張明哲陳曦徐俊鋒陳吳健吳蓉吳志毅

（1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，杭州 310016；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學研究院，杭州 310021；3.杭州出入境檢驗檢疫局，杭州 310012）

環(huán)介導等溫擴增技術在轉(zhuǎn)基因水稻Bt63檢測中的應用

張明哲1陳曦1徐俊鋒2陳吳健1吳蓉3吳志毅1

（1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，杭州 310016；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學研究院，杭州 310021；3.杭州出入境檢驗檢疫局，杭州 310012）

采用環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）對轉(zhuǎn)基因水稻Bt63進行應用檢測。研究表明，環(huán)介導等溫擴增技術檢測轉(zhuǎn)基因水稻Bt63特異性好，并且靈敏度達到0.01%（W/W），具有簡便、快速、準確等特點，可以在進出口檢驗檢疫、食品安全監(jiān)測等領域進行應用。

環(huán)介導等溫擴增技術 轉(zhuǎn)基因水稻Bt63 檢測

近年來，世界上轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)工作進展非常迅速，2012年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達到1.703× 108hm2，比2011年的1.6×108hm2增長了6%，較1996年增長了100倍［1］。隨著轉(zhuǎn)基因作物已被快速、持續(xù)地用于商業(yè)化生產(chǎn)，無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家都產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟、能源、衛(wèi)生及社會效益。但同時，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品可能帶來的環(huán)境、健康等問題也已引起世界性的所謂“生物安全”的論戰(zhàn)。為此，許多國家相繼制定了對轉(zhuǎn)基因生物的管理法規(guī)，對進口轉(zhuǎn)基因食品進行嚴格管理，要求出具轉(zhuǎn)基因成分的檢測報告，對轉(zhuǎn)基因食品采用標識制度。我國于2001年5月23日頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，2001年9月5日開始實施《出入境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗檢疫管理辦法》，2002年3月20日開始貫徹實行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標識管理辦法》。

隨著各個國家對農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實行檢驗檢疫和標識制度管理的加強，轉(zhuǎn)基因檢測的對象已經(jīng)從原來的大豆、小麥、大米、土豆等農(nóng)產(chǎn)品擴展到許多深加工的產(chǎn)品，如食用油脂、米制品、醬油、豆奶、酒、飼料等等，而這其中米制品一直是歐盟和其他一些國家關注的重點。2006年9月以來，已有法國、德國、意大利、奧地利和日本等7個國家因為轉(zhuǎn)基因大米污染對我國出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施。歐盟在2008年4月15日起對中國出口的大米及其米制品采取保障性措施，要求由中方認可的實驗室對出口產(chǎn)品實施檢測，并出具統(tǒng)一的衛(wèi)生證書才能出口。而另一方面，我國對轉(zhuǎn)基因作物培育的投入也逐年增加，近年來具有良好生長性能的轉(zhuǎn)基因新品種不斷涌現(xiàn)，2009年農(nóng)業(yè)部審放了轉(zhuǎn)基因耐除草劑水稻“Bt汕優(yōu)63”等三個轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的生產(chǎn)應用安全證書，這標志著我國極有可能成為世界上第一個商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因水稻的國家，因此如何快速便捷的檢測轉(zhuǎn)基因水稻已成為了當前熱門的研究課題之一。

環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由Notomi 等［2］發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該方法采用特異地識別靶序列上6個區(qū)域的4條引物（2 條外引物，2 條內(nèi)引物）及具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，在65℃左右進行核酸的指數(shù)級擴增，其擴增效率可達到109-1010個拷貝數(shù)量級。LAMP反應步驟可分為2個部分—啞鈴狀模板構造的形成（圖1-A）與循環(huán)擴增（圖1-B）。如圖1-A所示，在65℃左右時，F(xiàn)IP引物在Bst酶作用下以F2 區(qū)段的3'末端為起點，與模板DNA互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成。F3引物與F2c前端F3c序列互補，以3'末端為起點，通過鏈置換型DNA聚合酶的作用，一邊置換先頭FIP 引物合成的DNA鏈，一邊合成自身DNA，如此向前延伸。最終F3引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進行鏈置換產(chǎn)生一單鏈，這條單鏈在5'末端存在互補的F1c和F1區(qū)段，于是發(fā)生自我堿基配對，形成單邊環(huán)狀結構。同時這條單鏈DNA，又可作為模板，在另一端結合BIP引物和B3引物合成一條雙鏈，并置換出一條單鏈DNA。此時，被置換的單鏈DNA兩端都存在互補序列，自我堿基配對后整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀構造（圖1-A）。上述過程中最后形成的啞鈴狀模板構造是循環(huán)反應的原料（圖1-B）。在循環(huán)反應中，首先在啞鈴狀結構中，以3'末端的F1區(qū)段為起點，以自身為模板，進行DNA 合成延伸。與此同時，F(xiàn)IP 引物F2 與環(huán)上單鏈F2c 雜交，啟動新一輪鏈置換反應。解離由F1 區(qū)段合成的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結構。在環(huán)狀結構上存在單鏈形式B2c，BIP 引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增。最終形成如花椰菜樣的莖-環(huán)結構DNA組成的混合物，即由在同一條鏈上互補序列周而復始形成大小不一的結構。整個反應僅需1 h，具有簡便、快速、準確等特點。LAMP法廣泛應用于包括病毒［3-5］、細菌［6-8］等傳染性疾病的定性和定量檢測。近年來，該技術逐漸開始用于轉(zhuǎn)基因作物檢測領域，如柳毅等［9］用于檢測轉(zhuǎn)基因大豆，張雋等［10］檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON863，以及凌莉等［11］檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR602等一些報道，但用于轉(zhuǎn)基因水稻檢測的應用較少，本研究就是準備采用LAMP法對轉(zhuǎn)基因水稻Bt63進行快速檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 轉(zhuǎn)基因樣品 轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt汕優(yōu)63（簡稱Bt63）、科豐6號（KF6）、克螟稻（KMD1）為浙江省農(nóng)業(yè)科學研究院饋贈；轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt176，轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2，轉(zhuǎn)基因油菜籽品系GT73均購自歐洲標準局（IRMM）；非轉(zhuǎn)基因水稻則購自國內(nèi)市場。

1.1.2 材料制備 將轉(zhuǎn)基因水稻Bt 63研磨（PHILIPS cucina blender HR2860）至粉末狀（0.2 mm左右），并按表1比例混合轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的材料，分別獲得50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%和0.001%含量的轉(zhuǎn)基因樣品。

1.1.3 儀器 OptiGene Limited GenieⅡ等溫擴增檢測系統(tǒng)（英國OptiGenie Limited 公司）；Sorvall micro21R臺式冷凍離心機（Thermo）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；XS104 電子天平（Mettler Toledo）；Nano Drop 3300核酸測定儀（Thermo）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore）等。

1.1.4 試劑 DNA提取試劑盒為QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit試劑盒；引物由寶生物工程（大連）有限公司（TAKARA）合成；擴增試劑來自于英國OptiGenie Limited 公司，熒光顯色試劑來自于北京藍譜生物科技有限公司，其它分析純試劑購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取都使用QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit試劑盒進行，DNA濃度由核酸測定儀（Nano Drop 3300）檢測得到。

1.2.2 引物設計 根據(jù)GenBank及相關文獻資料我們獲得了轉(zhuǎn)基因水稻Bt63轉(zhuǎn)化體特異性序列，再根據(jù)網(wǎng)上軟件工具Primer Explorer V4（http：// primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html） 設 計 選 擇LAMP引物。由于涉及到專利和知識產(chǎn)權保護，引物序列在本文中不公開。

1.2.3 LAMP擴增 LAMP 反應體系與反應條件：25 μL體系內(nèi)反應各組分終濃度為：內(nèi)引物FIP和BIP 各0.8 μmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，dNTPs 400 μmol/L，1× ThermoPol Reaction Buffer，加入模板DNA后，95℃加熱5 min后冰上冷卻，再加入 Bst DNA 聚合酶大片段8 U。LAMP 反應條件：將LAMP 反應體系迅速置于63℃溫度下反應1 h后，終止反應。如果進行熒光顯色反應，在反應前加放入顯色反應液，若是陽性擴增，在紫外光下則會發(fā)出熒光，若是陰性擴增，在紫外光下則不會發(fā)光。

2 結果

2.1 特異性驗證

分別用LAMP體系對不同的作物進行了反應，紫外檢測結果如圖2所示。在紫外光下，只有6號和P號的管子中有熒光產(chǎn)生，其余均為陰性。其中6號為轉(zhuǎn)基因水稻Bt63，P為陽性對照，而其它的轉(zhuǎn)基因作物和陰性對照都沒有擴增，說明LAMP的特異性很好，同時GenieⅡ的擴增結果也證明了這點（圖3）。

2.2 靈敏度試驗

為驗證LAMP檢測轉(zhuǎn)基因水稻Bt63方法的靈敏度，分別配制含有轉(zhuǎn)基因水稻Bt63 50%、10%、5%、1%、0.1%和0.01%的百分比濃度樣品，模板量為50 ng，擴增結果如圖4、圖5所示。0.01%濃度的轉(zhuǎn)基因檢測都有陽性信號出現(xiàn)，而0.001%濃度的轉(zhuǎn)基因檢測無陽性信號出現(xiàn)。3次重復檢測顯示，0.01%濃度的檢測結果基本穩(wěn)定，因此認為本試驗中LAMP檢測轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的靈敏度為0.01%。

3 討論

雖然目前檢測轉(zhuǎn)基因作物有多種方法，包括蛋白質(zhì)類相關檢測技術［12，13］、化學物質(zhì)指紋圖譜檢測技術以及核酸類檢測相關技術［14-17］，但是由于試劑成本與制備時間等原因，核酸類檢測技術應用更加廣泛。PCR 和熒光 PCR 法仍然是最常用以及最適用的檢測轉(zhuǎn)基因食品的方法［18-22］，國內(nèi)眾多行業(yè)標準與國家標準均是以 PCR 或熒光定量 PCR 作為技術平臺。但是普通 PCR 法需要進行凝膠電泳，操作繁瑣且容易污染，而熒光定量 PCR 雖然檢測靈敏度高、重復性較好，但是該方法用到的儀器和試劑都很昂貴，難以適應日益普及和多元化發(fā)展的檢測需求。

本研究建立的環(huán)介導等溫核酸擴增法檢測轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的方法，同PCR 技術相比具有較大優(yōu)勢：（1）操作簡便，反應不需要復雜的儀器，只需一個維持恒定溫度的金屬加熱塊或者水浴鍋就能反應；（2）快速高效，檢測靈敏度高，整個擴增1 h 即可完成，如果在反應中加入環(huán)狀引物還可以促進擴增，減少反應時間；（3）特異性高，該技術由4 條引物擴增靶序列的6個區(qū)段，具有高度特異性，不易出現(xiàn)假陽性結果；（4）反應整個過程可以閉管操作，可以從源頭上控制氣溶膠污染。因此，LAMP技術檢測轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的方法具有靈敏度高、特異性好，操作簡便、快速等特點，可以在進出口檢驗檢疫、食品安全監(jiān)測等領域進行應用。

4 結論

采用環(huán)介導等溫擴增技術對轉(zhuǎn)基因水稻Bt63進行應用檢測。該方法特異性好，并且靈敏度達到0.01%（W/W），具有簡便、快速、準確等特點。

［1］ Clive J. 2012年全球生物技術/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢［J］.中國生物工程雜志, 2013, 3（2）：1-8.

［2］ Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］. Nucleic Acids Res, 2000, 28（12）：63.

［3］ Yoshikawa T, Ihira M, Akimoto S, et al. Detection of human herpesvirus 7 DNA by loop-mediated isothermal amplification［J］. J Clin Micobiology, 2004, 42（3）：1348-1352.

［4］ Mori N, Motegi Y, Shimamura Y, et al. Development of a new method for diagnosis of Rubella virusiinfection by reverse transcription-loopmediated isothermal amplification［J］. J Clin Micobiology, 2004, 44（9）：3268-3273.

［5］ Parida MM, Santhosh SR, Dash PK, et al. Development and evaluation of reverse transcription loop mediated isothermal amplification assay for rapid and real -time detection of Japanese encephalitis virus［J］. J Clin Micobiology, 2006, 44（11）：4172-4178.

［6］ Hara-Kudo Y, Yoshino M, Kojima T, et al. Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Salmonella［J］. FEMS Microbiology Letters, 2005, 25：155-161.

［7］ Seki M, Yamashita Y, Torigoe H, et al. Loop-mediated isothermal amplification method targeting the lytA gene for detection of Streptococcus pneumoniae［J］. J Clin Micobiology, 2005, 43（4）：1581-1586.

［8］ Song TY, Toma C, Nakasone N, et al. Sensitive and rapid detection of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli by a loop-mediated isothermal amplification method［J］. FEMS Microbiology Letters, 2005, 243：259-263.

［9］ 柳毅, 張軍方, 張會彥, 等. 改良環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測轉(zhuǎn)基因大豆［J］. 大豆科學, 2009, 28（4）：706-710.

［10］ 張雋, 李志勇, 葉宇鑫, 等. 環(huán)介導等溫擴增法檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON89034［J］.現(xiàn)代食品科技, 2012, 28（4）：469-472.

［11］ 凌莉, 劉津, 易敏英, 等. 環(huán)介導等溫擴增法檢測轉(zhuǎn)基因玉米MIR604［J］. 食品科技, 2012, 37（12）：305-310.

［12］ Margarit E, Reggiardo M, Vallejos R, et al.Detection of BT transgenic maize in foodstuffs［J］.Food Research International, 2006, 39：250-255.

［13］ 敬凌霞, 蔡雪飛, 慕生枝, 等.抗CP4-EPSPS 單克隆抗體的制備和生物學特性的鑒定［J］.細胞與分子免疫學雜志, 2007, 23（5）：457-459.

［14］ Zhang M, Gao X, Yu Y, et al. Detection of roundup ready soyin highly processed products by triplex nested PCR［J］.Food Control, 2007, 18（10）：1277-1281.

［15］ Salvi S, Dorso F, Morelli G. Detection and quantification of genetically modified organisms using very short, locked nucleic acid TaqMan probes［J］.J Agric Food Chem, 2008, 56（12）：4320-4327.

［16］ Liu M, Luo Y, Tao R, et al. Sensitive and rapid detection of genetic modified soybean（Roundup Ready）by loop-mediated isothermal amplification［J］.Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73（11）：2365-2369.

［17］ Guan X, Guo J, Shen P, et al. Visual and rapid detection of two genetically modified soybean events using loop-mediated isothermal amplification method［J］.Food Analytical Methods, 2010, 1936-9751：1-8.

［18］ Gachet E, Martin GG, Vigeau F, et al.Derection of genetically modified organisms（GMOs）by PCR：a brief review of methodologies available［J］.Trends Food Science&Technology, 1999, 9：380-388.

［19］ 邱良焱, 肖有玉, 劉佳, 等.多重PCR法檢測轉(zhuǎn)Bar、Bt基因雙抗稻米［J］.食品科學, 2013, 34（6）：139-142.

［20］ 王媛, 葛毅強, 陳穎, 等.大豆加工食品中轉(zhuǎn)基因成分多重PCR檢測體系的建立［J］.食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30（10）：117-121.

［21］ 吳志毅, 張明哲, 陳曦. 大米和米制品Bt63轉(zhuǎn)基因檢測PCR方法的靈敏度研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學, 2009, 21（6）：549-554.

［22］ Ding JY, Jia JW, Yang LT, et al.Validation of a rice specific gene, sucrose phosphate synthase, used as the endogenous reference gene for qualitative and real-time quantitative PCR detection of transgenes［J］. J Agric Food Chem, 2004, 52（11）：3372-3377.

（責任編輯 狄艷紅）

Specific Detection of Genetically Modified Rice Bt63 Using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Zhang Mingzhe1Chen Xi1Xu Junfeng2Chen Wujian1Wu Rong3Wu Zhiyi1
（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine，Hangzhou 310016；2. Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021；3. Hangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 310012）

It focused on the specific detection of genetically modified rice Bt63 using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）. The LAMP could effectively detect genetically modified rice Bt63 with high specificity and the sensitivity limit is 0.01%（W/W）. LAMP is a rapid and accurate method and would be applied to inspection, quarantine and food safety.

Loop-mediated isothermal amplification Genetically modified rice Bt63 Detection

2013-09-06

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2011IK249），浙江省科技廳公益性項目（2011C22065），浙江省科 技廳重大專項（2011C12023），浙江出入境檢驗檢疫局科研項目（ZK200958）

張明哲，男，高級農(nóng)藝師，研究方向：分子生物學和植物檢疫；E-mail：mzzhang429@163.com