張 朋， 王康才*， 趙 杰， 趙秀梅， 郭慶海， 陳志祥

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所， 江蘇南京 210095； 2 江蘇省鹽城市濱?？h植保植檢站， 江蘇濱海 224500；3 江蘇省鹽城市射陽(yáng)縣盛大藥材有限公司， 江蘇射陽(yáng) 224300)

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)基地進(jìn)行，供試材料由洋馬中藥材種植基地提供。2013年6月選取生長(zhǎng)一致，無(wú)病蟲害的健壯植株定植于花盆，每盆1株，花盆規(guī)格為35 cm×30 cm，基質(zhì)為蛭石和珍珠巖，比例為(1 ∶2)，每盆裝基質(zhì)約25 L。

另外，在整個(gè)生育期內(nèi)每盆所施過(guò)磷酸鈣，氯化鉀總量分別為7.698 g和1.353 g，其中過(guò)磷酸鈣采用一次性基施，氮肥和鉀肥則分別于6月初、 7月下旬、 9月初按底肥40%、 打頂分枝肥40%、 蕾肥20%分3次施入。為了保證試驗(yàn)材料正常生長(zhǎng)，在原有施肥方案的基礎(chǔ)上采用一次性基施的方式補(bǔ)充中、 微量元素(見(jiàn)表1)。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，管理措施一致，4次重復(fù)。

表1 補(bǔ)充施用中、 微量元素情況(g/pot)

1.2 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.2.1 病害調(diào)查方法 2013年9月中下旬，觀察杭白菊斑枯病發(fā)病情況，各處理采取對(duì)角線定點(diǎn)定株調(diào)查，每隔5 d調(diào)查一次，每個(gè)處理調(diào)查5株。

1.2.3 杭白菊中總黃酮、 綠原酸、 木犀草苷、 3,5-O-雙咖啡?；鼘幩岬臏y(cè)定 2013年9月底分別選取不同處理的根、 莖、 葉、 花洗凈，105 ℃殺青30 s，置DHG90A電熱恒溫干燥箱中75 ℃烘至恒重，打粉過(guò)0.3 mm篩。總黃酮采用超聲提取，比色法測(cè)定；綠原酸、 木犀草苷、 3,5-O-雙咖啡酰基奎寧酸等成分按照2010版藥典[8]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2007和統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同銨硝比例對(duì)杭白菊斑枯病發(fā)病率及病情指數(shù)的影響

表2 不同銨硝比例對(duì)菊花蕾期斑枯病發(fā)生情況的影響(%)

2.2 不同銨硝比例對(duì)杭白菊葉片中木質(zhì)素、 纖維素、 可溶性總糖、 可溶性蛋白含量的影響

表3 不同銨硝比例對(duì)杭白菊葉片木質(zhì)素、 纖維素、 可溶性總糖、 可溶性蛋白含量的影響

2.3 不同銨硝比例對(duì)杭白菊病葉中苯丙氨酸解氨酶(PAL)和抗氧化酶的影響

表4 不同銨硝比例對(duì)杭白菊葉片PAL和抗氧化酶的影響

2.4 不同銨硝比例對(duì)杭白菊病葉中丙二醛和超氧陰離子含量的影響

2.5 不同銨硝比例對(duì)杭白菊不同部位總黃酮含量的影響

表5 不同銨硝比例對(duì)MDA和的影響

2.6 不同銨硝比例對(duì)綠原酸、 木犀草苷、 3,5-O-雙咖啡?；鼘幩岷康挠绊?/h3>

表6 不同銨硝比例對(duì)杭白菊不同部位總黃酮含量的影響(mg/g)

表7 不同銨硝比例對(duì)杭白菊綠原酸、 木犀草苷和3,5-O-雙咖啡酰基奎寧酸含量的影響(%)

2.7 相關(guān)生理指標(biāo)與發(fā)病率和病情指數(shù)的相關(guān)分析

相關(guān)性分析結(jié)果(表8)表明，杭白菊的木質(zhì)素、 可溶性總糖、 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、 過(guò)氧化物酶(POD)活性、 超氧陰離子、 綠原酸、 3,5-O-雙咖啡?；鼘幩?、 花中總黃酮的含量與杭白菊斑枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，且達(dá)極顯著水平(P<0.01)；SOD活性、 MDA含量與杭白菊斑枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)呈正相關(guān)，且均達(dá)顯著水平(P<0.05)或極顯著水平；纖維素、 可溶性蛋白、 木犀草苷和根中總黃酮含量與發(fā)病率和病情指數(shù)有一定的相關(guān)性但均不顯著；綜合方差分析和相關(guān)性分析的結(jié)果，認(rèn)為杭白菊斑枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)與相關(guān)生理指標(biāo)和次生代謝密切相關(guān)。

表8 杭白菊相關(guān)生理指標(biāo)與發(fā)病率和病情指數(shù)的相關(guān)分析(n=15)

3 討論

3.1 不同銨硝比例對(duì)杭白菊斑枯病及木質(zhì)素、 纖維素、 可溶性總糖等物質(zhì)的影響

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，在與病原菌相互作用中通過(guò)各種代謝途徑和形式建立了有效應(yīng)對(duì)外來(lái)侵害的完整機(jī)制，例如形態(tài)結(jié)構(gòu)屏蔽、 抗氧化酶、 抗病物質(zhì)等。

木質(zhì)素與植物的抗病性密切相關(guān)，木質(zhì)素含量的增加提高了寄主植物的抗性，阻礙了病原菌對(duì)植物的進(jìn)一步侵染[9]。纖維素在維持植物細(xì)胞的形態(tài)、 抵抗病害方面也發(fā)揮了重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在病害脅迫下，隨著硝態(tài)氮比例的增加，木質(zhì)素、 纖維素含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，斑枯病的發(fā)病率也隨之降低，這與駱桂芬等[10]木質(zhì)素含量增加降低霜霉病發(fā)生率，李淼等[11]對(duì)木質(zhì)素含量與抗病性呈正相關(guān)的研究結(jié)果相一致。

3.2 不同銨硝比例對(duì)杭白菊斑枯病及保護(hù)酶物質(zhì)的影響

過(guò)氧化物酶(POD)是與植保素、 木質(zhì)素等物質(zhì)的生物合成有關(guān)的一類氧化酶[14]，POD 可以將酚類物質(zhì)氧化為醌類物質(zhì)，清除活性氧，提高植物的抗病能力。本研究發(fā)現(xiàn)，在病害脅迫下隨著硝態(tài)氮比例的增加杭白菊病葉中POD的活性先升高后下降，斑枯病的發(fā)病率隨之下降。這說(shuō)明不同銨硝比例或許是通過(guò)影響病害脅迫下POD的含量來(lái)影響植物病害的發(fā)生。

丙二醛(MDA)是不飽和脂肪酸降解的末端產(chǎn)物，其含量可作為膜脂過(guò)氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)在病害脅迫下隨著硝態(tài)氮比例的增加杭白菊病葉中MDA的含量呈先下降后上升的趨勢(shì)，且單施硝態(tài)氮時(shí)MDA含量較低，與植株的病害發(fā)生情況相一致。這與翟彩霞等[20]的研究結(jié)果一致

3.3 不同銨硝比例對(duì)杭白菊斑枯病及次生代謝產(chǎn)物的影響

黃酮類化合物與植物的抗病性關(guān)系密切，參與組織和病原微生物的互作及防御反應(yīng)，具有抗病毒，抑菌活性，可作為植保素在植物體內(nèi)累積使植物免受微生物的侵染[21]。本研究發(fā)現(xiàn)在病害脅迫下隨著硝態(tài)氮比例的增加，植物體內(nèi)黃酮含量隨之增加，發(fā)病率逐步下降，這也許是因?yàn)榈貢?huì)對(duì)黃酮合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶PAL產(chǎn)生影響，苯丙氨酸是蛋白質(zhì)和酚類化合物合成的共同前體，酚類與蛋白質(zhì)之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，在病害影響下施入硝態(tài)氮會(huì)使苯丙氨酸向蛋白方向轉(zhuǎn)化減少(這也是本試驗(yàn)中蛋白含量隨硝態(tài)氮比例增加而有所減少的一個(gè)原因)，導(dǎo)致PAL活性增強(qiáng)，即黃酮轉(zhuǎn)化的前體含量增加，從而使黃酮含量增加，并最終通過(guò)影響黃酮含量來(lái)影響植物病害的發(fā)生。

酚類物質(zhì)是抗菌性物質(zhì)，有一定的毒性在植物體內(nèi)可抑制病原物分泌的水解酶起到抗菌作用，它又是木質(zhì)素合成的前體，使木質(zhì)化增強(qiáng)。在植物抗病過(guò)程中起重要作用，提高植物的抗病性[22]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)與植物體內(nèi)苯丙烷類代謝和大多數(shù)酚類物質(zhì)的合成密切相關(guān)，PAL是其合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，PAL 活性增強(qiáng)，植物體內(nèi)酚類物質(zhì)如綠原酸等含量增多，同時(shí) PAL 也是調(diào)控植物過(guò)敏性反應(yīng)的主要酶系之一。本研究發(fā)現(xiàn)在病害脅迫下隨著硝態(tài)氮比例的增加，PAL、 綠原酸、 3,5-O-雙咖啡?；鼘幩峋霈F(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，而植株的發(fā)病率也隨之有所降低。這說(shuō)明不同銨硝比例或許是通過(guò)影響病害脅迫下PAL活性、 綠原酸、 3,5-O-雙咖啡?；鼘幩岷縼?lái)影響植物病害的發(fā)生。這與王萱[23]的研究結(jié)果PAL活性與抗病性呈正相關(guān)，郭瑩等[3]銨態(tài)氮促進(jìn)大白菜芝麻狀斑點(diǎn)病發(fā)生的作用高于硝態(tài)氮和酰胺態(tài)氮的研究結(jié)果一致，與葉茂炳等[24]的研究小麥麥穗接種病原菌以后，PAL比活力變化以及綠原酸含量與其抗赤霉病程度呈負(fù)相關(guān)不一致，這可能是病原菌以及植物類別不同等原因所致。

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