李稼暉 劉回民 趙宏宇 劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

長(zhǎng)白山林蛙輸卵管糖蛋白R(shí)OGP-III的分離純化及鑒定

李稼暉 劉回民 趙宏宇 劉景圣

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

通過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳的粗提工藝，并將林蛙輸卵管水提液先后通過(guò)鹽析，透析，陰離子交換層析、陽(yáng)離子交換層析和葡聚糖凝膠過(guò)濾層析，獲得了一種分子量大小約為66 kD的單一蛋白，高碘酸-Schiff試劑法鑒定其為糖蛋白。經(jīng)HPLC分析，純度為97.2%，將其命名為ROGP-III，經(jīng)PNGase F糖苷肽酶處理后推測(cè)其糖含量約為17%。

林蛙油 糖蛋白 分離 純化 鑒定

輸卵管分泌的黏性糖蛋白對(duì)脊柱動(dòng)物的生殖功能有著不可替代的作用［1］。國(guó)內(nèi)外關(guān)于哺乳動(dòng)物輸卵管糖蛋白分離純化及免疫組化的研究逐漸增多［2-6］，而對(duì)林蛙輸卵管糖蛋白的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定的研究鮮有報(bào)道。

中國(guó)林蛙（Rana chensinensis），又稱雪蛤，屬于兩棲綱無(wú)尾目蛙科，主要生長(zhǎng)在我國(guó)東三省的長(zhǎng)白山、松花江等森林地區(qū)［7］。 新鮮林蛙輸卵管經(jīng)加工干制即為林蛙油，藥理作用主要有抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、鎮(zhèn)咳祛痰、抗衰老、滋陰養(yǎng)顏、調(diào)節(jié)血脂、抗缺氧、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和應(yīng)激性及抗焦慮等［8-11］。多數(shù)研究證實(shí)，林蛙油中的水溶性糖蛋白對(duì)林蛙油的功能性起到重要的作用［12-14］。但是，關(guān)于林蛙油中單一蛋白的功能研究尚無(wú)報(bào)道，而獲得單一的林蛙輸卵管糖蛋白是該研究方向的基礎(chǔ)。

蛋白質(zhì)的分離純化方法較多，但都以蛋白質(zhì)的溶解性，分子大小，帶電荷數(shù)，疏水性大小，對(duì)配體的親和特異性等差異作為理論基礎(chǔ)進(jìn)行分離［15-20］。由于林蛙輸卵管蛋白種類繁多，分子量分布較密集，且大多為黏稠的糖蛋白，許多性質(zhì)都較接近，因此在其分離純化過(guò)程中難度較高，需要多種方法結(jié)合使用。在純化策略上，整個(gè)分離純化過(guò)程應(yīng)該按照分離精確度從低到高，得率從高到低的順序進(jìn)行，以保證獲得率最高，純度最好的單一蛋白。因此，本試驗(yàn)按照粗提后先后使用硫酸銨分級(jí)鹽析，透析袋透析，離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析的結(jié)合，分離純化得到一種林蛙輸卵管糖蛋白并檢測(cè)了純度，酶法鑒定其糖基含量。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

1.1.1 原料與耗材 原料，長(zhǎng)白山地區(qū)冬眠期雌性林蛙（3-5年齡）輸卵管；柱料，DEAE Sepharose CL-6B Fast Flow 17-0709-01，CM Sepharose CL-6B Fast Flow 17-0719-01，Sephadex G-75 Superfine 17-0051-01；透析袋，截留范圍6-8 kD。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：考馬斯亮藍(lán)R250，考馬斯亮藍(lán)G250，Schiff試劑，標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，PNGase F購(gòu)于 Sigma生物公司；三羥甲基氨基甲烷、丙稀酰胺、N，N亞甲基雙丙稀酰胺、過(guò)硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、L-甘氨酸、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：蛋白層析儀AKTA prime plus，電泳儀EPS 301，低速離心機(jī) LD5-2B，高速低溫離心機(jī)FRESCO 17，手掌離心機(jī) LX-100，pH計(jì) 雷磁PHS-3C分析天平 AUY220，真空抽濾機(jī) AP-01P，金屬浴K20，真空冷凍干燥機(jī)LGJ-18S。

1.2 方法

1.2.1 水溶性蛋白的分離 采取反復(fù)凍融法提取林蛙輸卵管水溶性蛋白，使用Bradford法測(cè)定蛋白含量。經(jīng)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定最佳的方法為：取排卵前林蛙輸卵管組織用0.7%的鹽水洗去蛙血，剪成1 cm左右的小段，于0.05 mol/L PBS中浸泡12 h，使組織充分吸水膨脹，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞3次后常溫靜置提取50 min，離心取上清液。

1.2.2 單一蛋白的純化

1.2.2.1 硫酸銨分級(jí)沉淀 使用固體硫酸銨粉末沉淀粗蛋白，至溶液達(dá)到35%飽和度，充分?jǐn)嚢?0 min，4 000 r/min離心30 min，取出上清繼續(xù)加入硫酸銨，使其達(dá)到40%飽和度，再次離心，以此類推，直至不再出現(xiàn)沉淀，將不同飽和度沉淀的蛋白分裝收集。

1.2.2.2 透析 將沉淀蛋白用低濃度Tris-HCl緩沖液復(fù)溶，裝入截留范圍為6-8 kD的透析袋，于十倍體積的緩沖液中（pH 9.0的0.05 mol/L Tris-HCl）透析除鹽。重復(fù)透析3-4次，每次6 h。重復(fù)富集此步樣品，用抽真空冷凍干燥劑凍干后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 離子交換層析 用Tris-HCl緩沖液（0.02 mol/L，pH9.0）平衡DEAE-Sepharose陰離子交換柱至蛋白層析儀顯示基線平穩(wěn)，用含NaCl濃度梯度升高的Tris-HCl緩沖液分步洗脫，收集流穿峰和各洗脫峰，濃縮后用Tris-HCl緩沖液（0.02 mol/L，pH 5.5）透析。再用Tris-HCl緩沖液（0.02 mol/L，pH 6.0）平衡CM Sepharose陽(yáng)離子交換柱，加入上一步中含有目的蛋白的濃縮液，用平衡液作為流動(dòng)相，收集流穿峰。上樣過(guò)程控制流速為2 mL/min，洗脫過(guò)程為1 mL/min，下同。

1.2.2.4 凝膠過(guò)濾層析 將上一步獲得的樣品濃縮并透析調(diào)整pH至8.0，通過(guò)用PBS緩沖液（0.05 mol/L，pH8.0）平衡的Sephadex G-75 Superfine凝膠過(guò)濾柱，用含0.02 mol/L NaCl 的PBS緩沖液（0.05 mol/L，pH8.0）洗脫，用自動(dòng)收集器收集，記錄管號(hào)，并對(duì)每管中的樣品進(jìn)行蛋白組分和多糖組分測(cè)定，蛋白直接測(cè)定A280，多糖用苯酚-硫酸法處理后，檢測(cè)A490。

1.2.3 純度測(cè)定 將純化后的樣品過(guò)膜后使用Agilent 1200高效液相色譜分析其純度，條件如下：柱型號(hào)：ZORBAX 300SB-C18；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：10%-50%乙腈+0.02 mol/L Tris-HCl+0.01 mol/L NaCl，pH 7.4；流速：1 mL/min；柱溫：25℃。

1.2.4 ROGP-III的糖含量測(cè)定 將獲得的單一糖蛋白調(diào)整濃度至1 mg/mL，取4 μL樣品與4 μL1%的SDS溶液混合，90℃加熱3 min，再按順序加入8 μL 200 mmol/L Hepes（pH8.6），8 μL3.3% 的nonidet P-40，3 μL PNGase F，37℃過(guò)夜，SDS-PAGE鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 林蛙輸卵管蛋白粗提

在單因素基礎(chǔ)上，對(duì)林蛙輸卵管蛋白粗提取的正交試驗(yàn)結(jié)果如表1表2所示（均為4 g組織）。

由表可知，最優(yōu)條件為A1B2C3D3，即：固液比為1∶4，浸泡時(shí)間為12 h，反復(fù)凍融次數(shù)為3次，提取時(shí)間為50 min。

對(duì)粗提液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分別考馬斯亮藍(lán)R-250蛋白染色和高碘酸-Schiff試劑糖染色，結(jié)果如圖1所示，林蛙輸卵管蛋白多為糖蛋白。

2.2 林蛙輸卵管糖蛋白的分離純化

2.2.1 硫酸銨分級(jí)沉淀 由圖2可知，隨著硫酸銨飽和度的提高，各種蛋白被沉淀分離出來(lái)的程度不同，其中分子量約為66 kD的蛋白在硫酸銨飽和度達(dá)到60%時(shí)才有顯著沉淀，說(shuō)明此蛋白的親水性較強(qiáng)，極有可能與其糖基的存在有關(guān)。有文獻(xiàn)［21，22］證實(shí)非洲爪蟾及中華大蟾蜍輸卵管中，分子量約為66 kD的糖蛋白對(duì)其卵黃膜發(fā)育過(guò)程中受精通道的形成起著至關(guān)重要的作用，因此林蛙輸卵管中對(duì)應(yīng)分子量大小的糖蛋白是否有相似的作用是值得研究的。此外，量最高的ROGP-I及ROGP-II本實(shí)驗(yàn)室均已做過(guò)研究并命名。因此，本研究將分子量約為66 kD的蛋白作為純化的目的蛋白。

2.2.2 陰離子交換層析 將含有目的蛋白的硫酸銨沉淀復(fù)溶，經(jīng)透析除鹽后，用含不同濃度NaCl的緩沖液洗脫圖譜如圖3所示，其中P1峰為流穿峰，P2為0.5 mol/L NaCl洗脫，P3為1 mol/L NaCl洗脫，P4為1.5 mol/L NaCl洗脫。由SDS-PAGE電泳鑒定（圖4），目標(biāo)蛋白主要存在P4峰中，目標(biāo)蛋白在經(jīng)過(guò)DEAE-Sepharose離子交換層析后純度大幅度提高。

2.2.3 陽(yáng)離子交換層析 將上述樣品濃縮透析后經(jīng)CM Sepharose陽(yáng)離子交換層析柱，收集流穿峰，濃縮透析后SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖5）顯示，分子量約為112 kD的雜蛋白基本被完全除去，44 kD到66 kD之間的雜蛋白含量也顯著降低。約42 kD的雜蛋白含量仍較高，將進(jìn)一步使用Sephadex G-75 Superfine進(jìn)行純化。

2.2.4 葡聚糖凝膠過(guò)濾層析及糖蛋白鑒定 圖6可以看出，P1的糖峰與蛋白峰重疊。P1經(jīng)SDS-PAGE電泳分析（圖7），可以看出目的蛋白存在P1峰中，結(jié)合圖1可以確定該蛋白為糖蛋白。經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)，其純度為97.2%，由此可知，目的蛋白已經(jīng)得到了良好的分離純化，將其命名為ROGP-III。

2.3 ROGP-III的含糖量測(cè)定 將經(jīng)過(guò)PNGase F處理的純品ROGP-III進(jìn)行SDS-PAGE電泳（圖8），其分子量由約66 kD下降至約55 kD，由此初步認(rèn)為其糖鏈的分子量約為總分子量的17%。

3 結(jié)論

林蛙輸卵管組織經(jīng)反復(fù)凍融法粗提的總蛋白，先后使用硫酸銨分級(jí)鹽析，透析袋透析，DEAESepharose陰離子交換層析，CM Sepharose 陽(yáng)離子交換層析，Sephadex G-75 凝膠過(guò)濾層析，獲得了分子量約為66 kD的單一蛋白R(shí)OGP-III，經(jīng)高碘酸-Schiff試劑糖染色及凝膠過(guò)濾層析過(guò)程中苯酚-硫酸法測(cè)得的糖與蛋白吸光度重疊峰鑒定為糖蛋白，經(jīng)HPLC分析其純度為97.2%，酶法測(cè)定了其糖鏈含量約為17%。

將進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行動(dòng)物食用功能性試驗(yàn)，對(duì)受精作用影響研究，N端氨基酸測(cè)序以及氨基酸組分測(cè)定，調(diào)取其基因并克隆表達(dá)，開展對(duì)林蛙油的分子生物學(xué)研究。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Separation and Identification of Oviduct Glycoprotein ROGP-III from Rana chensinensis

Li Jiahui1Liu Huimin Zhao Hongyu Liu Jingsheng
（College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University，Changchun 130118）

To study the function of the single glycoprotein in Rana chensinensis, this research determined the best coarse extraction process by orthogonal test, then purified a 66 kD single protein by salting out, dialysis, ion-exchange column chromatography and gel filtration chromatography. The purified protein identified as glycoprotein by PAS test. By HPLC identification, its purity is 97.2%, named as ROGP-III, after enzymolysis by PNGase F, it speculated that the polysaccharide content is about 17%.

Oviducts Rana Glycoprotein Separation Purification Identification

2013-09-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30671536）

李稼暉，男，碩士，研究方向：食品生物化學(xué)與功能性食品；E-mail：lijiahuizml@gmail.com

劉景圣，男，博士，教授，研究方向：功能性食品；E-mail：liujs1007@vip.sina.com