黃曉冬, 吳雅清, 許瑞安, 劉 嘉, 俞 愉, 蔡建秀

(1. 泉州師范學(xué)院 分子生物與藥物化學(xué)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 泉州 362000；2. 華僑大學(xué) 分子藥物教育部工程中心, 福建 泉州 362021)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase)是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于動(dòng)植物、真菌及微生物體內(nèi)[1]，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，具有獨(dú)特的雙重催化功能，能先后催化黑色素生成過(guò)程中的3個(gè)反應(yīng)途徑：?jiǎn)畏?L-酪氨酸)的羥基化、二酚(L-多巴)的氧化及二羥基吲哚(DHI)的脫氫[2]。它首先催化L-酪氨酸羥基化形成L-多巴，再氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌經(jīng)一系列的酶促和非酶促反應(yīng)生成中間體DHI，后者最終形成黑色素[2-4]。在人體內(nèi)，酪氨酸酶引起皮膚、眼和頭發(fā)等的黑化，但其異常過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致人體雀斑、黃褐斑與老年斑等色素沉著[5]；植物源食品包含的酪氨酸酶會(huì)引發(fā)不利的酶促褐變，使其營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量下降，并導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失[6]；昆蟲(chóng)表皮的酪氨酸酶催化產(chǎn)生的黑色素可以保護(hù)其免受紫外線輻射，酪氨酸酶還與昆蟲(chóng)蛻皮過(guò)程中的鞣化作用有關(guān)，并影響昆蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)和生長(zhǎng)[5,7]。因此，研發(fā)與應(yīng)用酪氨酸酶抑制劑(tyrosinase inhibitors，TI)抑制酪氨酸酶活性，是防止果蔬褐變和色素沉著[8]、研制美白化妝品和生物源殺蟲(chóng)劑[9]的一種重要途徑。

迄今，研究者發(fā)現(xiàn)了大量天然或合成的酪氨酸酶抑制劑[10]，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些酪氨酸酶抑制劑存在著黑色素細(xì)胞毒性與副作用[11]，比如氫醌的致敏作用[12]和曲酸的致癌作用[13]等。因此，許多學(xué)者致力于尋找和開(kāi)發(fā)無(wú)毒、高效和特異性強(qiáng)的酪氨酸酶抑制劑。由于植物次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)多樣且含量較豐富，并具有多種生物活性且相對(duì)較安全，成為酪氨酸酶抑制劑篩選的主要來(lái)源與熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究結(jié)果表明：植物來(lái)源的酪氨酸酶抑制劑涵蓋糖苷類(lèi)、黃酮及多酚類(lèi)和醛類(lèi)等多種化學(xué)成分，其中，植物多酚(plant ployphenols)廣泛存在于植物體內(nèi)，含量?jī)H次于纖維素、半纖維素與木質(zhì)素；其具有的1個(gè)或多個(gè)酚羥基能及時(shí)清除過(guò)氧自由基，進(jìn)而可減弱酪氨酸的氧化作用，并且酚羥基還可能與酪氨酸酶分子中的Cu2+絡(luò)合而抑制該酶活性[14]。因而，植物多酚被普遍認(rèn)為是理想的且有開(kāi)發(fā)前景的酪氨酸酶抑制劑之一。據(jù)報(bào)道，從薔薇科(Rosaceae)李屬(PrunusLinn.)植物青梅(P.mumeSieb. et Zucc.)花中提取的多酚提取物[15]、從薔薇科蘋(píng)果屬(MalusMill.)植物蘋(píng)果(M.pumilaMill.)中純化的蘋(píng)果多酚[5]和茶多酚(TPP)[16]、從柿樹(shù)科(Ebenaceae)柿屬(DiospyrosLinn.)植物柿樹(shù)(D.kakiThunb.)中分離的多酚[17]、從?？?Moraceae)桑屬(MorusLinn.)植物魯桑〔M.lhou(Ser.) Koidz.〕中分離的多酚[18]等均具有酪氨酸酶抑制活性。

桐花樹(shù)〔Aegicerascorniculatum(Linn.) Blanco〕為紫金?？?Myrsinaceae)蠟燭果屬(AegicerasGaertn.)的紅樹(shù)植物，是紅樹(shù)林的廣布種之一，生于海邊灘涂上，為了適應(yīng)海洋鹽生環(huán)境該種體內(nèi)富含單寧等多酚類(lèi)化合物[19-20]。目前，對(duì)桐花樹(shù)多酚作為酪氨酸酶抑制劑的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。作者以自然分布于泉州灣河口濕地的桐花樹(shù)葉片為實(shí)驗(yàn)材料，初步制備桐花樹(shù)葉片多酚提取物，并研究該多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用，同時(shí)測(cè)定其對(duì)DPPH·自由基的清除能力及對(duì)化妝品中常見(jiàn)腐敗菌的抑菌作用，以期為桐花樹(shù)葉片多酚提取物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 多酚提取物獲得和樣液配制 供試桐花樹(shù)葉片于2012年5月份采自福建泉州灣紅樹(shù)林濕地，洗凈去雜后用水蒸氣加熱2～5 min，使樣品中酚氧化酶PPO等喪失活性[20]；瀝干并陰干后磨成粉末，過(guò)60目篩；為去除葉綠素并脫脂和脫蠟，置于索氏提取器中用石油醚(30 ℃～60 ℃)提取至浸出液無(wú)色為止；自然揮發(fā)去除石油醚后，密封遮光冷藏(-20 ℃)備用。取處理后的桐花樹(shù)粉末按料液比(W∶V)1∶20的比例加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，于溫度70 ℃條件下超聲波(功率210 W、頻率80 kHz)輔助提取70 min，抽濾后的濾液即為多酚提取液。將提取液減壓濃縮(約50 ℃，-0.01 kPa)去醇至一定體積后， 按30 mL加 0.5 g的比例加入AlCl3，并用1 mol·L-1NaHCO3調(diào)節(jié)至pH 5.1～pH 6.0，靜置待多酚沉淀，離心；沉淀用0.5 mol·L-1HCl轉(zhuǎn)溶，再按照V∶V=1∶1的比例用乙酸乙酯萃取3次，每次5 min；合并乙酸乙酯萃取液并減壓蒸餾(40 ℃，-0.01 kPa)除去乙酸乙酯，殘?jiān)稍锖蠹吹枚喾犹崛∥?，避光保存?20 ℃，備用。

使用時(shí)用DMSO配成質(zhì)量濃度1.000 g·L-1母液，并稀釋成質(zhì)量濃度0.100～1.000 g·L-1的多酚提取物樣液Ⅰ，供酪氨酸酶活性抑制測(cè)定與自由基清除能力測(cè)定；另將多酚提取物預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇助溶，以無(wú)菌水稀釋配成2倍比濃度系列的樣液Ⅱ(12.5～100 g·L-1)，對(duì)應(yīng)溶媒乙醇的體積分?jǐn)?shù)為4.75%～38.00%,供抗菌活性測(cè)定；取一定量的多酚提取物，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解并定容至50 mL，作為供測(cè)樣液Ⅲ。

1.1.2 儀器和試劑 主要儀器：L5紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；PHB-4便攜式酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)；TGL-10B高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ-300VDE臺(tái)式雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

主要試劑：酪氨酸酶(1 680 U·mg-1，美國(guó)Worthington公司)，用50 mmol·L-1PBS配制成相應(yīng)濃度；沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度89.9%，批號(hào)110831-201204)；槲皮素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度97.3%，批號(hào)100081-200406)；左旋多巴(L-DOPA)(美國(guó)Sigma公司)；防腐劑布羅波爾Bronopol(日用化工級(jí)，廣州冠志化工有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 供試菌種 供試菌種大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)均由福建師范大學(xué)生物工程學(xué)院微生物教研組提供。

1.2 方法

1.2.1 多酚提取物中多酚含量測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu法[21]測(cè)定多酚含量。取0.2 mL樣液Ⅲ，加入1.0 mL蒸餾水和1.0 mL Folin酚試劑，漩渦振蕩，暗處放置8 min后加入1.0 mL質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)7.5%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至25 mL，充分混合，室溫靜置120 min顯色，于波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定吸光度值。按同法用沒(méi)食子酸對(duì)照品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，1 g提取物中的多酚含量以沒(méi)食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent，GAE)計(jì)。

1.2.2 多酚提取物抑制酪氨酸酶活性的測(cè)定 酪氨酸酶活性測(cè)定參照石嘉懌[15]的方法并略加修改。在總體積3.0 mL的酶活反應(yīng)測(cè)定體系中，依次加入多酚提取物樣液Ⅰ 0.1 mL、200 U·mL-1酪氨酸酶溶液0.1 mL 和0.5 mmol·L-1L-DOPA底物溶液2.8 mL，充分混勻，37 ℃水浴保溫10 min后，于波長(zhǎng)475 nm處測(cè)得樣液組吸光度值A(chǔ)3；以DMSO代替樣液Ⅰ，測(cè)得空白對(duì)照組吸光度值A(chǔ)1；以50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)代替樣液Ⅰ和酪氨酸酶溶液，測(cè)得空白對(duì)照組背景吸光度值A(chǔ)2；以50 mmol·L-1PBS(pH 6.8)代替酪氨酸酶溶液，測(cè)得樣液組背景吸光度值A(chǔ)4。提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率(I)按下式計(jì)算：I=〔1-(A3-A4)/(A1-A2)〕×100%。以槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

在上述的酶活反應(yīng)測(cè)定體系中，改變酪氨酸酶濃度([E]分別為25、50、100、150和200 U·mL-1)，分別測(cè)定質(zhì)量濃度0.000、0.650和0.950 g·L-1的多酚提取物樣液Ⅰ對(duì)不同濃度酪氨酸酶活性的影響，于波長(zhǎng)475 nm處測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。酪氨酸酶催化反應(yīng)速率v以酶活反應(yīng)測(cè)定體系反應(yīng)終止后測(cè)得的吸光度值A(chǔ)475定量表征[22]。A475的計(jì)算公式為A475=A3-A4，其中，A3和A4分別是樣液組吸光度值和樣液組背景吸光度值。以酪氨酸酶濃度[E]為X軸、以A475為Y軸作圖，并依此判斷多酚提取物樣液對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的類(lèi)型。

1.2.3 多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制的動(dòng)力學(xué)分析 上述酶活反應(yīng)測(cè)定體系中，改變L-DOPA底物濃度([S]分別為0.200、0.250、0.333、0.500、1.000和2.000 mmol·L-1)，測(cè)定不同質(zhì)量濃度([I]分別為0.000、0.350和0.650 g·L-1)多酚提取物樣液Ⅰ對(duì)酪氨酸酶活性的影響，于波長(zhǎng)475 nm處測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按上法表征酪氨酸酶催化反應(yīng)的速率v。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法[23]79作圖，通過(guò)米氏常數(shù)Km和酶促反應(yīng)最大速率vm的變化來(lái)判斷抑制類(lèi)型。

1.2.4 多酚提取物對(duì)DPPH·自由基清除能力的測(cè)定 多酚提取物對(duì)DPPH·自由基清除能力的測(cè)定參照鐘瑞敏等[24]的方法并略加修改。分別取200 μL各濃度測(cè)試樣液Ⅰ，與0.06 mmol·L-1DPPH·甲醇溶液4 mL混勻，15 min后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)S；以200 μL甲醇代替樣液測(cè)得空白對(duì)照組吸光度值A(chǔ)0；考慮樣液本身的顏色，以甲醇代替DPPH·甲醇溶液測(cè)得樣液本底吸光度值A(chǔ)B；自由基清除率(D)的計(jì)算公式為：D=[1-(AS-AB)/A0]×100%。以槲皮素為陽(yáng)性對(duì)照，DPPH·自由基清除能力以自由基清除率D與等量槲皮素(quercetin equivalent，QE)表示，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 多酚提取物抗菌活性的測(cè)定 采用管碟法[25]測(cè)定抑菌圈直徑。用無(wú)菌移液槍分別吸取0.2 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌菌懸液(0.5×107CFU·mL-1)均勻涂布于平板(內(nèi)徑90 mm)表面，在每平板上等距離放入4只滅菌牛津杯(10.0 mm×7.8 mm×6.0 mm)，并在每個(gè)牛津杯中加入樣液Ⅱ 200 μL，以相應(yīng)溶媒作空白對(duì)照；37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑(d)評(píng)價(jià)抑菌效果，計(jì)算公式為：d=樣液抑制圈直徑-空白對(duì)照抑制圈直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并計(jì)算平均值。

參照文獻(xiàn)[25]測(cè)定最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。用無(wú)菌移液槍吸取1.0 mL樣液Ⅱ，與15 mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(溫度低于45 ℃)充分混勻，冷卻后制成含樣液平板，以相應(yīng)溶媒作空白對(duì)照、Bronopol為陽(yáng)性對(duì)照；吸取上述菌懸液0.1 mL均勻涂布于各平板上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h后觀察3種細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，以完全無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣液濃度作為最低抑菌濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

桐花樹(shù)葉片醇提取物和多酚提取物得率的計(jì)算公式分別為：醇提取物得率=醇提取物質(zhì)量/桐花樹(shù)葉片粉末質(zhì)量；多酚提取物得率=多酚提取物質(zhì)量/桐花樹(shù)葉片粉末質(zhì)量。

采用EXCEL 2003和SPSS Statistics V17.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，采用EXCEL軟件作圖；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間均值方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 桐花樹(shù)葉片多酚提取物的得率與多酚含量

經(jīng)超聲波輔助提取，桐花樹(shù)葉片醇提取物得率為(281.2±25.6) mg·g-1，醇提液經(jīng)金屬鹽沉淀、鹽酸轉(zhuǎn)溶沉淀和乙酸乙酯萃取后獲得多酚提取物，得率約為(122.0±31.4) mg·g-1，經(jīng)Folin-Ciocalteu法測(cè)得該多酚提取物中多酚含量為(521.8±17.2) mg·g-1。

2.2 桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用分析

2.2.1 多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響 桐花樹(shù)葉片多酚提取物和槲皮素對(duì)酪氨酸酶活性抑制率的量效關(guān)系見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)：多酚提取物和陽(yáng)性對(duì)照槲皮素對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率均隨其質(zhì)量濃度的提高而增大，呈明顯正相關(guān)的量效關(guān)系(R2分別為0.957 1和0.930 4)。質(zhì)量濃度0.950 g·L-1多酚提取物和槲皮素對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率分別高達(dá)73.36%和82.17%，但二者差異不顯著(P>0.05)。根據(jù)二者的線性回歸方程獲得多酚提取物與槲皮素對(duì)酪氨酸酶活性的半抑制濃度(IC50)分別為0.650和0.600 g·L-1，提示桐花樹(shù)葉片多酚提取物和槲皮素對(duì)酪氨酸酶活性的抑制能力相近。

●: 多酚提取物Polyphenol extracts; ○: 槲皮素Quercetin.

2.2.2 多酚提取物對(duì)不同濃度酪氨酸酶活性的抑制作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)：在底物濃度和桐花樹(shù)葉片多酚提取物質(zhì)量濃度不變的條件下，隨著酪氨酸酶濃度的提高，反應(yīng)體系的吸光度值A(chǔ)475呈線性增加；而在底物濃度和酪氨酸酶濃度不變的情況下，A475隨多酚提取物質(zhì)量濃度的提高而下降。以A475對(duì)酪氨酸酶濃度[E]作圖可得3條通過(guò)原點(diǎn)的直線(圖2)，直線斜率隨提取物質(zhì)量濃度增加而下降，說(shuō)明桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用不是通過(guò)降低有效酶量而是通過(guò)降低酶活性實(shí)現(xiàn)的，表現(xiàn)為可逆性抑制作用。

○: 0.000 g·L-1多酚提取物 0.000 g·L-1 polyphenol extracts;

2.2.3 多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制動(dòng)力學(xué)由Lineweaver-Burk方程(表1)可見(jiàn)：隨提取物質(zhì)量濃度的提高,米氏常數(shù)Km值增大、酶促反應(yīng)最大速率vm值減小，這與混合Ⅰ型抑制類(lèi)型的動(dòng)力學(xué)特征相符，即桐花樹(shù)葉片多酚提取物既可以與游離酶(E)結(jié)合，也可以與酶-底物絡(luò)合物(ES)在非活性中心結(jié)合，導(dǎo)致酪氨酸酶活性降低。以1/v對(duì)1/[S]進(jìn)行Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到1組相交于第二象限的直線(圖3-a)。進(jìn)一步以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖的斜率與截距對(duì)相應(yīng)的多酚提取物濃度二次作圖均呈直線(見(jiàn)圖3-b，c)。計(jì)算結(jié)果顯示：桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)游離酪氨酸酶活性的抑制常數(shù)Ki為0.833 g·L-1、對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)Kis為1.823 g·L-1，Kis為Ki的2.19倍，說(shuō)明桐花樹(shù)葉片多酚提取物與游離酶的親和力大于其與酶-底物絡(luò)合物的親和力。

表1 不同濃度桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)1)

2.3 桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)DPPH·自由基的清除能力

自由基能上調(diào)酪氨酸酶mRNA的表達(dá)，抗氧化作用是酪氨酸酶抑制機(jī)制之一[26]。DPPH·自由基反應(yīng)體系由于具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于自由基清除劑的篩選及純抗氧化劑或植物提取物的體外抗氧化活性測(cè)定[27]。不同濃度桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)DPPH·自由基的清除作用見(jiàn)表2。由表2可知：桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)DPPH·自由基表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，清除率隨提取物質(zhì)量濃度的提高而增大。在質(zhì)量濃度0.000～0.600 g·L-1范圍內(nèi)提取物與DPPH·自由基清除率有明顯的量效關(guān)系，線性回歸方程為：y=106.45x+17.638(R2=0.971 0，P<0.01)。以此計(jì)算出桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)DPPH·自由基的半抑制濃度IC50為0.304 g·L-1，與0.036 g·L-1槲皮素等效。

○: 0.000 g·L-1多酚提取物 0.000 g·L-1 polyphenol extracts; ●: 0.350 g·L-1多酚提取物 0.350 g·L-1 polyphenol extracts; ▲: 0.650 g·L-1多酚提取物 0.650 g·L-1 polyphenol extracts. [S]: L-DOPA濃度Concentration of L-DOPA (mmol·L-1); v: 用波長(zhǎng)475 nm處的吸光度值A(chǔ)475表征 Represented by absorbance value A475 in wavelength 475 nm; [I]: 多酚提取物濃度Concentration of polyphenol extracts (g·L-1).

表2 不同濃度桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)DPPH·自由基的清除作用

2.4 桐花樹(shù)葉片多酚提取物的抑菌活性

不同濃度桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑見(jiàn)表3。由表3可知：多酚提取物對(duì)3種供試菌的抑菌圈直徑均隨提取物質(zhì)量濃度的提高而增大，50 g·L-1多酚提取物對(duì)3種供試菌均表現(xiàn)出抑菌作用，質(zhì)量濃度為100 g·L-1時(shí)，多酚提取物對(duì)3種供試菌的抑菌圈直徑均達(dá)15 mm以上，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)20 mm以上。最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步顯示：桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)供試3種細(xì)菌的MIC均為25 g·L-1，相當(dāng)于化妝品防腐劑Bronopol對(duì)供試3種細(xì)菌的MIC(對(duì)大腸桿菌的MIC小于或等于2 g·L-1，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為4 g·L-1，對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為4 g·L-1)。

表3 不同濃度桐花樹(shù)葉片多酚提取物的抑菌圈直徑比較

3 討 論

人體皮膚黑化、色素沉著性疾病及黑色素瘤的發(fā)生與黑色素合成最關(guān)鍵的限速酶——酪氨酸酶的催化活力升高和過(guò)量表達(dá)有關(guān)。酪氨酸酶抑制劑(TI)可以通過(guò)抑制酪氨酸酶的活性來(lái)預(yù)防和治療色素沉著并使皮膚美白。為了篩選TI并探明其作用機(jī)制，研究者常采用體外化學(xué)模型體系的酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)、動(dòng)力學(xué)分析[26]以及基于細(xì)胞培養(yǎng)的酪氨酸酶活性檢測(cè)技術(shù)[28]。從天然植物組織中分離提取、從商品化合物中篩選和有機(jī)合成新化合物是目前尋找TI的3個(gè)主要路徑[5]，其中植物源TI因具有高效、無(wú)毒的特點(diǎn)而備受青睞，并已廣泛應(yīng)用于增白美容化妝品中。植物多酚就是美白化妝品TI的理想選項(xiàng)之一，其吸收紫外線、抗氧化與清除自由基以及對(duì)酪氨酸酶活性抑制能力強(qiáng)等特點(diǎn)使之具有與眾不同的美白綜合效應(yīng)[29]。

紅樹(shù)植物是一類(lèi)常年生長(zhǎng)于鹽生環(huán)境中的特殊植物，較高含量的多酚(單寧)是一些紅樹(shù)植物提高抗腐蝕性以適應(yīng)鹽生環(huán)境的生存策略之一[19]。柴緯明等[30]從紅樹(shù)植物秋茄樹(shù)〔Kandeliacandel(Linn.) Druce〕葉片中獲得縮合單寧，并發(fā)現(xiàn)它對(duì)蘑菇酪氨酸酶具有很強(qiáng)的抑制作用，IC50僅為30.0 μg·mL-1，這一研究結(jié)果顯示出紅樹(shù)植物中的多酚類(lèi)物質(zhì)作為T(mén)I開(kāi)發(fā)的可能性與獨(dú)特性。同為紅樹(shù)植物的桐花樹(shù)，葉片解剖結(jié)構(gòu)及成分分析的研究結(jié)果均顯示其體內(nèi)含有較高水平的多酚[19,31]。鑒于此，作者選用金屬鹽沉淀-乙酸乙酯萃取相結(jié)合的方法獲得桐花樹(shù)葉片多酚提取物，其葉片多酚提取物的多酚含量約為521.8 mg·g-1；根據(jù)酚類(lèi)分子量與乙酸乙酯溶劑的關(guān)系，初步判斷經(jīng)乙酸乙酯萃取獲得的多酚可能主要為中等分子量的多酚類(lèi)成分[32]，相比于大分子量多酚的強(qiáng)收斂性所產(chǎn)生的皮膚刺激副作用，桐花樹(shù)葉片多酚提取物更適合作為化妝品添加劑。

為了探明桐花樹(shù)葉片多酚提取物的酪氨酸酶活性抑制能力，作者選用相對(duì)簡(jiǎn)單、便捷的體外化學(xué)模型體系進(jìn)行酪氨酸酶抑制活性檢測(cè)，由于桐花樹(shù)葉片多酚提取物在水溶液中的溶解度相對(duì)較小，一般的有機(jī)溶劑(如乙醇等)對(duì)酪氨酸酶又具有一定的抑制作用[33]25，故而選用DMSO作為溶媒。邱凌[33]25認(rèn)為DMSO-H2O體系不會(huì)對(duì)酪氨酸酶活性產(chǎn)生抑制作用；但陳懿等[34]研究了DMSO對(duì)酪氨酸酶活性的影響，認(rèn)為DMSO體積分?jǐn)?shù)大于25%時(shí)酪氨酸酶活性會(huì)急劇下降；而更多的研究者通常將反應(yīng)體系中DMSO的用量控制為體積分?jǐn)?shù)3.33%[26],[33]26，以盡量避免DMSO的影響并保證實(shí)驗(yàn)效果。因此，在本研究中作者也將反應(yīng)體系中DMSO的用量設(shè)定為體積分?jǐn)?shù)3.33%。研究結(jié)果表明：桐花樹(shù)葉片多酚提取物具有明顯的酪氨酸酶活性抑制作用，IC50為0.650 g·L-1，其酪氨酸酶活性抑制能力與槲皮素(IC50為0.600 g·L-1)相近，而在黃酮類(lèi)化合物中槲皮素是對(duì)酪氨酸酶活性抑制率較高的可逆抑制劑[35]。由此可見(jiàn)，桐花樹(shù)葉片多酚提取物是一種潛在的、有效的酪氨酸酶活性抑制劑，可通過(guò)柱色譜分離技術(shù)和活性追蹤方法進(jìn)一步篩選出該多酚提取物中高效的TI組分或單體成分。

根據(jù)抑制劑與酶作用的特點(diǎn)，酶抑制類(lèi)型可分為可逆抑制和不可逆抑制2類(lèi)，前者又可分為競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合型抑制等4種類(lèi)型。李航等[14]認(rèn)為：對(duì)酪氨酸酶活性的可逆抑制類(lèi)型中還應(yīng)包括一種緩慢結(jié)合型抑制，即抑制劑與酶快速形成EI復(fù)合物后緩慢的可逆異構(gòu)化。在判定酶抑制類(lèi)型時(shí)，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖分析是一種常用的有效方法，作圖后如果得到一組相交于Y軸的直線則為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，如果得到一組相交于X軸的直線則為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，如果得到一組平行的直線則為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，如果得到一組相交于第二或第四象限的直線則為混合Ⅰ型(兼具競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制)或混合Ⅱ型抑制(兼具反競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制)[36]。在這些抑制類(lèi)型中，混合型抑制較為常見(jiàn)[23]120。本研究結(jié)果表明：桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖所得直線相交于第二象限，動(dòng)力學(xué)參數(shù)表現(xiàn)為隨提取物質(zhì)量濃度提高Km值增大、vm值減小，抑制類(lèi)型屬于可逆的混合Ⅰ型抑制，其實(shí)現(xiàn)對(duì)酶活性的抑制一方面是通過(guò)與底物的競(jìng)爭(zhēng)，另一方面是通過(guò)與酶-底物絡(luò)合物(ES)的親和，這種抑制作用兼具競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)。進(jìn)一步的分析結(jié)果顯示：桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)游離酶活性的抑制常數(shù)Ki(0.833 g·L-1)小于該多酚提取物對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)Kis(1.823 g·L-1)，說(shuō)明該多酚提取物對(duì)游離酶活性的抑制作用強(qiáng)于其對(duì)酶-底物絡(luò)合物的抑制作用。這些特征與秋茄樹(shù)葉片中的縮合單寧[30]、青梅花提取物[15]和葉下珠(PhyllanthusurinariaLinn.)提取物[26]對(duì)酪氨酸酶活性的抑制類(lèi)型相似。

有關(guān)酪氨酸酶抑制劑對(duì)酪氨酸酶活性抑制的機(jī)制主要包括3個(gè)方面：結(jié)構(gòu)與酶底物相似；絡(luò)合酪氨酸酶的Cu2+；清除活性氧并拮抗氧對(duì)酪氨酸酶的激活[37]。根據(jù)桐花樹(shù)葉片多酚提取物具有酚羥基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的混合Ⅰ型抑制作用特征，初步判斷其對(duì)酪氨酸酶活性的抑制具有多維機(jī)制。一方面，該提取物含有與L-DOPA分子結(jié)構(gòu)相似的多羥基化學(xué)成分[30]，可以被酪氨酸酶催化[15]并作為競(jìng)爭(zhēng)性底物與酪氨酸酶結(jié)合，削弱酪氨酸酶的催化氧化作用[9]；酚羥基的孤對(duì)電子可與酪氨酸酶分子中的Cu2+絡(luò)合而抑制酶活性，酚羥基還可與酶-底物絡(luò)合物的非活性中心結(jié)合并可能對(duì)酶活性中心雙核銅間的內(nèi)源橋基產(chǎn)生影響[14]，體現(xiàn)出該提取物混合Ⅰ型抑制劑的特點(diǎn)。另一方面，酪氨酸酶是一種含銅需氧酶，其催化功能必須在氧自由基參與下才能完成，通過(guò)清除氧自由基可以減弱或阻斷酪氨酸酶的催化反應(yīng)[33]6,157；桐花樹(shù)葉片多酚提取物清除DPPH·自由基的IC50為0.304 g·L-1，表明其具有較強(qiáng)的抗氧化與清除自由基能力，清除氧自由基、終止自由基鏈的引發(fā)以及拮抗氧對(duì)酪氨酸酶的激活也是桐花樹(shù)葉片多酚提取物抑制酪氨酸酶活性的一個(gè)重要機(jī)制。除了抑制酪氨酸酶活性，桐花樹(shù)葉片多酚提取物是否可以通過(guò)下調(diào)酪氨酸酶mRNA表達(dá)來(lái)降低酪氨酸酶水平？以及是否影響酪氨酸酶表達(dá)的信號(hào)通路？這些疑問(wèn)均有待綜合運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)、RT-PCR和Western Blot等實(shí)驗(yàn)手段加以揭示與探明。

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌是引起化妝品變質(zhì)、腐敗以及色澤和氣味變化的常見(jiàn)腐敗菌。防止化妝品腐敗變質(zhì)的簡(jiǎn)單有效方法是向化妝品中加入防腐劑，但是合成防腐劑往往具有一定的皮膚毒性且易誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)[38]，因而，人們傾向于以植物源防腐劑代替化學(xué)合成防腐劑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)3種常見(jiàn)的化妝品腐敗菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)均有抑菌作用，其抑菌強(qiáng)度隨提取物濃度提高而增加；其中，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較為突出，100 g·L-1提取物的抑菌圈直徑達(dá)20 mm以上。從MIC來(lái)看，桐花樹(shù)葉片多酚提取物對(duì)供試3種細(xì)菌的MIC均為25 g·L-1，大于化妝品防腐劑Bronopol的MIC。由于國(guó)家對(duì)化妝品防腐劑的使用量有嚴(yán)格規(guī)定，《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007版)規(guī)定Bronopol最大允許使用濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%[39]，均低于Bronopol對(duì)3種供試菌的MIC，對(duì)化妝品的防腐性有一定影響。因此，將具有抑菌活性的桐花樹(shù)葉片多酚提取物用于化妝品中，既可以提升化妝品的防腐性，也可降低Bronopol等化學(xué)合成防腐劑的使用量與副作用。研究結(jié)果顯示：桐花樹(shù)葉片多酚提取物可作為具有輔助防腐抑菌功能的新型酪氨酸酶抑制劑應(yīng)用于美白化妝品的研制。

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