張明哲陳曦徐俊鋒陳吳健吳蓉吳志毅

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，杭州 310016；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310021；3.杭州出入境檢驗(yàn)檢疫局，杭州 310012）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在轉(zhuǎn)基因水稻Bt63檢測(cè)中的應(yīng)用

張明哲1陳曦1徐俊鋒2陳吳健1吳蓉3吳志毅1

（1.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，杭州 310016；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310021；3.杭州出入境檢驗(yàn)檢疫局，杭州 310012）

采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63進(jìn)行應(yīng)用檢測(cè)。研究表明，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63特異性好，并且靈敏度達(dá)到0.01%（W/W），具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以在進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 轉(zhuǎn)基因水稻Bt63 檢測(cè)

近年來(lái)，世界上轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)工作進(jìn)展非常迅速，2012年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.703× 108hm2，比2011年的1.6×108hm2增長(zhǎng)了6%，較1996年增長(zhǎng)了100倍［1］。隨著轉(zhuǎn)基因作物已被快速、持續(xù)地用于商業(yè)化生產(chǎn)，無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家都產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)、能源、衛(wèi)生及社會(huì)效益。但同時(shí)，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品可能帶來(lái)的環(huán)境、健康等問(wèn)題也已引起世界性的所謂“生物安全”的論戰(zhàn)。為此，許多國(guó)家相繼制定了對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的管理法規(guī)，對(duì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行嚴(yán)格管理，要求出具轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)報(bào)告，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品采用標(biāo)識(shí)制度。我國(guó)于2001年5月23日頒布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，2001年9月5日開始實(shí)施《出入境轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫管理辦法》，2002年3月20日開始貫徹實(shí)行《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》。

隨著各個(gè)國(guó)家對(duì)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物實(shí)行檢驗(yàn)檢疫和標(biāo)識(shí)制度管理的加強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的對(duì)象已經(jīng)從原來(lái)的大豆、小麥、大米、土豆等農(nóng)產(chǎn)品擴(kuò)展到許多深加工的產(chǎn)品，如食用油脂、米制品、醬油、豆奶、酒、飼料等等，而這其中米制品一直是歐盟和其他一些國(guó)家關(guān)注的重點(diǎn)。2006年9月以來(lái)，已有法國(guó)、德國(guó)、意大利、奧地利和日本等7個(gè)國(guó)家因?yàn)檗D(zhuǎn)基因大米污染對(duì)我國(guó)出口米制品采取了拒絕入境或撤架、召回等措施。歐盟在2008年4月15日起對(duì)中國(guó)出口的大米及其米制品采取保障性措施，要求由中方認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室對(duì)出口產(chǎn)品實(shí)施檢測(cè)，并出具統(tǒng)一的衛(wèi)生證書才能出口。而另一方面，我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物培育的投入也逐年增加，近年來(lái)具有良好生長(zhǎng)性能的轉(zhuǎn)基因新品種不斷涌現(xiàn)，2009年農(nóng)業(yè)部審放了轉(zhuǎn)基因耐除草劑水稻“Bt汕優(yōu)63”等三個(gè)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，這標(biāo)志著我國(guó)極有可能成為世界上第一個(gè)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因水稻的國(guó)家，因此如何快速便捷的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻已成為了當(dāng)前熱門的研究課題之一。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由Notomi 等［2］發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。該方法采用特異地識(shí)別靶序列上6個(gè)區(qū)域的4條引物（2 條外引物，2 條內(nèi)引物）及具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶，在65℃左右進(jìn)行核酸的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率可達(dá)到109-1010個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)。LAMP反應(yīng)步驟可分為2個(gè)部分—啞鈴狀模板構(gòu)造的形成（圖1-A）與循環(huán)擴(kuò)增（圖1-B）。如圖1-A所示，在65℃左右時(shí)，F(xiàn)IP引物在Bst酶作用下以F2 區(qū)段的3'末端為起點(diǎn)，與模板DNA互補(bǔ)序列配對(duì)，啟動(dòng)鏈置換DNA合成。F3引物與F2c前端F3c序列互補(bǔ)，以3'末端為起點(diǎn)，通過(guò)鏈置換型DNA聚合酶的作用，一邊置換先頭FIP 引物合成的DNA鏈，一邊合成自身DNA，如此向前延伸。最終F3引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進(jìn)行鏈置換產(chǎn)生一單鏈，這條單鏈在5'末端存在互補(bǔ)的F1c和F1區(qū)段，于是發(fā)生自我堿基配對(duì)，形成單邊環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí)這條單鏈DNA，又可作為模板，在另一端結(jié)合BIP引物和B3引物合成一條雙鏈，并置換出一條單鏈DNA。此時(shí)，被置換的單鏈DNA兩端都存在互補(bǔ)序列，自我堿基配對(duì)后整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀構(gòu)造（圖1-A）。上述過(guò)程中最后形成的啞鈴狀模板構(gòu)造是循環(huán)反應(yīng)的原料（圖1-B）。在循環(huán)反應(yīng)中，首先在啞鈴狀結(jié)構(gòu)中，以3'末端的F1區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板，進(jìn)行DNA 合成延伸。與此同時(shí)，F(xiàn)IP 引物F2 與環(huán)上單鏈F2c 雜交，啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng)。解離由F1 區(qū)段合成的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在環(huán)狀結(jié)構(gòu)上存在單鏈形式B2c，BIP 引物上的B2與其雜交，啟動(dòng)新一輪擴(kuò)增。最終形成如花椰菜樣的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)DNA組成的混合物，即由在同一條鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)。整個(gè)反應(yīng)僅需1 h，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。LAMP法廣泛應(yīng)用于包括病毒［3-5］、細(xì)菌［6-8］等傳染性疾病的定性和定量檢測(cè)。近年來(lái)，該技術(shù)逐漸開始用于轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)領(lǐng)域，如柳毅等［9］用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆，張雋等［10］檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON863，以及凌莉等［11］檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MIR602等一些報(bào)道，但用于轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)的應(yīng)用較少，本研究就是準(zhǔn)備采用LAMP法對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63進(jìn)行快速檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 轉(zhuǎn)基因樣品 轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt汕優(yōu)63（簡(jiǎn)稱Bt63）、科豐6號(hào)（KF6）、克螟稻（KMD1）為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院饋贈(zèng)；轉(zhuǎn)基因玉米品系Bt176，轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS-40-3-2，轉(zhuǎn)基因油菜籽品系GT73均購(gòu)自歐洲標(biāo)準(zhǔn)局（IRMM）；非轉(zhuǎn)基因水稻則購(gòu)自國(guó)內(nèi)市場(chǎng)。

1.1.2 材料制備 將轉(zhuǎn)基因水稻Bt 63研磨（PHILIPS cucina blender HR2860）至粉末狀（0.2 mm左右），并按表1比例混合轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的材料，分別獲得50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%和0.001%含量的轉(zhuǎn)基因樣品。

1.1.3 儀器 OptiGene Limited GenieⅡ等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（英國(guó)OptiGenie Limited 公司）；Sorvall micro21R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Thermo）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）；XS104 電子天平（Mettler Toledo）；Nano Drop 3300核酸測(cè)定儀（Thermo）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore）等。

1.1.4 試劑 DNA提取試劑盒為QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit試劑盒；引物由寶生物工程（大連）有限公司（TAKARA）合成；擴(kuò)增試劑來(lái)自于英國(guó)OptiGenie Limited 公司，熒光顯色試劑來(lái)自于北京藍(lán)譜生物科技有限公司，其它分析純?cè)噭┵?gòu)于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 DNA提取都使用QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit試劑盒進(jìn)行，DNA濃度由核酸測(cè)定儀（Nano Drop 3300）檢測(cè)得到。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank及相關(guān)文獻(xiàn)資料我們獲得了轉(zhuǎn)基因水稻Bt63轉(zhuǎn)化體特異性序列，再根據(jù)網(wǎng)上軟件工具Primer Explorer V4（http：// primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html） 設(shè) 計(jì) 選 擇LAMP引物。由于涉及到專利和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)，引物序列在本文中不公開。

1.2.3 LAMP擴(kuò)增 LAMP 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件：25 μL體系內(nèi)反應(yīng)各組分終濃度為：內(nèi)引物FIP和BIP 各0.8 μmol/L，外引物F3和B3各0.2 μmol/L，dNTPs 400 μmol/L，1× ThermoPol Reaction Buffer，加入模板DNA后，95℃加熱5 min后冰上冷卻，再加入 Bst DNA 聚合酶大片段8 U。LAMP 反應(yīng)條件：將LAMP 反應(yīng)體系迅速置于63℃溫度下反應(yīng)1 h后，終止反應(yīng)。如果進(jìn)行熒光顯色反應(yīng)，在反應(yīng)前加放入顯色反應(yīng)液，若是陽(yáng)性擴(kuò)增，在紫外光下則會(huì)發(fā)出熒光，若是陰性擴(kuò)增，在紫外光下則不會(huì)發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 特異性驗(yàn)證

分別用LAMP體系對(duì)不同的作物進(jìn)行了反應(yīng)，紫外檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。在紫外光下，只有6號(hào)和P號(hào)的管子中有熒光產(chǎn)生，其余均為陰性。其中6號(hào)為轉(zhuǎn)基因水稻Bt63，P為陽(yáng)性對(duì)照，而其它的轉(zhuǎn)基因作物和陰性對(duì)照都沒有擴(kuò)增，說(shuō)明LAMP的特異性很好，同時(shí)GenieⅡ的擴(kuò)增結(jié)果也證明了這點(diǎn)（圖3）。

2.2 靈敏度試驗(yàn)

為驗(yàn)證LAMP檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63方法的靈敏度，分別配制含有轉(zhuǎn)基因水稻Bt63 50%、10%、5%、1%、0.1%和0.01%的百分比濃度樣品，模板量為50 ng，擴(kuò)增結(jié)果如圖4、圖5所示。0.01%濃度的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)都有陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，而0.001%濃度的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)無(wú)陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)。3次重復(fù)檢測(cè)顯示，0.01%濃度的檢測(cè)結(jié)果基本穩(wěn)定，因此認(rèn)為本試驗(yàn)中LAMP檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的靈敏度為0.01%。

3 討論

雖然目前檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物有多種方法，包括蛋白質(zhì)類相關(guān)檢測(cè)技術(shù)［12，13］、化學(xué)物質(zhì)指紋圖譜檢測(cè)技術(shù)以及核酸類檢測(cè)相關(guān)技術(shù)［14-17］，但是由于試劑成本與制備時(shí)間等原因，核酸類檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用更加廣泛。PCR 和熒光 PCR 法仍然是最常用以及最適用的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品的方法［18-22］，國(guó)內(nèi)眾多行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)均是以 PCR 或熒光定量 PCR 作為技術(shù)平臺(tái)。但是普通 PCR 法需要進(jìn)行凝膠電泳，操作繁瑣且容易污染，而熒光定量 PCR 雖然檢測(cè)靈敏度高、重復(fù)性較好，但是該方法用到的儀器和試劑都很昂貴，難以適應(yīng)日益普及和多元化發(fā)展的檢測(cè)需求。

本研究建立的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的方法，同PCR 技術(shù)相比具有較大優(yōu)勢(shì)：（1）操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)不需要復(fù)雜的儀器，只需一個(gè)維持恒定溫度的金屬加熱塊或者水浴鍋就能反應(yīng)；（2）快速高效，檢測(cè)靈敏度高，整個(gè)擴(kuò)增1 h 即可完成，如果在反應(yīng)中加入環(huán)狀引物還可以促進(jìn)擴(kuò)增，減少反應(yīng)時(shí)間；（3）特異性高，該技術(shù)由4 條引物擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)段，具有高度特異性，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；（4）反應(yīng)整個(gè)過(guò)程可以閉管操作，可以從源頭上控制氣溶膠污染。因此，LAMP技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的方法具有靈敏度高、特異性好，操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，可以在進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用。

4 結(jié)論

采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻Bt63進(jìn)行應(yīng)用檢測(cè)。該方法特異性好，并且靈敏度達(dá)到0.01%（W/W），具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Specific Detection of Genetically Modified Rice Bt63 Using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Zhang Mingzhe1Chen Xi1Xu Junfeng2Chen Wujian1Wu Rong3Wu Zhiyi1
（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine，Hangzhou 310016；2. Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021；3. Hangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 310012）

It focused on the specific detection of genetically modified rice Bt63 using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）. The LAMP could effectively detect genetically modified rice Bt63 with high specificity and the sensitivity limit is 0.01%（W/W）. LAMP is a rapid and accurate method and would be applied to inspection, quarantine and food safety.

Loop-mediated isothermal amplification Genetically modified rice Bt63 Detection

2013-09-06

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011IK249），浙江省科技廳公益性項(xiàng)目（2011C22065），浙江省科 技廳重大專項(xiàng)（2011C12023），浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（ZK200958）

張明哲，男，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向：分子生物學(xué)和植物檢疫；E-mail：mzzhang429@163.com