陳松符培亮△ 叢銳軍吳海山**許震宇

（1.上海長(zhǎng)征醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，上海 200003；2.第二軍醫(yī)大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，上海200433）

人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定*

陳松1符培亮1△叢銳軍1吳海山1**許震宇2

（1.上海長(zhǎng)征醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，上海 200003；2.第二軍醫(yī)大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，上海200433）

背景：軟骨一旦損傷將很難自我修復(fù)，組織工程學(xué)修復(fù)損傷軟骨是目前的研究熱點(diǎn)。組織工程學(xué)中找到合適的“種子細(xì)胞”至關(guān)重要。滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（SMSCs）因較其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨能力、增殖能力更強(qiáng)，且細(xì)胞容易獲取、對(duì)機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到研究者的青睞。

目的：探討人SMSCs體外分離、培養(yǎng)的方法與步驟，探索對(duì)SMSCs進(jìn)行鑒定的最新方法。

方法：關(guān)節(jié)鏡下獲取 11 例行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)患者的滑膜組織，按照 Pei等[6]的方法分離培養(yǎng)滑膜干細(xì)胞；從細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長(zhǎng) 曲線分析、CCK-8 測(cè)定增 殖活力、流式細(xì)胞儀檢 測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞表面抗原、對(duì) SMSCs進(jìn)行成 脂/成骨/成軟骨誘導(dǎo)、免疫細(xì)胞熒光染色以及RT-PCR檢測(cè)成脂/成骨/成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)等方面對(duì)SMSCs進(jìn)行鑒定。

結(jié)果與結(jié)論：按照Pei等的方法可以成功地從人滑膜組織中分離出干細(xì)胞，分離出的干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表型和多向分化潛能。

滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞；分離培養(yǎng)；鑒定；成脂誘導(dǎo)；成骨誘導(dǎo)；成軟骨誘導(dǎo)

Background:It is difficult to repair the ininjuried cartilage,and it is a hot spot to repair the injuried cartilage by tissue engineering.An appropriate seed cell is crucial in ttissue engineering.Synovial mesenchymal stem cells(SMSCs)is easy to differentiate into cartilage than other source of mesenchymal stem cells.Meanwhile,SMSCs can be harvested easily.

Objective:To study the method and procedure of the isolation and culture of human SMSCs in vitro and investigate the lastest methods of SMSCs identification.

Methods:Synovial tissues were harvested from 11 patients undergoing arthroscopic surgery in our hospital.SMSCs were isolated and cultured according to Pei's method[6].The SMSCs were identificated from morphological observation,cell growth curve,proliferation activity determined by CCK-8,flow cytometer,induction of adipo-genic/osteogenicondrogenic immunofluorescence staining and RT-PCR.

Results and conclusions:SMSCs were successfully isolated from synovial tissue and had specific phenotype and potential multi-directional differentiation.

關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷將很難修復(fù)。運(yùn)用自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)治療軟骨損傷，愈后較好，但由于細(xì)胞來(lái)源不足以及因取材而造成的取材部位的病變等缺點(diǎn)，使 其 運(yùn) 用受到了限制[1]。間充質(zhì)干細(xì) 胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來(lái)源于 胚 胎時(shí)期的中胚 層組織，具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和多向分化潛能，具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及肌細(xì)胞等多種終末細(xì)胞定向分化的能力，運(yùn)用MSCs來(lái)修復(fù)軟骨損傷具有很好的應(yīng)用前景[2]。2001 年，De Bari等[3]從人關(guān)節(jié)周圍的滑膜中分離出了MSCs，即滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞?；ぶ械腗SCs比例很高，平均每毫克滑膜組織中含（3～4）×103個(gè)有核細(xì)胞，平均10個(gè)有核細(xì)胞中就含有8 個(gè)左右MSCs，因此只需少量的標(biāo)本就可以獲得足量的滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（SMSCs）。其數(shù)量是骨髓來(lái)源MSCs的100倍以上，并且隨著供體年齡的增加，MSCs數(shù)量也并未出現(xiàn)明顯減少[4]。由于其具有比骨髓、骨膜、脂肪及肌肉來(lái)源的MSCs更好的成軟骨、成骨、成脂肪等多分化能力，更強(qiáng)的集落形成和擴(kuò)增能力，以及取材方便、對(duì)機(jī)體損傷較小等優(yōu)點(diǎn)[5]，吸引了越來(lái)越多的研究者對(duì)其進(jìn)行深入研究。本研究將探討從人滑膜組織中獲取和分離SMSCs的方法步 驟 ，探 索 對(duì) SMSCs鑒 定 的 最 新 方 法 ，為 探 索SMSCs向軟骨細(xì)胞分化的最優(yōu)條件打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑、儀器

滑膜來(lái)自11例于我科行膝關(guān)節(jié)鏡治療的患者，年齡16～35歲，平均 24.3 歲。滑膜組織無(wú)病變，術(shù)前征得患者的知情同意。本研究得到第二軍醫(yī)大學(xué)倫理 委 員 會(huì) 批 準(zhǔn) 。HG-DMEM、0.25%Trypsin/EDTA（GIBCO/BRL公司，美國(guó)）；一抗Ⅰ、Ⅱ型膠原、地塞米松、2-磷酸-抗壞血酸、L-脯氨酸、丙酮酸鹽（Sigma公司，美國(guó)）；一抗羊抗 Oct-4、鼠抗波形蛋白（Vimentin）、鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、鼠抗 Sox-2（Sigma-Aldrich 公 司，美 國(guó)）；TGF-β3、胰島 素 、ITS+Premix（R&D 公司 ，美國(guó)）；FBS（HyClone公司，美國(guó)）；Trizol（Invitrogen 公司，美國(guó)）；q-PCR引物（由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，上海英駿公司合成），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海寶曼生物科技有限公司），q-PCR 試劑盒 Quantitect SYBR Green PCR Kit及 q-PCR 儀 MX3005P multiplex quantitative PCR system（Stratagene公司，美國(guó)），miRNAmimics及其對(duì)照 mimics-NC（由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成），倒置相差顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）。

1.2 人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的獲得和分離培養(yǎng)

獲取膝關(guān)節(jié)鏡患者的滑膜，按照 Pei等[6]的方法分離滑膜干細(xì)胞。術(shù)中嚴(yán)格按照無(wú)菌操作的原則。無(wú)菌條件下于膝關(guān)節(jié)髕上囊處用髓核鉗取出滑膜組織，將收集的標(biāo)本浸于4℃無(wú)菌生理鹽水中。將標(biāo)本移入無(wú)菌操作臺(tái)，PBS沖洗3次，剪除脂肪和部分結(jié)締組織，分離出平滑光亮的滑膜組織。用無(wú)菌眼科剪將滑膜剪成 1.0～2.0 mm3碎塊，將碎片移入 15 ml的離心管，依次用 0.1%的胰蛋白酶（30 min）和 0.1%膠原 酶 P（2 h）在 37℃、體 積分 數(shù) 為 5%的 CO2培 養(yǎng) 箱 中消化。消化結(jié)束后，經(jīng) 120 目鋼網(wǎng)過(guò)濾，1000 r/min 離心 10 min棄去上清液。重復(fù)3 次，除去含膠原酶的上清液，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。以1×104個(gè)有核細(xì)胞平鋪于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在 37℃、體積分?jǐn)?shù)為 5%的 CO2條件下，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（HG-DMEM、體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血 清 、100 U/ml青 霉 素 和 100 U/ml鏈 霉 素 ）中 培 養(yǎng) ，24 h 后換液，除去未貼壁細(xì)胞，單層培養(yǎng) 7～14 d。連續(xù)觀察細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)和形態(tài)學(xué)特征，挑選合適的細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，以此作為原代 SMSCs。細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)，2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1∶3 傳代接種于培養(yǎng)皿，每3日更換培養(yǎng)基。第3代細(xì)胞為目的細(xì)胞，即人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.3 人滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

1.3.1 觀察細(xì)胞形態(tài)，計(jì)算倍增時(shí)間和測(cè)定增殖活力（CCK-8 法）：取第 3 代貼壁 SMSCs，用 0.25%Trypsin/ EDTA 消化，以離心半徑 10 cm，1500 r/min 離心 10 min后，D-PBS 重懸并調(diào)整細(xì)胞密度約為 2.4×106/ml，接種于 96孔板中，每孔 200 μl，次日消化3 孔，細(xì)胞計(jì)數(shù)，倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)3次，取平均值，以后每日消化3孔計(jì)數(shù)，取其平均值作為該天的細(xì)胞數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的分析。根據(jù)生長(zhǎng)曲線對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期始末兩點(diǎn)之間的變化，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞數(shù)的倍增 時(shí) 間 ：DT=t×log2/(1ogNt-logN0)，t代 表 培 養(yǎng) 時(shí) 間（h），N0和Nt分別代表接種后及培養(yǎng) t后的細(xì)胞數(shù)。

CCK-8測(cè)定增殖活力：取第3代貼壁 SMSCs，用0.25%Trypsin/EDTA消化，以離心半徑10cm，1500r/min離心 10 min 后，D-PBS 重懸并調(diào)整細(xì)胞密度約為 2.4× 106/ml，接種于 96 孔板中，每孔 200 μl，37℃孵育 24 h后終止培養(yǎng)。每孔加入 CCK-8 10 μl，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上 450 nm 處測(cè)定每孔的 A 值，以時(shí)間為橫軸，A450值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 流 式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原：取第 3 代貼壁SMSCs，用 0.25%Trypsin/EDTA 消 化 ，以 離 心 半 徑10 cm，1500 r/min 離心 10 min 后，D-PBS 重懸并調(diào)整細(xì)胞密度約為2.4×106/ml，取細(xì)胞懸液100 μl加入 3 μl加入不同的熒光標(biāo)記單克隆抗體（CD-106PE、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-FITC、CD14-FITC、CD81-FITC、CD71-FITC、CD105-PE、CD29-FITC）和相應(yīng)的同型對(duì)照抗體振蕩混勻，室溫避光放置 30 min。每管加入 2 ml含 1%NaN3的 PBS，混勻，1000 r/min 離心 5 min，棄上清，振蕩重懸細(xì)胞。每管加入 200 μl含0.1%多聚甲醛的PBS溶液，混勻固定，4℃冰箱放置，待上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以配套 CellQuest軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.3.3 hSMSCs 成 脂肪 細(xì)胞 誘導(dǎo) 分化 ：取 第 3 代貼 壁SMSCs，以 2×105/cm2接種于6 孔板中，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合后，加入成脂分化誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)液（10% FBS+100 U/ml青霉素+100 U/ml鏈霉素+0.5 μmol/L谷氨酰+0.5 μmol/L 胰島素+0.5 μmol/L 異丁基甲基黃嘌呤+0.5 μmol/L 吲哚美辛+0.5 μmol/L 地塞米松）誘導(dǎo)培養(yǎng) 14 d 后，吸出誘導(dǎo)培養(yǎng)基，PBS清洗2 次，4%多聚甲醛固定 30 min，油紅 O 染色 30 min，鏡檢、拍照。

1.3.4 hSMSCs 成 骨 細(xì) 胞 誘 導(dǎo) 分 化 ：取 第 3 代 貼 壁SMSCs，以 2×105/cm2接種于6 孔板中，待細(xì)胞達(dá) 80%～90%融合后，加入成骨分化誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（10% FBS+100 U/ml青霉素+100 U/ml鏈霉素+1 nmol/L 地塞米松、20 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L 維生素 C）誘導(dǎo)培養(yǎng) 14 d 后，吸出誘導(dǎo)培養(yǎng)基，PBS 清洗 2 次，4%多聚甲醛固定30min，ALP染色，鏡檢、拍照。

1.3.5 hSMSCs 成 軟骨 細(xì)胞 誘導(dǎo) 分化 ：取 第 3 代貼 壁SMSCs，以 2×105個(gè)細(xì)胞接種后，以 1000 r/min 離心 6 min，置于 37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中，于軟骨誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)（TGF-β3 10 ng/ml+FGF-2 2 ng/ml+維甲 酸1 nmol/L+維生素 C 磷酸酯 50 μg/ml+脯氨酸 40 μg/ml+丙酮酸100 μg/ml+DEX100nmol/L+ITS＋premix50mg/ml）中培養(yǎng)。誘導(dǎo)3周后棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，石蠟包埋切片，脫蠟蒸餾水沖洗，甲苯胺藍(lán)染色，鏡檢、拍照。

1.3.6 免疫細(xì)胞熒光染色：取第 3 代 SMSCs種植于玻璃鋪片上，細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁匯合達(dá)60%后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，2%牛血清白蛋白/PBS 室溫封閉 10 min，一 抗 羊 抗 Oct-4（1∶50）、鼠 抗 Vimentin（1∶200）、鼠抗人 α-SMA（1∶200）、鼠 抗 Sox-2（1∶400）封閉過(guò)夜，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的抗山羊 IgG 室溫下 1∶500 稀釋40 min；DAPI復(fù)染細(xì)胞核后熒光顯微鏡觀察[2]。

1.3.7 總 RNA 的提取及 RT-qPCR 檢測(cè)：取第 3 代貼壁SMSCs，以 3 mg/ml膠原酶 D 于 37℃溶解消化細(xì)胞3 h?？?RNA提取采用 TRIzol試劑盒，具體步驟參照說(shuō)明書。以總RNA作為模板，逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體積為25 μl：細(xì)胞RNA樣品2 μg，隨機(jī)引物OligodT100ng，10mmol/L dNTP 1.5 μl，Rnasin 20 U，M-MLV 200 U，M-MLV Buffer 5 μl。反應(yīng)條件：70℃、5 min，42℃、1 h，95℃、10 min。PCR 采用 50 μl反應(yīng)體系：cDNA 模板 2 μl，10 × PCR 緩 沖 液 5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，Taq DNA 聚合酶 2.5 U，上、下游引物各 0.5 μl。引物序列見(jiàn)表 1。反應(yīng)條件：94℃、5 min，94℃、45 s，54～60℃、45 s，72℃ 、45 s，30～35 個(gè) 循 環(huán) ；72℃ 延 伸 5 min。 取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物1%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光分析裝置拍攝。

表1 各基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 SMSCs 的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

SMSCs接 種 2 d 后 開(kāi)始 貼 壁 生 長(zhǎng) ，原代 培養(yǎng) 的SMSCs具有很強(qiáng)的增殖能力，細(xì)胞呈多邊形或星形；隨著細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞密度變大，第1代細(xì)胞形態(tài)逐漸變成圓形和梭形；經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后，各集落樣生長(zhǎng)的細(xì)胞長(zhǎng)滿匯合，細(xì)胞形態(tài)均勻一致，呈“向日葵”樣分布。第3代滑膜細(xì)胞呈梭形（圖1）。

2.2 SMSCs 的生長(zhǎng)及增殖能力

SMSCs增殖生長(zhǎng)曲線為典型S形，第3天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，至第8天生長(zhǎng)趨勢(shì)漸緩。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，代入公式可計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間為（30.2±2.4）h。在接種后的第l、2天，吸光度值變化不明顯，且比第 l天略有減少，為細(xì)胞的潛伏適應(yīng)期。第3天開(kāi)始細(xì)胞迅速增加，第7天達(dá)最高，第8天則呈下降趨勢(shì)（圖2）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)hSMSCs 周期

圖1 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（100×）

圖2 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖能力檢測(cè)

第 3 代 SMSCs中 ，處 于 S+G2+M 期 的 細(xì) 胞 占14.21%±3.14%，其中處于 S 期的為 8.92%±4.52%；而處于 G0+G1期的細(xì)胞占 86.79%±4.18%。結(jié)果說(shuō)明大部分SMSCs處于靜止期，只有少量的細(xì)胞處于活躍的增殖期。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)SMSCs 表面抗原

流式細(xì)胞儀對(duì)SMSCs的鑒定結(jié)果顯示：同一表面分子在細(xì)胞群中的表達(dá)一致率在99%以上。其中CD44、CD106、CD105、CD90呈陽(yáng)性表達(dá)（陽(yáng)性率＞99.9%，表 1），CD34、CD45、CD14、CD71呈陰性表達(dá)（＜10%）。見(jiàn)表2。

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況

2.5 SMSCs 成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化

成脂誘導(dǎo) 14 d 后，細(xì)胞體積逐漸增大，胞質(zhì)中有小的圓形、透亮的脂滴出現(xiàn)。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，脂滴逐漸增多增大，細(xì)胞由原來(lái)的梭形變成圓形，且相互融合。脂滴呈環(huán)狀排列時(shí)，停止誘導(dǎo)，油紅O染色見(jiàn)陽(yáng)性（圖3A）。

2.6 SMSCs 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

成骨誘導(dǎo)劑 1 d后，可見(jiàn)胞漿內(nèi)有不透光物質(zhì)的分泌和沉積，呈現(xiàn)小點(diǎn)狀或片狀。3～5 d后細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，不透光物質(zhì)面積增大，逐漸形成大片狀或塊狀。成骨誘導(dǎo) 21 d 后，ALP 染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒沉淀（圖3B）。

2.7 SMSCs 成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化

成軟骨誘導(dǎo) 14 d，可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)逐漸由小梭形變?yōu)槎嘟切?，類似軟骨?xì)胞樣形態(tài)，隨著成軟骨誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng)，多角形細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，體積增大。誘導(dǎo) 21 d 后 ，甲苯胺藍(lán)染色示有 軟骨細(xì)胞特異性的細(xì)胞外基質(zhì)GAG成分（圖3C）。

2.8 免疫細(xì)胞熒光染色

免疫細(xì)胞熒光染色：第4 代 SMSCs細(xì)胞質(zhì)中 Vimentin 和α-SMA 染色均呈陽(yáng)性，α-SMA 特異性表達(dá)在SMSCs的胞膜上，呈空泡狀熒光，細(xì)胞重疊處呈線狀熒光，背景染色 輕。Oct-4 與 Sox-2 在細(xì)胞核中都有較強(qiáng)表達(dá)，其中 Oct-4表達(dá)更明顯。見(jiàn)圖 4。

2.9 RT-PCR檢測(cè)脂肪、骨、軟骨相關(guān)基因的表達(dá)

RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果顯示：成脂肪細(xì)胞特異性基因PPARγ2和LPL表達(dá)陽(yáng)性；成骨細(xì)胞特異性基因Cbfa1、ALP、RUNX2表達(dá)陽(yáng)性；成軟骨特異性基因 SOX9、AGN、ColⅠ、ColⅡ、ColⅩ表達(dá)陽(yáng)性。凝膠電泳結(jié)果顯示如圖5。

3 討論

圖3 滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能檢測(cè)

本研究中的滑膜取自行膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)的年輕患者，由于膝關(guān)節(jié)滑膜組織位于關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層襯里，位置比較特殊，關(guān)節(jié)鏡微創(chuàng)手術(shù)獲取滑膜定位準(zhǔn)確方便，易于取材，對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷較??；另外，有研究表明，關(guān)節(jié)中的滑膜組織即使受到手術(shù)創(chuàng)傷或者化學(xué)損傷，其也能夠完全恢復(fù)，對(duì)關(guān)節(jié)的功能和結(jié)構(gòu)都沒(méi)有明顯影響[7]。有研究顯示，1 mg 滑膜組織便可以收集2.1×104個(gè)有核細(xì)胞，每 1.0×103個(gè)滑膜細(xì)胞所含有的MSCs克隆數(shù)量是骨髓的 100 倍[8]。在增殖能力方面，脂肪來(lái)源的MSCs在第7代即喪失增殖力，而SMSCs在10代后仍保持增殖能力。因此滑膜是最佳的間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源。

關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分為兩種：巨噬樣細(xì)胞（A型）和成纖維樣細(xì)胞（B型）。A型細(xì)胞與先天性及獲得性免疫有關(guān)，B型細(xì)胞則產(chǎn)生滑液。SMSCs來(lái)源于B型細(xì)胞[9]。通過(guò)陰性分離 CD14 的干細(xì)胞可以產(chǎn)生富集 B型細(xì)胞的滑膜[10,11]。富集 B 型細(xì)胞的滑膜具有比混有A型和B型細(xì)胞的滑膜更強(qiáng)的成軟骨能力，這一結(jié)果更加證明了 SDSCs來(lái)源于 B 型細(xì)胞的論斷[11]。由于A型細(xì)胞沒(méi)有B型細(xì)胞增殖快，所以細(xì)胞培養(yǎng)三代后就會(huì)得到富集B型細(xì)胞的細(xì)胞群。A型SMSCs具有更強(qiáng)的增殖和群落形成能力，且能夠分泌大量的淺表層蛋白（SZP）[12]。

本研究中采用CCK-8法檢測(cè) SMSCs的增殖能力 ，與 MTT 方 法相比 具有顯 著的特 點(diǎn)[13]：①靈敏 度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好；②操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力；③水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細(xì)胞；④無(wú)需放射性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低；⑤為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開(kāi)即用；⑥適合于高通量藥物篩選。從 SMSCs增殖曲線圖可以得出，傳代后的SMSCs具有極強(qiáng)的增殖能力，在第7天時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)的最高峰，倍增時(shí)間約為 30.2 h。

雖然SMSCs有別于其他MSCs，但它們的表面抗原決定簇表達(dá)和免疫抑制能力具有相似性。SMSCs與BMSCs的表面抗原決定簇差異極小，且至今為止還未發(fā)現(xiàn)能明顯識(shí)別SMSCs的表面抗原決定簇。兩種細(xì)胞類型都對(duì)CD14、CD34和CD45表達(dá)呈陰性，對(duì)CD44、CD73、CD90和CD105表達(dá)呈陽(yáng)性；平均熒光強(qiáng)度無(wú)顯著差異，但SMSCs中CD90平均熒光強(qiáng)度較高，這一發(fā)現(xiàn)或許可以解釋為何SDSCs有較高的成軟骨能力[14]。SMSCs對(duì) CD9、CD10、CD13、CD54、CD55、CD166 和 D7-FIB 表達(dá)亦呈陽(yáng)性，但這些標(biāo)記分子并不是SMSCs獨(dú)有的。本研究中，流式細(xì)胞儀對(duì) SMSCs的鑒定結(jié)果顯示 CD44、CD106、CD105、CD90的陽(yáng)性表達(dá)率在99.9%以上。

圖4 免疫細(xì)胞熒光染色鑒定滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)

圖5 RT-PCR 檢測(cè)成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)過(guò)程中相關(guān)基因表達(dá)

SMSCs具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及肌細(xì)胞等多種終末細(xì)胞定向分化的能力[3]。本研究中，將SMSCs分別進(jìn)行成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)，從細(xì)胞特異性染色、RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞特異性基因表達(dá)等方面對(duì)SMSCs的分化能力鑒定，結(jié)果顯示SMSCs具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化的能力。綜上所述，我們從人的滑膜組織中成功分離培養(yǎng)出了干細(xì)胞，即滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)人SMSCs的研究還處于起步階段，盡管人們對(duì)SMSCs的體內(nèi)外增殖能力、多項(xiàng)分化 潛 能 等 方 面 進(jìn) 行 了 廣 泛 深 入 的 研 究[15]，但 是 對(duì)SMSCs本身生理學(xué)、免疫學(xué)等基本功能的研究還缺乏相應(yīng)的廣度和深度。在成軟骨能力方面，SMSCs相對(duì)于其他組織來(lái)源的MSC具有組織特異性優(yōu)勢(shì)，但其軟骨產(chǎn)物還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠完善，如果要實(shí)現(xiàn)軟骨的完全再生，還必須解決幾個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域問(wèn)題，如獨(dú)特的能將MSCs分離鑒別出來(lái)的細(xì)胞表面標(biāo)記分子、在開(kāi)發(fā)過(guò)程中模擬人體自然生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子、確保再生表面與自然組織正常協(xié)同運(yùn)作的生物摩擦等。我們相信，SMSCs作為一種新的種子細(xì)胞必將在組織工程、基因治療和再生醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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Isolation and identification of human synovial mesenchymal stem cells*

CHEN Song1,FU Peiliang1△,CONG Ruijun1,WU Haishan1**,XU Zhenyu2
(1.Department of Joint Center,Shanghai Changzheng Hospital,Shanghai 200003;2.Section of Histology&Embryology, Basic Research Department,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

Synovial mesenchymal stem cells;Isolation;Identification;Adipogenic differentiation;Osteogenic differentiation;Chondrogenic differentiation

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81000798）

△為共同第一作者

**通信作者：吳海山，E-mail:wuhaishan@vip.sina.com