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        電化學(xué)納米免疫傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用展望

        2014-04-08 22:44:00魯丁強(qiáng)龐廣昌
        食品科學(xué) 2014年8期
        關(guān)鍵詞:生物檢測

        魯丁強(qiáng),龐廣昌

        電化學(xué)納米免疫傳感器在食品安全檢測中的應(yīng)用展望

        魯丁強(qiáng),龐廣昌*

        (天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

        電化學(xué)納米免疫傳感器具有檢測快速、靈敏、操作簡單等優(yōu)點(diǎn),在醫(yī)藥、食品、環(huán)境及生命科學(xué)等領(lǐng)域顯示了巨大的應(yīng)用潛力。本文分析比較了電化學(xué)納米免疫傳感器與分析化學(xué)儀器檢測、免疫檢測、以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)測定技術(shù)和基于表面等離子共振、生物薄膜干涉技術(shù)的檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn),討論了電化學(xué)納米免疫傳感器本身所面臨的免疫結(jié)合信號放大處理和商業(yè)化應(yīng)用的兩個(gè)關(guān)鍵問題,最后,概述了納米材料在免疫傳感器中的應(yīng)用及電化學(xué)納米免疫傳感器在食品檢測中的應(yīng)用并對其在食品檢測領(lǐng)域的未來發(fā)展作了展望。

        電化學(xué);納米材料;免疫傳感器;食品檢測;抗體

        隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,食品安全檢測技術(shù)已經(jīng)取得了舉世矚目的成就,但是現(xiàn)有的檢測方法大多集中在分析化學(xué)儀器檢測、免疫檢測、以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)測定技術(shù)等方面。其中化學(xué)測定除對儀器設(shè)備的依賴性很大外,因其選擇性不強(qiáng),往往需要對原始樣本進(jìn)行預(yù)處理,從而限制了這些方法的廣泛使用。而PCR方法的靈敏度高,特異性強(qiáng),但需要對靶分子進(jìn)行級聯(lián)放大后才能檢測,耗時(shí)較長,而且難以實(shí)現(xiàn)真正意義上的定量測定。傳統(tǒng)的免疫測定方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、不需要對原始樣本進(jìn)行特殊處理,但是本質(zhì)上屬于定性或半定量方法,而且不能實(shí)現(xiàn)在線或即時(shí)檢測。生物傳感器方法具有特異性強(qiáng)、定量、可以即時(shí)和在線檢測等優(yōu)點(diǎn),但是除酶傳感器以外,大多數(shù)還停留在研究階段。盡管基于表面等離子共振(surface plasmon resonance,SPR)和生物薄膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技術(shù)的儀器已經(jīng)上市,但是要真正用于食品安全檢測尚需努力,而且其相應(yīng)的儀器設(shè)備精密度和成本偏高,難以適應(yīng)真正意義上的定量測定,特別是快速和在線檢測。電化學(xué)免疫傳感器是基于抗原與抗體的反應(yīng)進(jìn)行特異性的半定量或者定量測定的一種以與電化學(xué)的傳感單元直接接觸的抗體或者抗原作為分子識別單元,而且通過傳感單元把化學(xué)物質(zhì)的濃度信號轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號的自給式集成元件[1],通過納米材料及酶等的信號放大作用,具有特異性強(qiáng)、種類多、測試耗費(fèi)低、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、適用面寬等特點(diǎn)。在食品檢測、基礎(chǔ)和應(yīng)用電化學(xué)研究、環(huán)境分析、材料分析及醫(yī)療分析與診斷等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。

        1 生物傳感器概述

        生物傳感器由于其識別元件是酶、受體、抗體等具有特異性識別能力的生物大分子,所以其特異性識別作用或快速催化作用的特點(diǎn)恰恰可以滿足快速、特異性,能夠?qū)崿F(xiàn)即時(shí)和在線檢測的要求。目前,國內(nèi)外在生物傳感器的研究方面都投入了大量的精力。例如利用酶的識別作用研制出可以檢測乙醇、乳糖、蔗糖、乳酸等食品成分的酶生物傳感器。同時(shí)還有檢測甲醇、甲醛等可用于安全檢測的酶傳感器。生物傳感器最活躍的一個(gè)領(lǐng)域應(yīng)該數(shù)免疫傳感器的研究。免疫傳感器的特異性識別分子是抗體,從理論上講,所有可以作為抗原的生物大分子,如蛋白質(zhì)、微生物等,以及作為半抗原的化合物,如抗生素、激素、毒素、農(nóng)藥等都可以制備其特異性的識別抗體,從而實(shí)現(xiàn)特異性、快速、即時(shí)和在線檢測。廣義的免疫傳感器包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、放射免疫技術(shù)和免疫膠體金試紙條技術(shù)。事實(shí)上,這方面的研究與成果已經(jīng)得到了極其廣泛的應(yīng)用。但是由于ELISA和試紙條技術(shù)實(shí)際上只能進(jìn)行定性或半定量檢測,再加上數(shù)據(jù)處理和加樣方式的限制,要實(shí)現(xiàn)即時(shí)、準(zhǔn)確定量和在線檢測幾乎是不可能的。所以免疫傳感器的研究更多地集中在如何準(zhǔn)確定量測定到抗原抗體結(jié)合的信號變化及其處理方面。根據(jù)其信號轉(zhuǎn)換方法,免疫傳感器大致分為4類:電化學(xué)、光學(xué)、壓電和測熱免疫傳感器[3]。

        經(jīng)過多年的研究,國外已經(jīng)在利用光學(xué)SPR和BLI技術(shù),通過測定抗體和待測菌的特異性抗原的結(jié)合情況檢測病原菌方面取得突破性進(jìn)展,相關(guān)的儀器設(shè)備也已經(jīng)上市銷售,但是該技術(shù)依然是依據(jù)ELISA或芯片技術(shù)原理進(jìn)行設(shè)計(jì),能夠?qū)崿F(xiàn)對抗原的高通量的測定,廣泛用于分子互作研究、藥物的高通量篩選和分子生物學(xué)研究等,但是不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的定量分析,而且其儀器設(shè)備要求精度高、價(jià)格昂貴,不能實(shí)現(xiàn)在線檢測。盡管如此,該技術(shù)在食品安全檢測方面仍然具有廣泛的應(yīng)用前景,已經(jīng)受到科學(xué)家和企業(yè)家的密切關(guān)注,盡管在病原菌檢測方面仍然處于研究階段。

        2 電化學(xué)免疫傳感器概述

        電化學(xué)免疫傳感器是另一個(gè)備受關(guān)注的研究方向,這主要是因?yàn)殡娀瘜W(xué)傳感技術(shù)已經(jīng)非常成熟和普及,如果能夠?qū)⒖乖涂贵w的結(jié)合信號轉(zhuǎn)化成電化學(xué)信號,再經(jīng)過放大和處理,就可以實(shí)現(xiàn)利用電化學(xué)信號系統(tǒng)對抗原、半抗原或者帶有該抗原的病原菌進(jìn)行快速、特異性定量檢測。在這方面面臨的關(guān)鍵問題是:抗原和抗體結(jié)合的微弱信號如何能夠轉(zhuǎn)化成足夠強(qiáng)的電化學(xué)信號,再進(jìn)行放大處理[4]。

        用來提高抗原和抗體結(jié)合后的電化學(xué)信號變化的方法有:利用辣根過氧化物酶[3,5]、堿性磷酸酶[6]、漆酶[7]和葡萄糖氧化酶[8];利用納米粒子增加抗體的特異性吸附并提高吸附量和量子點(diǎn);寡核苷酸和染料用來標(biāo)記所發(fā)生的信號變化[9]。這些方法的單獨(dú)和聯(lián)合使用可以大大提高檢測抗原抗體結(jié)合的靈敏度[10]。Castaneda等[11]設(shè)計(jì)了一個(gè)抗原-抗體結(jié)合所產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號,再通過催化吸附在納米金粒子上的對硝基酚進(jìn)行信號放大的傳感器。Mao Xun等[12]則利用他設(shè)計(jì)的基于納米金免疫傳感器成功檢測了人IgG。此外,納米材料和酶可以用來在抗原抗體結(jié)合時(shí)放大電化學(xué)信號,Mackey等[13]通過將抗人IgG進(jìn)行辣根過氧化物酶標(biāo)記后吸附到納米金粒子上制成電化學(xué)免疫傳感電極,結(jié)果使其測定靈敏度高于ELISA,達(dá)到260 pg/mL。電化學(xué)免疫傳感器的另一個(gè)關(guān)鍵性問題是如何為電極吸附更多的抗體,最好的方法就是納米材料的利用。目前這方面已進(jìn)行了大量研究,所用的納米材料主要有3 種:碳納米管[14]、納米金粒子[15]和石墨[16],并取得了較為理想的研究結(jié)果[17-18]。

        在免疫傳感器方面,一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是如何實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。因?yàn)槠渖虡I(yè)化應(yīng)用面臨諸多關(guān)鍵問題:1)必須能夠?qū)崿F(xiàn)快速、定量和大規(guī)模的樣品測定。2)高度的特異性,不能有交叉反應(yīng)形成明顯干擾。3)高質(zhì)量的操作規(guī)范。4)測定費(fèi)用可以接受。5)重復(fù)性和靈敏度足夠高[19]。6)再生性能性好,半壽期足夠長。解決這些問題主要途徑是:1)增加測定靈敏度、提高抗體吸附量以增加其測定樣品數(shù)量;2)增加納米免疫電極的半衰期和再生能力。

        3 納米材料在免疫傳感器中的應(yīng)用

        3.1 納米材料

        納米材料[20-21]是一種超細(xì)的固體材料,即其在微觀結(jié)構(gòu)上至少有一維方向受納米級尺度(1~100 nm)所調(diào)制,具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)。此外,由于納米材料還具有特殊的光學(xué)性質(zhì)、催化性質(zhì)、光電化學(xué)性質(zhì)以及良好的吸附能力和生物兼容性等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于免疫傳感器研究,可顯著提高生物分子的吸附量,同時(shí)放大電信號,從而使傳感器的靈敏度、壽命、穩(wěn)定性等得以提高[22]。

        納米材料(例如:納米金)與抗體的結(jié)合,一般認(rèn)為是納米金表面負(fù)電荷和抗體的正電荷基團(tuán)因靜電作用而吸附,并形成Au-S等穩(wěn)定化學(xué)鍵作用。湯俊琪等[23]報(bào)道了免疫酶吸附法評價(jià)納米金對抗體Fc端的吸附效果,表明納米金吸附主要是在抗體Fc端,且吸附率達(dá)到92%,抗原結(jié)合部位Fab端裸露在外,可與抗原發(fā)生特異性反應(yīng),納米材料的使用不僅可以增大抗體吸附量,同時(shí)也保證了傳感器的穩(wěn)定性。

        由于納米材料可以增加其操作的選擇性和特異性識別分子的量,所以大大增加檢測靈敏度。因?yàn)闃O低水平的致病菌足以造成食品安全隱患,所以各國都規(guī)定食源性病原菌不得檢出。也就是說,增加測定靈敏度是保證食品安全的關(guān)鍵[24]。此外,納米免疫技術(shù)不僅可以用來提高食源性病原菌的檢測限,而且用來提高對毒素、蛋白質(zhì)營養(yǎng)成分、抗生素、農(nóng)藥等的檢測靈敏度[25-26]。在生物傳感器中,納米材料可以大大增加吸附識別分子的特異性和表面,從而增加檢測靶分子的靈敏度和測定量,這對于提高測定靶細(xì)胞(病原菌)的靈敏度至關(guān)重要[27]。研究結(jié)果證明應(yīng)用納米生物傳感器檢測E. coli O157∶H7的靈敏度比ELISA或異硫氰酸熒光素靈敏度提高了16 倍[28]。為適應(yīng)食品安全檢測的要求,往往需要測定到單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的水平,顯然更需要納米技術(shù)的幫助[29]。

        3.2 納米材料在生物傳感器中的應(yīng)用

        通過抗細(xì)菌的特異性抗原制備抗體,在經(jīng)過納米材料吸附抗體來完成食源性病原菌的測定一直是一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。病原菌的QDs(量子點(diǎn))熒光標(biāo)記被用來測定食源性病原菌,如:單增李斯特菌[30]、致病大腸桿菌(E. coli O157∶H7)[31]和志賀氏菌(Shigella fl exneri)等[32]。一項(xiàng)對白條雞洗滌液中鼠傷寒菌的QDs為基礎(chǔ)的免疫測定中,靈敏度可以達(dá)到103CFU/mL[33]。這些納米粒子上結(jié)合事件的發(fā)生點(diǎn)數(shù)和位置可以通過定位性SPR、LSPR(localized SPR)或納SPR進(jìn)行測定[34-35]。Marinakos等[36]用固定了抗體的納米金粒子同時(shí)測定了E. coli鼠傷寒菌的LSPR變化,結(jié)果表明,檢測限達(dá)到102CFU/mL,比傳統(tǒng)檢測時(shí)間減少30 min,Wang Chungang等[37]用此方法結(jié)合抗體連接的納米金粒子雙光子瑞利散射測定E. coli O157∶H7,其檢測限達(dá)到50 CFU/mL。Andre等[38]用間接抗沙門氏菌多克隆抗體吸附在納米磁珠上,然后再和含沙門氏菌樣品液(含沙門氏菌的脫脂奶樣品)混合培養(yǎng),通過微分脈沖伏安法進(jìn)行測定,檢測限達(dá)到143細(xì)胞/mL。并在103~106細(xì)胞/mL呈線性關(guān)系。Kang Xinhuang[39]和Wu Hong[40]等研究小組等報(bào)道了以天然分子殼聚糖分散石墨烯并結(jié)合鉑納米顆粒制備的葡萄糖氧化酶傳感器,研究表明,由于石墨烯的加入使得該新型傳感器展現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和抗干擾能力,具有靈敏度高、響應(yīng)快、檢測限低等優(yōu)點(diǎn)。韓玉花[41]報(bào)道了一種基于金包覆磁性納米粒子的電位型免疫傳感器檢測小鼠的IgG,該傳感器的響應(yīng)電位與抗原(小鼠IgG)質(zhì)量濃度的對數(shù)在2×10-5~1×104ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,檢測下限為3.1×10-4ng/mL,響應(yīng)時(shí)間為8 min。該傳感器的制備方法簡單、無需標(biāo)記過程、成本低廉、響應(yīng)靈敏、性能穩(wěn)定,具有潛在的應(yīng)用前景,對制備其他類型免疫傳感器具有重要參考價(jià)值。閔紅等[42-43]將金摻雜的四氧化三鐵納米顆粒用殼聚糖交聯(lián)后制備生物傳感器,在檢測有機(jī)磷農(nóng)藥時(shí)發(fā)現(xiàn),在優(yōu)化條件下,對有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏線性檢測范圍為8.0×10–13~1.0×10–10mol/L,最低檢出限達(dá)到4.0×10–13mol/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于我國GB/T 5009.20—2003《食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測定》(0.1 mg/L)。另外,在以殼聚糖為交聯(lián)劑制備金摻雜的二氧化鈦復(fù)合納米粒子修飾電化學(xué)傳感器對有機(jī)磷農(nóng)藥對硫磷進(jìn)行檢測研究時(shí)發(fā)現(xiàn),金摻雜二氧化鈦復(fù)合納米粒子大的比表面積能增加對底液中對硫磷吸附量,提高檢測靈敏度;所制備電化學(xué)傳感器利用示差脈沖伏安法在最優(yōu)條件下對對硫磷進(jìn)行檢測,檢測范圍為1.0~7.0×103ng/mL,檢測限達(dá)到0.5 ng/mL。

        4 電化學(xué)納米免疫傳感器在食品檢測方面的應(yīng)用

        電化學(xué)免疫傳感器由于具有高靈敏度、低成本、靈活便攜等優(yōu)點(diǎn),在食品安全檢測方面有著巨大的應(yīng)用前景,以下從蛋白分子、細(xì)菌、毒素及農(nóng)藥殘留幾方面簡要敘述。

        康曉斌等[44]研制的牛IgG電流型納米免疫傳感器定量檢測牛初乳制品及乳制品中牛IgG的含量,以響應(yīng)電流的變化率ΔI對牛免疫球蛋白G的質(zhì)量濃度的對數(shù)做圖,結(jié)果表明,該傳感器在牛IgG質(zhì)量濃度0.1~10 000 ng/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)關(guān)系,與傳統(tǒng)檢測方法相比較,無需對檢測樣品進(jìn)行提取或預(yù)濃縮等復(fù)雜的前處理,檢測靈敏度高,操作簡便快捷,但僅僅可以保存15 d左右,壽命較短。

        Geng Ping等[45]報(bào)道了一種阻抗型電化學(xué)免疫傳感器檢測河水中的大腸桿菌,該傳感器線性范圍在3.0×103~3.0×107CFU/mL,最低檢測限達(dá)到1.0 ×103CFU/mL,同樣也存在壽命較短的問題。Kang Xiaobin等[46]研制的雙層納米金蠟樣芽胞桿菌免疫傳感器以電流在免疫前后的變化率ΔI與蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù) (用甘露醇卵黃多粘菌素培養(yǎng)基進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù))作圖,結(jié)果該傳感器的響應(yīng)電流與菌濃度在5×101~5×104CFU/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,以3 倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算該傳感器的檢測限為10 CFU/mL,靈敏度可與PCR檢測方法相媲美,幾乎達(dá)到了細(xì)菌檢測的極限,但保存20 d后電流響應(yīng)信號為初始電流的93.56%,表明使用壽命也較短。

        Masoomi等[47]報(bào)道了一種檢測黃曲霉素B1非酶標(biāo)記電化學(xué)納米金免疫傳感器,響應(yīng)范圍0.6~110 ng/mL,最低檢測限為0.2 ng/mL;Zhou Linting等[48]報(bào)道了一種檢測黃曲霉毒素B1的超靈敏電化學(xué)納米免疫傳感器,其響應(yīng)范圍為3.2×10-16~0.32×10-13mol/L,最低檢測限為1×10-16mol/L(RSN=3),可穩(wěn)定保存26周;Li Zaijun等[49]也報(bào)道了一種檢測蜂蜜中黃曲霉毒素B1的阻抗型免疫傳感器,阻抗響應(yīng)范圍為0.1~10 ng/mL,最低檢測限為0.01 ng/mL,在4 ℃保存180 d后仍具有95%的活性,且不受黃曲霉毒素B2、G1、G2和M1的干擾;Gautam等[50]報(bào)道了一種檢測牛奶中黃曲霉毒素M1的阻抗型免疫傳感器,靈敏度可達(dá)0.001 ng/mL。對黃曲霉毒素的檢測近年來發(fā)展迅速,無論是靈敏度或者穩(wěn)定性上都體現(xiàn)了電化學(xué)免疫傳感器巨大的應(yīng)用潛力。

        杜淑媛[51]報(bào)道的克百威農(nóng)藥殘留檢測用電化學(xué)免疫傳感器,在最優(yōu)條件下其具有較寬的線性范圍:0.1 ng/mL~1 μg/mL,檢測限為0.021 ng/mL (RSN= 3),保存15 d后響應(yīng)電流保留了原來的93.5%,盡管農(nóng)藥生物傳感器發(fā)展速度很快,但商業(yè)化產(chǎn)品的研制仍處于初期階段,還有待于進(jìn)一步的發(fā)展。

        5 展 望

        電化學(xué)納米免疫傳感器是一種將電化學(xué)分析方法與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點(diǎn)的生物傳感器,同時(shí)結(jié)合納米材料良好的吸附能力、表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)等特點(diǎn)[51],大大提高了傳感器靈敏度、穩(wěn)定性和抗體分子吸附量。更重要的是,目前已有抗體(病原體、毒素、腫瘤表面標(biāo)記物、遺傳標(biāo)記、細(xì)胞因子、抗生素、農(nóng)藥)絕大多數(shù)都是以Balb/c小鼠制備的單克隆抗體。顯然,這可以成為一個(gè)針對目前所制備的非常廣泛的單克隆抗體的檢測平臺,因?yàn)槠淇贵w來源于一個(gè)相同的無性系小鼠,其Fc序列、結(jié)構(gòu)和功能是相同的,因此,其操作和檢測方案是基本相同的,而且還可以針對需要隨時(shí)通過成熟的雜交瘤技術(shù)定制待測靶標(biāo)的單克隆抗體。電化學(xué)納米免疫傳感器將在食品檢測領(lǐng)域發(fā)揮極其重要的作用。但就目前來說,電化學(xué)納米免疫傳感器的發(fā)展仍面臨著多方面挑戰(zhàn),需要在使用壽命、再生性、穩(wěn)定性等方面投入更多精力,從而推進(jìn)其商品化應(yīng)用進(jìn)程。

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        Recent Development and Application of Electrochemical Nanometer Immunosensors in Food Detection

        LU Ding-qiang, PANG Guang-chang*
        (Tianjin Key Laboratory of Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

        Electrochemical nanometer immunosensor has the characteristics of simple operation, accuracy, high sensitivity and good selectivity, where biological sensing chips are used to detect the interaction between antigen and antibody. It has a wide range of applications in the fields of medicine, food, environmental monitoring, drug screening and life science. In this paper, we compare electrochemical nanometer immunosensor with instrumental analysis, immunological detection, polymerase chain reaction (PCR)-based molecular biology detection techniques and surface plasmon resonance (SPR)- and biolayer interferometry (BLI)-based detection techniques for their advantages and drawbacks. We also discusse the two key issues electrochemical nanometer immunosensor itself is facing: immune binding signal amplification processing and commercial application. Finally, we overview the current applications of nanomaterial in the immunosensor and those of electrochemical nanometer immunosensor in food detection, and discuss its future prospects in this area.

        electrochemical; nonmaterial; immunosensor; food detection; antibody

        TS252.7;O657.1

        A

        1002-6630(2014)08-0006-05

        10.7506/spkx1002-6630-201408002

        2014-02-13

        乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北農(nóng)業(yè)大學(xué))開放課題(2012KOLDSOF-02);

        國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31371773);“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD29B07)

        魯丁強(qiáng)(1984—),男,碩士研究生,研究方向?yàn)殡娀瘜W(xué)免疫傳感器。E-mail:m18222368363@163.com

        *通信作者:龐廣昌(1956—),男,教授,博士,研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與食品免疫、乳品質(zhì)量與安全。E-mail:pgc@tjcu.edu.cn

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