，余果宇，申吉泓，翟國(guó)敏，高振華

0 引言

滌綸補(bǔ)片是常用的生物體內(nèi)修復(fù)材料，植入人體后可吸附血漿蛋白，主要為纖維連接蛋白、球蛋白、纖維蛋白原和清蛋白，而有利于細(xì)菌的黏附易造成以生物材料為中心的感染［1-2］，而一旦產(chǎn)生細(xì)菌性生物膜，一般的抗菌治療難以奏效［3］，因此如何防止生物膜的產(chǎn)生，是解決人工植入物感染的關(guān)鍵問題?？咕?antibacterial peptides)是生物體在抵抗病原微生物的防御反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一類具有抗微生物活性的小分子多肽［4］。文獻(xiàn)報(bào)道曾使用高速原子力顯微鏡拍攝抗菌肽作用于大腸桿菌(E.coli)的即時(shí)動(dòng)態(tài)影像發(fā)現(xiàn)，存活的E.coli全部被抗菌肽殺死［5］。蛇毒來源的內(nèi)源性抗菌多肽類物質(zhì)(Cathelicidin)對(duì)許多臨床耐藥微生物顯示了極強(qiáng)的體外抗菌活性，并具有極低的細(xì)胞毒性以及溶血活性(＞400 μg/mL)，同時(shí)，在高的鹽濃度(1%NaCl)以及血漿存在下也保持其抗菌活性，顯示了較高的臨床應(yīng)用前景［6］。近年來也有用非人源性抗菌肽處理導(dǎo)尿管抑制生物膜的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的報(bào)道［7］，但用蛇毒來源的Cathelicidin處理人工植入物滌綸補(bǔ)片來抑制生物膜的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選用大腸埃希菌和人工植入物滌綸補(bǔ)片來建立家兔感染模型，并用幾丁糖凝膠作為生物涂層，利用眼鏡王蛇蛇毒來源的Cathelicidin(抗菌肽OH-CATH)及目前臨床常用藥物頭孢哌酮舒巴坦進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以探討蛇毒OH-CATH抗菌肽應(yīng)用于人工植入物涂層是否有抑菌效果，其對(duì)生物膜是否有抑制作用，并通過測(cè)定感染組織的細(xì)胞因子，來探討局部感染是否引發(fā)免疫調(diào)節(jié)作用來實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 菌液制備將液氮保存的E.coli ATCC25922菌株(菌種來自中科院昆明動(dòng)物所細(xì)胞庫)接種于LB培養(yǎng)基后37℃過夜培養(yǎng)，次日將菌液接種于肉湯平板37℃過夜培養(yǎng)獲得E.coli菌落，取單個(gè)E.coli菌落接種于LB培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)后獲得E.coli ATCC25922純種菌液。

1.2 蛇毒抗菌肽OH-CATH的制備蛇毒抗菌肽OH-CATH結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成熟抗菌肽由30個(gè)氨基酸殘基組成，無二硫鍵，由吉爾生化(上海)有限公司合成，氨基酸序列為:KFFKKLKNSVKKRAKKFFKKPRVIGVSIPF，純度＞95%。實(shí)驗(yàn)所用樣品由中國(guó)科學(xué)院“動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“生物毒素與人類疾病”學(xué)科組提供。

1.3 兔滌綸補(bǔ)片感染模型制備

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組取雄性成年新西蘭實(shí)驗(yàn)白兔24只，體重(2.5±0.2)kg，采用簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法分為4組，每組6只標(biāo)記為1、2、3、4、5、6。預(yù)處理滌綸補(bǔ)片，將滌綸補(bǔ)片修剪成大小為1cm×1cm的24塊方塊，利用浸涂法進(jìn)行處理，空白對(duì)照組(A組)滌綸補(bǔ)片無浸涂，幾丁糖組(B組)滌綸補(bǔ)片浸涂幾丁糖凝膠(中國(guó)石家莊億生堂醫(yī)用品有限公司)，頭孢哌酮+幾丁糖組(C組)滌綸補(bǔ)片浸涂10 mg/mL頭孢哌酮幾丁糖凝膠，OH-CATH抗菌肽+幾丁糖組(D組)滌綸補(bǔ)片浸涂0.2 mg/mL蛇毒OH-CATH抗菌肽幾丁糖凝膠。每次浸涂均為10 s，快速取出，保證浸涂量一致，將4組滌綸補(bǔ)片70℃固化1 h。

1.3.2 滌綸補(bǔ)片的兔模型嚴(yán)格按照無菌操作，在每只兔背部取4個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)間距大于5cm，每點(diǎn)皮下切一大小約1 cm×1 cm的袋裝腔隙，將4種處理(A、B、C和D組)后的滌綸補(bǔ)片分別植入對(duì)應(yīng)4組白兔的皮下，然后向腔隙內(nèi)注入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期E.coli ATCC25922 1 mL(約100 cfu)，縫合切口回籠飼養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 細(xì)菌檢測(cè)及掃描電鏡觀察生物膜于第7天無菌取出兔模型滌綸補(bǔ)片和該部位皮下組織約1g。將取出的每塊滌綸補(bǔ)片均分為2塊，一塊(1.0cm×0.5cm)置入1mL LB液中洗滌后將洗滌液37℃培養(yǎng)16h，測(cè)定其吸光度(A)值，然后將滌綸補(bǔ)片置入1 mL LB液中超聲振蕩1 min，取100 μL振蕩液接種于76 mm培養(yǎng)板37℃過夜培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù);另一塊經(jīng)戊二醛固定后行掃描電鏡觀察生物膜的形成情況。

1.4.2 組織學(xué)觀察及細(xì)胞因子測(cè)定取一半皮下組織(0.5 g)經(jīng)4%甲醛固定后行HE染色病理檢查。另一半勻漿處理后4℃1500r/min離心15 min，離心半徑13.5 cm，取上清液行白細(xì)胞介素(influence，IL)-6、IL-10、IL-1α、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，分別對(duì)應(yīng)加100 μL的樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，2 h后每孔加檢測(cè)溶液A工作液100 μL(稀釋2倍)，1 h后洗板，每孔加檢測(cè)溶液B工作液(稀釋2倍)100 μL，1 h后洗板，每孔加底物溶液90 μL避光顯色后每孔加終止溶液50 μL，測(cè)各孔A值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 16軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量檢測(cè)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較視方差齊性檢驗(yàn)(以0.1作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行Levene檢驗(yàn))結(jié)果進(jìn)行不同的選擇，當(dāng)方差齊時(shí)，選擇LSD檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，選擇Tamhane′s T2檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌檢測(cè)①A值:滌綸補(bǔ)片第1遍洗滌液細(xì)菌培養(yǎng)，測(cè)定吸光度600 nm的A值，以檢測(cè)滌綸補(bǔ)片上的懸浮細(xì)菌數(shù)量。A組與B、C和D組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B組與C和D組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，D組與C組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。②細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù):A組與B組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與C組和D組比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。B組與C組和D組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。C組與D組無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖1。

表1 滌綸補(bǔ)片洗滌液細(xì)菌培養(yǎng)A值(x±s)Table 1 Optical density of the bacterial cultures prepared from polyester patch elutions(x±s)

圖1 滌綸補(bǔ)片振蕩液細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)(n=4)Figure 1 Results of bacterial cultures prepared from polyester patch oscillating solution(n=4)

圖2 各組滌綸補(bǔ)片掃描電鏡結(jié)果Figure 2 SEM images of the polyester patches in different groups

圖3 各組皮下組織HE染色病理圖片F(xiàn)igure 3 H＆E images of the subcutaneous tissues obtained from the various polyester patches in different groups

2.2 滌綸補(bǔ)片掃描電鏡結(jié)果A組:滌綸補(bǔ)片表面覆蓋大量的生物膜結(jié)構(gòu)，紋理不清，可見典型的E.coli附著及炎性分泌物，見圖2a。B組:滌綸補(bǔ)片表面覆蓋大量的生物膜結(jié)構(gòu)，紋理不清，可見典型的E.coli附著、炎性分泌物和幾丁糖凝膠，見圖2b。C組:滌綸補(bǔ)片表面覆蓋較多的生物膜結(jié)構(gòu)，紋理稍清晰，見不典型的E.coli附著、較多炎性分泌物和幾丁糖凝膠，見圖2c。D組:滌綸補(bǔ)片表面覆蓋的生物膜結(jié)構(gòu)較少，滌綸補(bǔ)片的紋理清晰，未見典型及不典型的E.coli附著，可見紅細(xì)胞等組織細(xì)胞，炎性分泌物較少，可見幾丁糖凝膠，見圖2d。

2.3 皮下組織HE染色病理檢查結(jié)果A組:HE染色可見皮下局部組織壞死、大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖3a;B組:HE染色可見皮下組織明顯壞死、大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖3b;C組:HE染色可見皮下組織壞死不明顯，較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖3c;D組:HE染色可見皮下組織無明顯壞死，較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖3d。

2.4 兔皮下組織細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果①TNF-α:C組顯著性降低(P＜0.05)。D組顯著性升高(P＜0.05)。A組和B組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。②IL-1α:D組較其他3組顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③IL-6:均未檢出。④IL-10:C組顯著低于B組和D組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，A組、B組和D組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 各組兔皮下組織細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果(x±s，pg/mL)Table 2 Results of cytokine determination in the subcutaneous tissue of different groups of rabbits(x±s，pg/mL)

3 討論

生物膜危害大、治療困難使其成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，目前很多阻止生物膜形成的方法如縮短人工植入物的留置時(shí)間、改變植入物的表面結(jié)構(gòu)、抗生素預(yù)處理植入物等均未達(dá)到效果，反而增加了感染的概率和耐藥菌株的產(chǎn)生，甚至還導(dǎo)致真菌感染和嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)［8-11］。在我們的實(shí)驗(yàn)中，使用幾丁糖凝膠與蛇毒OH-CATH抗菌肽制成人工植入物的表面涂層應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，達(dá)到了良好的效果。

測(cè)定滌綸補(bǔ)片洗液的A值和培養(yǎng)振蕩液發(fā)現(xiàn)，以空白對(duì)照組補(bǔ)片上的菌落數(shù)和生物膜數(shù)量最多，而OH-CATH抗菌肽+幾丁糖組的菌落數(shù)和生物膜數(shù)量最少。在滌綸補(bǔ)片的電鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，OH-CATH抗菌肽和頭孢哌酮+幾丁糖組補(bǔ)片上生物膜結(jié)構(gòu)少，而且OH-CATH抗菌肽組的抑菌效果更明顯，而空白對(duì)照組形成了厚厚的生物膜結(jié)構(gòu)且有E.coli的存在。對(duì)皮下組織的病理檢查進(jìn)一步驗(yàn)證了OH-CATH抗菌肽和頭孢哌酮+幾丁糖組的感染程度明顯輕于空白對(duì)照組?？梢姂?yīng)用抗生素頭孢哌酮和蛇毒OH-CATH抗菌肽預(yù)處理滌綸補(bǔ)片均達(dá)到了控制感染和預(yù)防生物膜形成的作用，但蛇毒OH-CATH抗菌肽的效果更明顯。

蛇毒OH-CATH抗菌肽的抗菌機(jī)制與頭孢菌素類抗生素不同，OH-CATH以其帶正電的氨基酸殘基附著到帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁，隨之疏水結(jié)構(gòu)域插入質(zhì)膜中，當(dāng)OH-CATH達(dá)到一定濃度后聚集，以形成孔道或膜內(nèi)分子間相的移位來破壞細(xì)菌細(xì)胞膜最終導(dǎo)致死亡［12-14］。OH-CATH有良好抗菌效果、可預(yù)防生物膜形成及不易產(chǎn)生耐藥性等性能與其特殊的抗菌機(jī)制有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)感染模型細(xì)胞因子的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，OH-CATH抗菌肽+幾丁糖組組TNF-α的表達(dá)在4組中顯著升高(P＜0.05)，可能是隨著感染的出現(xiàn)而引發(fā)的保護(hù)性免疫。而頭孢哌酮+幾丁糖組的IL-10表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，而IL-10可以反映感染程度。IL-6在4組中均未檢出，可能的原因是兔皮下組織中其含量在檢測(cè)范圍以下，或者由于其表達(dá)本身的下調(diào)。IL-1α的含量OH-CATH抗菌肽+幾丁糖組顯著高于其他3組(P＜0.05)?？梢娚叨綩H-CATH抗菌肽處理的滌綸補(bǔ)片置入兔體內(nèi)后，引發(fā)了較強(qiáng)的保護(hù)性免疫，促進(jìn)了TNF-α、IL-1α的升高使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受到保護(hù)。頭孢哌酮因其強(qiáng)大的殺菌效能，局部感染減輕較早，使反映感染程度的IL-10水平也隨之下降。

通過兔滌綸補(bǔ)片感染模型的實(shí)驗(yàn)，我們首次成功利用幾丁糖凝膠與抗生素頭孢哌酮或蛇毒OH-CATH抗菌肽制成人工植入物的表面涂層應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，起到了控制感染和抑制了人工植入物表面生物膜的形成的作用，同時(shí)也調(diào)節(jié)感染局部的免疫狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)作用，為將來蛇毒cathelicidin抗菌肽的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

［1］林興，黃云超，楊達(dá)寬，等.SspA對(duì)生物材料細(xì)菌黏附及生物膜形成的影響［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè)，2005，28(5):290-294.

［2］劉正武，何曉，陳進(jìn).心臟滌綸補(bǔ)片在髁突骨折治療中的應(yīng)用體會(huì)［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2012，34(6):803-804.

［3］Lasa I，Del Pozo JL，Penadés JR，et al.Bacterial biofilms and infection［J］.An Sist Sanit Navar，2005，28(2):163-175.

［4］周繼章.抗菌肽抗病的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39(7):204-208.

［5］Georg EF，Roberto JB，David SG，et al.Kinetics of antimicrobial peptide activity measured on individual bacterial cells using highspeed at omic force microscopy［J］.Nature Nanotechnology，2010，5(4):280-285.

［6］Zhao H，Gan TX，Liu XD，et al.Identification and characterization of novel reptile cathelicidins from elapid snakes［J］.Peptides，2008，29(10):1685-1691.

［7］Giacometti A，Cirioni O，Ghiselli R，et al.Distinctin improves the efficacies of glycopeptides and betalactams against staphylococcal biofilm in an experimental model of central venous catheter infection［J］.J Biomed Mater Res A，2007，81(1):233-239.

［8］Ha US，Cho YH.Catheter-associated urinary tract infections:new aspects of novel urinary catheters［J］.Int J Antimicrob Agents，2006，28(6):485-490.

［9］Costerton W，Veeh R，Shirtliff M，et al.The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections［J］.J Clin Invest，2003，112(10):1466-1477.

［10］徐敏，徐榕，張優(yōu)琴，等.留置導(dǎo)尿管與醫(yī)院泌尿系感染的關(guān)系［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2001，11(5):368-369.

［11］施德仕，邵海楓.細(xì)菌生物膜感染的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2011，24(12):1319-1323.

［12］Cirioni O，Giacometti A，Ghiselli R，et al.RNAIII-inhibiting peptide significantly reduces bacterial load and enhances the effect of antibiotics in the treatment of central venous catheter-associated Staphylococcus aureus infections［J］.J Infect Dis，2006，193(2):180-186.

［13］Oren Z，Shai Y.Seleetive lysis of baeteria but not mammalian cells by diastereomers of melittin:structure-function study［J］.Biochemistry，1997，36(7):1826-1835.

［14］閆軼潔，馮占雨.抗菌肽生物活性及其致細(xì)胞死亡作用的高度選擇性［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38(6):222-224.