王 寧，姚 方，袁美麗，蘇金樂

(1.河南科技大學林學院, 河南 洛陽 471000； 2.河南林業(yè)職業(yè)學院, 河南 洛陽 471002； 3.洛陽市隋唐城遺址植物園, 河南 洛陽 471002； 4.河南農(nóng)業(yè)大學林學院, 河南 鄭州 450002)

低溫是限制植物北引的主要環(huán)境脅迫因子[1].隨著全球氣候的逐漸變暖，南方樹種有望逐漸向北方地區(qū)引種.樟樹為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)植物，中國不同種樟樹有15種之多.樟樹的抗寒生理性研究多集中于某一個種或類型，如張亞紅等[2]、李凌等[3]結(jié)合自然降溫過程中MDA含量等相關(guān)指標的變化，對香樟抗寒性進行了研究.薛建輝等[4]結(jié)合自然降溫過程中葉片相對電導率和低溫半致死溫度(LT50)測定，對南京地區(qū)引種的浙江樟等5種常綠闊葉樹種進行了抗寒性研究，得出浙江樟抗寒能力較強，且能在南京地區(qū)廣泛栽植的結(jié)論.尤揚等[5]研究認為，當溫度低于-10 ℃時香樟容易發(fā)生凍害.毛春英等[6,7]在山東泰安對香樟幼苗及種子分別進行了引種研究，結(jié)果表明引種種子進行播種繁殖更易成功，并能獲得抗寒性強的苗木.對多種樟樹進行抗寒對比性研究相對較少，僅見有王寧等[8～10]結(jié)合葉片解剖結(jié)構(gòu)，以及低溫脅迫過程中葉片超微結(jié)構(gòu)、葉綠素熒光參數(shù)的變化，對猴樟等5種樟樹的抗寒性進行了研究.姚方等[11]結(jié)合自然降溫過程中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的動態(tài)變化，對尾葉樟等3種樟樹的抗寒性進行了研究.宋芳林等[12]結(jié)合自然降溫過程中保護酶活性及脂肪酸含量的變化，對猴樟及香樟進行了抗寒性研究.謝曉金等[13]借助電導法，對南京地區(qū)露地引種的包括香樟、浙江樟等12種常綠闊葉樹種進行了抗寒性研究，研究結(jié)果表明1月中旬抗寒能力達到最強，而通常10月份或3月份期間抗寒能力最弱.本研究以鄭州市上街區(qū)已引種多年不同種或類型的樟樹為試材，通過對自然降溫過程中其葉片膜透性、保護酶活性及滲透調(diào)節(jié)物含量動態(tài)變化的研究，以期更加全面科學的鑒定不同樟樹的抗寒性，揭示其在越冬過程中的適應機制.

1 材料與方法

1.1試驗地概況

試驗地位于河南省鄭州市上街區(qū)，地理坐標東經(jīng)113°14′45″～113°19′05″，北緯34°35′～34°40′.暖溫帶季風氣候，年平均氣溫13.5～15.3 ℃，極端最低溫為-16.5 ℃.土壤為褐土類.

1.2試驗材料與設計

選取上街區(qū)登封路行道樹中引種栽植的8 a生尾葉樟(CinnamomumcamphoraKisterm)、猴樟(C.bodinieriLevel)、沉水樟(C.micranthum(Hay.) Hay)、芳樟(C.camphoraLinn (linalool-type))及本樟(C.camphoraLinn (cincol-type))共5種或類型，每種或類型選擇生長勢相近的3株作為研究對象，其生長狀況如表1所示.為便于敘述，將上述樹種依次標號為I，II，III，IV及V.

表1 供試樟樹的生長狀況

以秋季氣溫明顯下降為起始時間(2009-10-30)，翌年春季氣溫回升平緩后為終止日期(2010-04-16)，共持續(xù)169 d.采樣日期及日最高、最低溫如表2所示.考慮到溫度變化的不規(guī)律性，通常于明顯降溫后出現(xiàn)的晴天進行取樣，每月至少1次，2009-11-03采第1次樣，作為對照(CK)，共取樣11次.隨機采取樹冠中上部不同方向，當年生枝的第3～7枚完好葉片，每樹種30枚.采后立即用潮濕紗布包裹，自封袋密封后帶回試驗室，依次用自來水和蒸餾水沖洗干凈并吸干水分，取部分葉片立即測定相對電導率，其余置超低溫冰箱保存，用于其它生理指標的測定.

1.3測定項目及方法

參照鄒琦[14]的電導法進行電解質(zhì)滲透率的測定.參照李合生[15]的方法，丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用NBT光照化學還原法，酸性茚三酮測定脯氨酸含量.

1.4數(shù)據(jù)處理

應用Fuzzy數(shù)學中隸屬函數(shù)法進行綜合評判[16,17].對與抗寒性呈負相關(guān)的電導率及MDA含量，采用公式：

f(Xij)=1-(Xij-Xj min)/(Xj max-Xj min)

(1)

對與抗寒性正相關(guān)的SOD活性和脯氨酸，采用公式：

f(Xij)=(Xij-Xj min)/(Xj max-Xj min)

(2)

式中:f(Xij)為i樹種的j項指標隸屬函數(shù)值；Xij為其測定值；Xj max和Xj min分別為j指標最大測定值和最小測定值.試驗數(shù)據(jù)用Excel及SPSS統(tǒng)計軟件進行相關(guān)分析和方差分析.

表2 采樣時間及日最高和最低溫度

2 結(jié)果與分析

2.1相對電導率的變化

越冬期間，5種樟樹葉片的質(zhì)膜透性整體呈先升后降再升的變化趨勢(表3).I,Ⅲ樹種的電導率峰值出現(xiàn)在2010-01-09，表明2010-01-05─2010-01-08持續(xù)-8 ℃左右的低溫對其造成的影響較大，與CK相比分別增加了223.00%和241.00 %；而II，IV，V的峰值均出現(xiàn)2010-01-23，表明連續(xù)的低溫對其造成的影響較小，這可能與其保護酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加相關(guān)，較CK分別增加了116.00%，167.00%和180.00%，均明顯小于樹種Ⅲ的增加量.除II外，其余樹種電導率在4月份均有不同程度的增加，表明其忍受“倒春寒”的能力不盡相同，與2010-03-27電導率相比，I，III，IV，V分別增加了25.00%，67.26%，15.38%及21.76%，增加順序為III >I>V>IV，由此表明“倒春寒”對III的影響最大，其次是I，V，然后是IV，II在“倒春寒”期間受到的影響相對較小.

表3 自然降溫對5種樟樹葉片相對電導率的影響

2.2MDA含量的變化

5種樟樹葉片細胞膜脂過氧化程度隨著自然界溫度的降低而逐漸增加，春季則隨著溫度的升高而逐漸降低(表4).自然降溫過程中，前期降溫過程中5種樟樹的膜脂過氧化程度增加較為緩慢，其中以III增加最大；而2010-01-05─2010-01-08 持續(xù)-8 ℃左右的低溫出現(xiàn)后，MDA含量增加較為明顯，2010-01-09較2009-12-28分別增加了89.73 %，11.10 %，93.17 %，19.75 %和24.32 %，增加順序為III>I>V>IV>II，表明持續(xù)的低溫脅迫對III造成的傷害最大；與CK相比，I，Ⅲ的MDA峰值出現(xiàn)在2010-01-09，分別增加了116.00%和154.00%，而II，IV，V的峰值均出現(xiàn)2010-01-23，分別增加了63.00%，97.94%和121.00%，可以看出以III增加最為明顯，且從2009-12-17─2010-03-16，III的MDA含量明顯高于同時期其它樹種.4月份的再次降溫脅迫中，除II外，其余樟樹MDA含量均有不同程度的增加，表明不同樹種對“倒春寒”的適應性不同.

表4 自然降溫對5種樟樹葉片MDA含量的影響

2.3SOD活性的變化

越冬期間，隨著氣溫的下降，幾種樟樹葉片內(nèi)SOD活性均出現(xiàn)迅速增加(表5).I，III峰值出現(xiàn)在2009-12-28，而II，IV，V峰值出現(xiàn)在2010-01-09，隨后均出現(xiàn)明顯的下降，可能是持續(xù)低溫增加了膜脂過氧化程度，導致植物體內(nèi)的酶促防御系統(tǒng)受到危害，造成未得到及時清除活性氧的積累，從而降低了SOD活性.與2009-11-03相比，5種樟樹SOD值分別增加了88.17 %，71.30 %，113.00 %，103.00 %和95.50 %，增加順序為II>IV>V>I>III，表明II對低溫脅迫的適應能力最強，其次IV，V，最弱的為III；此后，隨著春季溫度的逐漸回升，酶促防御系統(tǒng)逐漸得到恢復.至2010-03-27，與2010-01-09相比，I，III的SOD活性分別增加了44.94 %和38.67 %，II，IV，V的SOD活性與2010-01-23相比分別增加了52.75 %，50.56 %和46.13 %，可以看出，以II增幅最大，表明其酶促防御系統(tǒng)受害較輕，恢復也相對較快，其次為IV，V，而增加最少的為III，表明自然降溫過程中其受傷害相對較重.4月份的再次降溫造成了SOD活性小幅上升，與2010-03-27相比，其中以II增幅最大，為14.57 %，而III增幅最小，僅為4.50 %，表明III對“倒春寒”的適應性最弱，而II的適應性最強.

表5 自然降溫對5種樟樹葉片SOD活性的影響

2.4脯氨酸含量的變化

越冬期間，隨著溫度的下降，5種樟樹葉片內(nèi)脯氨酸含量均出現(xiàn)持續(xù)的增加，之后隨著春季溫度的回升又呈逐漸降低(表6).5種樟樹的峰值均出現(xiàn)在2010-01-09，與2009-11-03相比，分別增加了115.00 %，329.00 %，71.44 %、200.00 %和139.00 %，其中以II增加最大，III增加最小，表明II對低溫的適應能力最強，而III最弱.前期降溫過程中，與2009-12-17相比，至2009-12-28，5個樹種脯氨酸含量分別增加了15.15 %，18.37 %，12.74 %，17.94 %和13.35 %，增加順序為II > IV > V > I > III，而與2009-12-28相比，至2010-01-09，持續(xù)-8 ℃左右低溫后，脯氨酸含量分別增加了13.18 %，56.63 %，11.50 %，21.51 %和13.60 %，其中以II增加最為明顯，與前面的增加情況相比，除II，IV增幅明顯增加外，I，III雖有增加，但小于前面的增幅，V大致持平，由此說明，持續(xù)-8 ℃左右的低溫脅迫后，II，IV依然通過脯氨酸的大幅增加提高其對低溫的適應能力，而I，III的適應能力卻逐漸減弱.4月份的“倒春寒”脅迫中，5個樹種的脯氨酸含量均有不同程度的增加，與2010-03-27相比，以II增加最為明顯，達24.41 %，而III增幅最小，僅為8.82 %.

表6 自然降溫對5種樟樹葉片脯氨酸含量的影響

2.5隸屬函數(shù)法綜合分析抗寒性

2.5.1 自然降溫過程中各抗寒指標隸屬值 以Ⅱ為例，運用隸屬函數(shù)法求出其加權(quán)平均值D，值越大表示抗寒性越強(表7).從表7可以看出，綜合評價值呈“升-降-升”的變化趨勢，由此表明，越冬期間猴樟的抗寒性呈現(xiàn)增強、減弱再增強的變化.依次可將其抗寒性分為2個時期，分別為：(1)增強期.分2個階段，2009-11-03─2009-12-17，隨著氣溫的降低，通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和保護酶活性的增加，從而增強其對低溫脅迫的抵御能力；2010-01-09─2010-04-16，隨著氣溫的逐漸回升，受低溫脅迫傷害的細胞膜逐漸得到恢復，樟樹的抗寒性逐漸得到恢復.(2)減弱期.2010-01，隨著2010-01-05─2010-01-08持續(xù) -8 ℃左右的低溫出現(xiàn)，抗寒性迅速降低，這可能與低溫的過渡脅迫所致.

表7 自然降溫過程中各抗寒指標參數(shù)的D值

2.5.2 幾種樟樹的抗寒性綜合評價 低溫脅迫過程中，由于受到多重因素的影響，植物的生理變化相對較為復雜，因此，孤立的應用某一種指標較難真實反映植物的抗寒性[18,19].因此，為了較為全面地反映5種或類型樟樹的抗寒性強弱，結(jié)合隸屬函數(shù)法的運用，求出幾種樟樹各指標參數(shù)的隸屬函數(shù)加權(quán)平均值D，該值越大表明抗寒性越強(表8).從表8可以看出，抗寒性強弱順序為：II>IV>V>I>III.其中以猴樟的D值最大，表明其耐寒性最強，而沉水樟耐寒性最差.

表8 5種樟樹的D值及抗寒性綜合評價

3 小結(jié)與討論

3.1細胞膜透性與樟樹的抗寒性關(guān)系

大量研究認為，低溫造成植物發(fā)生寒害的根本原因是其對細胞膜系統(tǒng)造成的損害，因此細胞膜系統(tǒng)的流動性和穩(wěn)定性與植物抗寒性之間關(guān)系密切[20～22].早在1930年，DEXTER等[23]發(fā)現(xiàn)植物電導率的大小與其組織受低溫傷害的程度呈正相關(guān)，并首次利用電導法測定離體植物材料的抗寒強弱.隨后，電導法作為測定植物抗寒性快速可靠的方法之一被廣泛的采用.楊家胭等[24]、劉祖祺等[25]先后采用電導法測定了柑桔的抗寒性，發(fā)現(xiàn)柑桔葉片及枝條的電導率隨著脅迫溫度的降低而增加，并發(fā)現(xiàn)電導具有較好的靈敏度和精確度；BIGRAS等[26]、HAWKINS等[27]采用電導法對黑云杉及黃扁柏的耐寒性進行了研究，并得出了理想的結(jié)果.本研究結(jié)果表明，自然降溫過程中，盡管幾種樟樹細胞內(nèi)相對電導率的峰值出現(xiàn)日期不盡相同，但整體變化趨于一致.降溫初期電導率的上升較為平緩，然后，隨著2010-01溫度的持續(xù)降低，相對電導率出現(xiàn)急劇升高，這與向鄧云等[28]對自然降溫過程中曼地亞紅豆杉和鮑思偉[29]對云錦杜鵑的研究結(jié)果一致.與CK相比，其中，以III增幅最大，II最小，表明III電解質(zhì)外滲嚴重，細胞膜受到了傷害，其抗寒性也最弱，而以II的抗寒性為最強.2010-04再次降溫中，除II外，其余樹種電導率均有不同程度的增加，而其中又以III增幅最大，表明其對“倒春寒”的適應能力最弱.

3.2膜脂過氧化與樟樹的抗寒性關(guān)系

低溫脅迫條件下，植物細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，增加的自由基首先攻擊膜系統(tǒng)，同時氧化膜質(zhì)脂肪酸的不飽和鍵，造成MDA含量的增加[30].因此，通常以MDA含量作為膜脂過氧化反應的主要指標，用來反映植物細胞膜脂過氧化的程度，以及植物對低溫脅迫的適應性強弱[31,32].

本研究中，自然降溫過程中，隨著溫度的降低，5種樟樹的MDA含量均出現(xiàn)不同程度的增加，這與莊炳莉[33]對自然降溫過程中闊瓣含笑、亮葉含笑等5個常綠闊葉樹種的研究一致.5種樟樹MDA含量在2009-12的增幅明顯小于2010-01，表明1月份的持續(xù)低溫脅迫加劇了5種樟樹膜脂過氧化程度，而其中又均以III增幅最大，II增幅最小，表明自然降溫對III造成的傷害最大.4月份的再次降溫中，除II外，其余樟樹MDA含量均有不同程度的增加，表明不同樹種對“倒春寒”的適應性不同，其中又以III增幅最大，表明其對“倒春寒”的適應能力最弱.

3.3保護酶活性與樟樹的抗寒性關(guān)系

在一定的低溫脅迫中，保護酶活性的升高有利于保持植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡，隨著低溫的持續(xù)降低，此動態(tài)平衡被打破，細胞的清除系統(tǒng)遭到損傷，活性氧對細胞產(chǎn)生氧化脅迫[34].大量研究表明，植物體內(nèi)SOD活性的高低直接反映了活性氧的清除能力大小, 與植物的抗逆性關(guān)系密切[35,36].

本研究結(jié)果表明，在自然降溫過程中，各種樟樹葉片內(nèi)SOD活性變化趨勢基本一致，降溫過程中，各種樟樹通過SOD活性持續(xù)增加以適應外界的低溫脅迫，而后隨著春季溫度的逐漸回升，細胞酶促防御系統(tǒng)逐漸得到恢復，SOD活性出現(xiàn)小幅上升，這與應葉青等[37]對自然降溫過程中毛竹中的SOD變化的研究結(jié)果一致.與CK相比，至SOD活性峰值，降溫脅迫中各種樟樹SOD活性的增幅大小順序為II > IV > V > I > III，表明II的活性氧清除能力相對較大，其抗寒性也最強，而以III最弱.而后隨著春季溫度的回升，各種樟樹SOD活性均出現(xiàn)小幅上升，其中又以II增幅最大，III的增幅最小，說明II細胞內(nèi)酶促防御系統(tǒng)在前期的降溫脅迫中受到傷害相對較小，因此恢復也相對較快，而III則相反.

3.4滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量與樟樹抗寒性關(guān)系

冬季來臨之前，植物發(fā)生一系列形態(tài)和生理生化的變化以適應低溫脅迫，即所謂的抗寒鍛煉.低溫條件下，植物細胞通過滲透調(diào)節(jié)以維持細胞內(nèi)外的滲透平衡，因此必然使機體內(nèi)如糖、蛋白質(zhì)、脯氨酸等參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)含量發(fā)生變化，從而提高植物的耐寒力，避免凍害的發(fā)生[38].

脯氨酸是水合力較強的氨基酸，其含量的增加是植物對逆境脅迫的一種生理生化反應，是植物對逆境的適應表現(xiàn).脯氨酸具有多種生理功能，如作為細胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)等[39].DELAUMEY等[40]研究認為，作為細胞質(zhì)內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，脯氨酸積累的多少與植物的抗逆性相關(guān)，可作為抗逆性篩選的指標之一.本研究結(jié)果表明，隨著氣溫的降低，5種樟樹的脯氨酸含量均出現(xiàn)不同程度的增加，與2009-12的增幅相比，2010-01的持續(xù)低溫出現(xiàn)后，II，IV增幅依然明顯增加，而I，III的增幅卻出現(xiàn)減少現(xiàn)象，其中又以III的增幅減少最多，由此說明隨著低溫的持續(xù)脅迫，II，IV依然具有較強的適應性，而III適應性則相對最弱.春季隨著溫度的逐漸回升，各種樟樹的脯氨酸含量出現(xiàn)不同程度的減少，這與蘇敬[41]對浙江樟、樂昌含笑等5種常綠闊葉樹種的研究結(jié)果一致.

3.5綜合性抗寒評價

對多個指標或因子共存的系統(tǒng)進行綜合評價，通常采用模糊數(shù)學中的相關(guān)理論和方法.基于隸屬函數(shù)法具有簡單及準確等優(yōu)點，目前已被廣泛的應用于生態(tài)學籍環(huán)境科學的研究領(lǐng)域.

自然降溫過程中，植物耐寒性的一系列變化是多個因子綜合作用的結(jié)果，因此，單一抗寒指標難以判斷其對冬季低溫的綜合適應能力[16].莊炳莉[33]、蘇敬[41]及紹文鵬[34]利用隸屬函數(shù)法，分別對自然降溫過程中多種常綠闊葉樹種進行了抗寒性綜合評價研究，并得出理想的結(jié)果.本研究結(jié)果表明，通過隸屬函數(shù)法的應用，對自然降溫過程中5種或類型樟樹的MDA、SOD等4個生理生化指標進行了綜合分析，得出抗寒性強弱順序為：II>IV>V>I>III.

以猴樟為例，采用隸屬函數(shù)法，對自然降溫過程中4個生理生化指標參數(shù)進行綜合分析，結(jié)果顯示，越冬期間，其抗寒性分為增強期、減弱期2個階段.隨著秋季氣溫的逐漸降低，樟樹通過保護酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的增加，提高其抗寒性，為冬季低溫脅迫奠定基礎，這個時期即所謂的抗寒鍛煉期；之后，隨著2010-01-05─2010-01-08持續(xù)-8 ℃的低溫，過渡的低溫脅迫導致細胞膜透性變大，電解質(zhì)外滲隨之增加，同時膜脂過氧化程度逐漸增加，共同導致其抗寒性減弱；春季，隨著氣溫的逐漸回升，受低溫脅迫的傷害細胞酶促防御系統(tǒng)逐漸得到恢復，細胞內(nèi)部活性氧自由基的清除能力隨之增加，樟樹的抗寒性也逐漸得到恢復.

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