余華星 李代禧 胥 義 劉 立 翟 振 張 燕

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093)

在對(duì)關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行低溫保存時(shí)，常常會(huì)觀察到低溫?cái)嗔熏F(xiàn)象[1-3]，然而其生物力學(xué)性能的低溫?fù)p傷機(jī)理至今仍不甚明確[4]。從現(xiàn)有文獻(xiàn)來(lái)看，有關(guān)細(xì)胞低溫保存凍結(jié)損傷影響機(jī)制的研究，主要集中在懸浮細(xì)胞領(lǐng)域，研究方法比較成熟。對(duì)于懸浮細(xì)胞，由于在冰晶生成時(shí)，細(xì)胞可以自由移動(dòng)[5]，胞外冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷程度比對(duì)粘附細(xì)胞的損傷小，此時(shí)胞內(nèi)冰對(duì)細(xì)胞的損傷起主導(dǎo)作用。然而黏附細(xì)胞(包括組織內(nèi)的細(xì)胞)是固定的，生成的冰晶與其剛性接觸產(chǎn)生擠壓、剪切作用較大，其受到胞外冰機(jī)械損傷增加，甚至更為嚴(yán)重[6]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)主導(dǎo)了軟骨細(xì)胞的生物力學(xué)特性，軟骨細(xì)胞的外基質(zhì)生物力學(xué)特性的改變可能會(huì)改變軟骨細(xì)胞的應(yīng)力，應(yīng)變環(huán)境[7]。關(guān)于胞外冰晶對(duì)黏附細(xì)胞的研究目前還較少，所以胞外冰晶對(duì)細(xì)胞機(jī)械損傷的檢測(cè)和研究對(duì)解釋組織細(xì)胞的低溫?fù)p傷機(jī)理是非常必要的。文獻(xiàn)[4]利用熱機(jī)械分析儀研究了豬軟骨在凍結(jié)過(guò)程的熱膨脹行為和熱應(yīng)變值,認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨至今不能成功保存的重要原因是在低溫凍結(jié)時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨中存在非均勻熱膨脹現(xiàn)象，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部產(chǎn)生熱應(yīng)力，并損傷關(guān)節(jié)軟骨中的膠原纖維等成分。同時(shí)提出了在一定降溫速率下，添加適宜的冷凍保護(hù)劑有利于保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的力學(xué)性能。

本文采用降溫梯度為1 ℃/min、3 ℃/min、5 ℃/min的慢速降溫方式，通過(guò)分別添加四種醇類低溫保護(hù)劑，系統(tǒng)考察軟骨低溫保存過(guò)程中細(xì)胞外發(fā)生的生物力學(xué)性能變化，研究降溫速率和低溫保護(hù)劑對(duì)軟骨在凍結(jié)過(guò)程熱膨脹行為的影響情況，希望為工程化軟骨組織的低溫保存提供有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取上海本地成年豬身上的整根有兩瓣半月板覆蓋的白色軟骨的豬大骨。用手術(shù)剪將半月板剪去，選取受力負(fù)荷相對(duì)集中的中央軟骨，用專用采樣工具制備直徑為5 mm厚度為3～4 mm的軟骨測(cè)試樣品。本實(shí)驗(yàn)為了便于討論，采用摩爾濃度標(biāo)定保護(hù)劑，從而減小了分子量差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。因?yàn)楦邼舛缺Ｗo(hù)劑的添加存在玻璃化現(xiàn)象，并且會(huì)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以及其他活性物質(zhì)造成不可逆損傷[4]，實(shí)驗(yàn)采用較小摩爾濃度(1.5 mol/L、4.5 mol/L)的乙醇、乙二醇、1,2-丙二醇、甘油(四種試劑均為分析純，購(gòu)置于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，分別進(jìn)行2.5 h的充分滲透并放在4 ℃冰箱貯存以備實(shí)驗(yàn)時(shí)取用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用熱機(jī)械分析儀 (TMA Q400, TA, USA) 作為測(cè)試儀器(壓縮模式)。測(cè)試方法如下：將樣品置于壓縮夾具中心位置；加載0.005N的微小載荷，讀取此時(shí)樣品的厚度為初始厚度。針對(duì)黏附成骨細(xì)胞的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[8-10]，在慢速降溫時(shí)沒(méi)有胞內(nèi)冰的生成，即胞外水分凍結(jié)膨脹所致的熱應(yīng)力是軟骨組織內(nèi)部損傷的主要因素。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇分別以1 ℃/min、3 ℃/min、5 ℃/min的降溫速率從0 ℃開(kāi)始程序降溫至-60 ℃，并記錄整個(gè)過(guò)程樣品的熱應(yīng)變曲線。通過(guò)最終分析該熱應(yīng)變曲線，研究關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)過(guò)程的低溫?fù)p傷機(jī)理和低溫保護(hù)劑對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的低溫保護(hù)機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 降溫速率對(duì)凍結(jié)過(guò)程熱膨脹的影響

2.1.1降溫速率對(duì)添加乙醇、乙二醇的豬軟骨熱應(yīng)變的影響

添加乙醇和乙二醇時(shí)，在不同降溫速率和濃度作用下，豬軟骨的低溫?zé)崃髑€如圖1所示，其中曲線相對(duì)應(yīng)的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值見(jiàn)表1。

表1 添加乙醇和乙二醇時(shí)不同降溫速率和濃度的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值

圖1表明，添加乙醇和乙二醇保護(hù)劑時(shí)，降溫速率對(duì)關(guān)節(jié)軟骨凍結(jié)過(guò)程的熱膨脹有非常顯著的影響。結(jié)合表1及圖1(a)、(c)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加乙醇、乙二醇濃度為1.5 mol/L時(shí)，樣品在三種降溫速率下，3 ℃/min時(shí)的熱應(yīng)變變化值是最小的。可能是因?yàn)樵诮禍剡^(guò)程中， 細(xì)胞外局部結(jié)冰，細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰處于過(guò)冷狀態(tài)，水分開(kāi)始滲出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞外的冰晶不斷生長(zhǎng)。在濃度為1.5 mol/L時(shí)，由于保護(hù)劑濃度較低，滲透進(jìn)入軟骨組織的保護(hù)劑分子較少，其對(duì)水分子的結(jié)合作用較弱，所以胞內(nèi)有大量的自由水可以外滲。當(dāng)降溫速率較快時(shí)，胞外水的過(guò)冷度高，突然結(jié)晶導(dǎo)致膨脹應(yīng)力來(lái)不及釋放，然而此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的水來(lái)不及外滲，因此冰晶的生長(zhǎng)有限；降溫速率較慢時(shí)，雖然冰晶的成核率較低，胞外基質(zhì)對(duì)應(yīng)力具有一定的緩沖作用，然而隨著胞內(nèi)水分不斷外滲，冰晶不斷生長(zhǎng)增大，總體應(yīng)變變化值依舊較大。因此，當(dāng)降溫速率為3 ℃/min時(shí)，存在最佳降溫速率，胞內(nèi)水外滲不致過(guò)多，細(xì)胞外冰的生長(zhǎng)又不至于過(guò)快，胞外蛋白具有一定的緩沖作用，膨脹產(chǎn)生的熱應(yīng)力得以及時(shí)釋放。

由圖1(b)、(d)可以看出，對(duì)于添加濃度為4.5 mol/L保護(hù)劑的豬軟骨，降溫速率越快，其熱應(yīng)變變化值越大。此時(shí)，保護(hù)劑濃度相對(duì)較高，滲透進(jìn)入軟骨細(xì)胞的保護(hù)劑分子較多，其對(duì)水分子的結(jié)合作用較強(qiáng)，胞內(nèi)水的外滲作用對(duì)于整個(gè)組織的膨脹效應(yīng)貢獻(xiàn)已經(jīng)不大，胞外自身水膨脹應(yīng)力對(duì)于整個(gè)組織的膨脹起主導(dǎo)作用。軟骨胞外基質(zhì)中存在大量的膠原和蛋白多糖，對(duì)冰晶的膨脹效應(yīng)具有緩沖效應(yīng)。隨著降溫速度的增加，胞外基質(zhì)來(lái)不及調(diào)整形態(tài)，導(dǎo)致由于膨脹所產(chǎn)生的應(yīng)力來(lái)不及釋放。

圖1 乙醇和乙二醇保護(hù)下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

2.1.2降溫速率對(duì)添加乙1,2-丙二醇和甘油的豬軟骨熱應(yīng)變的影響

添加1,2-丙醇和甘油時(shí)，不同降溫速率和濃度作用下，豬軟骨的低溫?zé)釕?yīng)變曲線如圖2所示，其中曲線相對(duì)應(yīng)的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值列于表2。

通過(guò)圖2發(fā)現(xiàn)，丙二醇以及甘油在濃度為1.5 mol/L時(shí)，應(yīng)變隨溫度的變化情況與乙醇及乙二醇相同。然而在濃度為4.5 mol/L時(shí)依舊存在最佳降溫速度，即3 ℃/min時(shí)，豬軟骨應(yīng)變最小。出現(xiàn)這種情況的最可能原因是三碳醇對(duì)水的結(jié)合性更優(yōu)，此時(shí)軟骨熱應(yīng)力的大小主要取決于冰晶自身的形成機(jī)制。原因可以用結(jié)晶理論來(lái)解釋：慢速降溫的成核率較低，而冰晶生長(zhǎng)快，生成少但較大的冰晶；快速降溫的成核率高，但冰晶生長(zhǎng)慢，因而生成多但較小的冰晶[11]。二者的拮抗作用結(jié)果為存在最佳降溫速度，使得此時(shí)的冰晶形成率最低。

由圖1、2可以看出，在凍結(jié)相變發(fā)生前的熱應(yīng)變首先快速減小，隨著降溫速率的增大，熱收縮幅度越小。原因是在凍結(jié)發(fā)生前，關(guān)節(jié)軟骨中的水分子雖然受降溫的影響而縮短彼此間的距離，在當(dāng)快速降溫時(shí)，達(dá)到凍結(jié)相變點(diǎn)溫度的時(shí)間短，水分子之間的距離還沒(méi)有來(lái)得及減小到穩(wěn)定狀態(tài)，就發(fā)生了凍結(jié)相變過(guò)程，因而凍結(jié)發(fā)生前的熱收縮越小[4]；還能發(fā)現(xiàn)保護(hù)劑濃度為4.5 mol/L時(shí)，膨脹產(chǎn)生的熱應(yīng)力要顯著小于1.5 mol/L。其主要原因有兩個(gè)方面：一是高濃度低溫保護(hù)劑(溶質(zhì))占據(jù)了本該參與相變的純水份額較多，二是有一部分水與低溫保護(hù)劑之間以氫鍵的形式相聯(lián)系，成為不凍水(未凍水)。未凍水含量的高低反映了保護(hù)劑結(jié)合水能力的強(qiáng)弱[12]。

表2 添加1,2-丙醇和甘油時(shí)不同降溫速率和濃度的相變溫度、豬軟骨最大熱應(yīng)變變化值

圖2 1,2-丙二醇和甘油保護(hù)下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

2.2 低溫保護(hù)劑對(duì)凍結(jié)膨脹的影響

圖3給出了樣品經(jīng)過(guò)乙醇、乙二醇、1,2-丙醇、甘油處理后的凍結(jié)過(guò)程熱應(yīng)變變化情況(降溫速率3 ℃/min)。從圖中不難發(fā)現(xiàn)，與其他三種醇類相比，1,2-丙二醇的保護(hù)效果最優(yōu)。其可能原因是在物質(zhì)的量濃度相同的情況下，1,2-丙二醇也要強(qiáng)于其他三種醇類，這與胡桐記等[13]使用DSC研究不同醇類水和性質(zhì)的研究結(jié)果一致。Fahy等[14]認(rèn)為諸多低溫保護(hù)劑結(jié)合水能力的高低，除了部分與本身所含有的羥基個(gè)數(shù)有關(guān)，還與是否含有甲基以及甲基的個(gè)數(shù)有關(guān)，這就是所謂的“甲基化效應(yīng)”。甲基的存在降低了羥基之間鍵合的可能性，切斷了溶質(zhì)之間羥基鏈的鍵合，增大了與水分子之間鍵合的可能性[15]。由于甘油分子中有較長(zhǎng)的羥基鏈，大大增加了保護(hù)劑自身或者保護(hù)劑之間的鍵合的概率，從而弱化了對(duì)水束縛的能力，造成了結(jié)合水能力弱于1,2-丙二醇，同樣的道理適用于乙二醇和甘油的比較。在1,2-丙二醇和乙二醇的比較中，1,2-丙二醇的結(jié)合水能力也是強(qiáng)于乙二醇，兩者的分子中雖然都只有兩個(gè)羥基基團(tuán)，但是1, 2-丙二醇分子中多了一個(gè)碳原子，減少了保護(hù)劑之間的鍵合的概率，使得1,2-丙二醇自身鍵合的概率降低，與水鍵合的可能性也就增加了。

圖3 3 ℃/min的降溫速率下四種保護(hù)劑不同濃度下的豬軟骨的熱應(yīng)變曲線

3 結(jié)論

1) 關(guān)節(jié)軟骨低溫凍結(jié)保存時(shí)，細(xì)胞外存在熱膨脹現(xiàn)象，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)部熱應(yīng)力的產(chǎn)生，并損傷關(guān)節(jié)軟骨中的膠原纖維等成分。影響該熱應(yīng)力大小的因素有很多，如降溫速率，添加保護(hù)劑的濃度和種類。

2) 降溫速率對(duì)胞外膨脹所產(chǎn)生的應(yīng)力的影響機(jī)制復(fù)雜：隨著速度的增加，未凍水的過(guò)冷度增加，成核率較高，保外基質(zhì)難以起到緩沖效果，導(dǎo)致膨脹熱應(yīng)力較大；然而此時(shí)，胞內(nèi)水的外滲作用弱，未凍水含量較少，同時(shí)冰晶的生長(zhǎng)速率也較低。一定濃度冷凍保護(hù)劑的添加，可以影響降溫過(guò)程的主導(dǎo)因素，進(jìn)而找到最佳降溫速率。

3) 由于甲基對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的力學(xué)性能保護(hù)要好于羥基，與乙醇、乙二醇、甘油相比，1,2-丙二醇更適合保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

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