劉曉陽 邱貴興 翁習(xí)生 吳志宏 于斌 王以朋

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸中的表達(dá)研究

劉曉陽 邱貴興 翁習(xí)生 吳志宏 于斌 王以朋*

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730）

背景：長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNAs）是真核細(xì)胞中 一類長(zhǎng)度 超過 200 核苷酸的非編碼 RNA 分子，與人類眾多疾病的發(fā)生有密切的關(guān)系。然而，lncRNAs在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸（AIS）的表達(dá)情況尚不清楚。

目的：利用基因芯片篩選AIS患者外周血中差異表達(dá)的lncRNAs和mRNAs，分析lncRNAs在 AIS發(fā)病中的可能作用。

方法：選取 2013 年北京協(xié)和醫(yī)院就診的 20 例 AIS 患者和 20 例正常對(duì)照。利用 Agilent human lncRNA+mRNAArray V3.0 微陣列芯片檢測(cè) 4 例 AIS 患 者和 4 例年齡匹配的正常對(duì)照的 lncRNAs和 mRNAs表達(dá)，對(duì)差異表達(dá)的 mRNAs進(jìn)行GO、Pathway 分析，構(gòu)建 lncRNAs和 mRNAs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè) lncRNAs的可能調(diào)控靶點(diǎn)。

結(jié)果：AIS 患者中差異表達(dá)的 lncRNAs有 139 條，差異表達(dá)的 mRNAs有 546 條。GO 分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的 mRNAs產(chǎn)物主要參與蛋白結(jié)合、金屬離子結(jié)合、核苷酸結(jié)合、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、RNA剪切等。差異表達(dá)的mRNAs主要參與細(xì)胞黏附分子、Wnt通路、Toll樣受體通路、MAPK 通路等。靶基因預(yù)測(cè)，7 條 lncRNAs可能通過調(diào)節(jié) mRNAs的表達(dá)參與了 AIS的發(fā)病。結(jié)論 ：本研 究發(fā) 現(xiàn)了 AIS 患 者外 周 血 中 差 異 表 達(dá) 的 lncRNAs 和 mRNAs。lncRNAs可能 通過 調(diào)控 mRNA 的 表 達(dá) 參 與AIS的發(fā)病或發(fā)展。

特發(fā)性脊柱側(cè)凸；青少年；長(zhǎng)鏈非編碼RNA

Background:Long noncoding RNAs(lncRNAs)are broadly classified as transcripts longer than 200 nucleotides,which function in a wide range of diseases.Expression profile of lncRNAs inAIS was still unclear.

Objective:To detect differentially expressed lncRNAs and mRNAs in peripheral blood samples from AIS patients using microarray and explore the role of lncRNAin the pathogenesis ofAIS.

Methods:A total of 20 AIS patients from Peking Union Medical College Hospital were recruited as cases together with 20 healthy controls.Peripheral blood was collected from 4 patients with AIS and 4 age-matched normal children and tested with Agilent human lncRNA+mRNA Array V3.0.GO and Pathway analysis was performed.The coding-non-coding gene co-expression network was constructed based on the correlation analysis.Target regulated by lncRNAs was predicted with bioinformatic prediction.

Results:A total of 139 deregulated lncRNAs and 546 deregulated mRNAs were detected in AIS patients.GO Term enrichment in the differentially expressed mRNA list included protein binding,metal ion binding,nucleotide binding,regulation of transcription,RNA splicing et al.Differentially expressed mRNAs may involve in Cell adhesion molecules,Wnt signaling pathway,Toll-like receptor signaling pathway,MAPK signaling pathway and so on.Seven lncRNAs may regulate mRNAs expression in pathogenesis ofAIS.

Conclusions:This is the first time to find lncRNAs and mRNAs expression in AIS patients using microarray.Differentially expressed lncRNAs may play a role in the pathogenesis ofAIS.

青 少 年 特 發(fā) 性 脊 柱 側(cè) 凸（adolescent idiopathic scoliosis,AIS）占特發(fā)性脊柱側(cè)凸總數(shù)的 80%左右，累及脊柱、胸廓、肋骨、骨盆，不但影響外觀，還嚴(yán)重影響生命質(zhì)量及預(yù)期壽命。大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，AIS 患者的子女患病率高達(dá) 27%，遠(yuǎn)高于人群發(fā)病率[1]，單卵雙生的 AIS 發(fā)病一致性遠(yuǎn)高于異卵雙生子，提示 AIS 具有遺傳傾向[2]。目前連鎖分析定位了一些 AIS 病因相關(guān)區(qū)域[3,4]，關(guān)聯(lián)分析也發(fā)現(xiàn)了一些基因多態(tài)性與 AIS 的臨床特征相關(guān)[5,6]。然 而 ，不同研究的結(jié)論并不一致[7]。無論是連鎖分析的陽性連鎖區(qū)域還是關(guān)聯(lián)分析的陽性基因，均不能很好解釋AIS的遺傳方式和發(fā)病機(jī)制。

長(zhǎng) 鏈 非 編 碼 RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是一類在真核細(xì)胞內(nèi)被普遍轉(zhuǎn)錄的長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的功能性RNA分子，不具有或很少具有蛋 白 編碼 功 能，但可通 過 RNA-蛋白、RNA-DNA 或RNA-RNA 等 多 種 相 互 作 用 方 式 發(fā) 揮 調(diào) 控 功 能[8-10]?，F(xiàn)有研究已證實(shí)，lncRNAs在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，許多疾病與lncRNAs的調(diào)控有密切的關(guān)系[11,12]。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未開展 AIS 發(fā)病機(jī)制中 lncRNAs的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn) AIS 的 lncRNAs表達(dá)譜系對(duì)于進(jìn)一步研究AIS的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用病例-對(duì)照研究方法，病例組為 2013年4 月至2013年10月在北京協(xié)和醫(yī)院就診的20例中國(guó)漢族 人 群 青 少 年 女 性 AIS 患 者 ，年 齡（14.0± 2.0）歲 ，Cobb 角范圍為 47.4°±12.4°。所有患者的體格檢查和閱片均由同一名醫(yī)師完成，根據(jù)以下診斷標(biāo)準(zhǔn)確診：全脊柱側(cè)位片顯示Cobb角＞15°伴椎體旋轉(zhuǎn)，無椎體的先天性畸形，無椎旁肌萎縮，并排除馬凡綜合征、神經(jīng)纖維瘤病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、骨骺發(fā)育不良等疾病。對(duì)照組為年齡匹配的正常對(duì)照20例，排除脊柱畸形疾病及家族史、內(nèi)分泌疾病等。采集所有受試者的臨床資料、影像學(xué)資料，清晨空腹安靜狀態(tài)下抽靜 脈 血 6 ml，采 血 后 立 即 與 3 倍 體 積 的 Trizol LS 混勻，分裝至EP管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主 要 試 劑 ：Trizol LS（美 國(guó) Ambion 公 司 ）；異 丙醇、氯仿、無水乙醇（上海化學(xué)試劑有限公司）；RNA純 化 試 劑 盒（德 國(guó) QIGEN 公 司 ），PrimeScript RT reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程有限公司）；定量PCR檢測(cè)試劑盒（寶生物工程有限公司）?；蛐酒瑱z測(cè)使用 Agilent human lncRNA+mRNAArray V3.0，委托北京博奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.2.2 主要 儀器 ：ND-1000 超微 量分 光光 度計(jì)（美 國(guó)NanoDrop 公司）；普通 PCR 儀（美國(guó) ABI公司）；Realtime PCR 儀（寶 生 物 工 程 有 限 公 司）；-80℃ 冰 箱 、高速冷凍離心機(jī)等設(shè)備以及其他常規(guī)儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因芯片檢測(cè)：年齡匹配的 4 例 AIS 患者和 4 例正常對(duì)照進(jìn)行基因芯片分析。外周血和 Trizol LS 凍存混合液室溫融化后劇烈搖勻；使用化學(xué)試劑發(fā)提取 全 血 總 RNA，并 使 用 QIAGEN Rneasy Kit純 化RNA，所 得總 RNA OD260/OD280≥1.8，電 泳 檢 測(cè) 有清晰的 18S 和 28S rRNA 條帶，同時(shí)28S/18S 的比例接近1∶1。反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，進(jìn)一步合成Cy3熒光標(biāo)記cRNA，測(cè)定濃度和純度后上芯片進(jìn)行雜交。使用 Agilent芯片掃描儀（G2565CA）對(duì)清洗后的芯片進(jìn)行掃描，得到雜交圖片。

1.3.2 基因芯片數(shù)據(jù)分析：提取雜交圖片數(shù)據(jù)并進(jìn)行歸一化處理獲得各區(qū)域熒光強(qiáng)度，經(jīng)過折疊倍率（fold change,FC）篩選 ，篩 選 出 所 有 差 異 表 達(dá) 的 lncRNAs和 mRNAs，參數(shù)選擇標(biāo)準(zhǔn)為 P＜0.05，F(xiàn)C＞2。

基 因 本 體 論（gene ontology,GO）分 析 描 述 差 異表達(dá)的 mRNAs的功能屬性?；谧钚碌?Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異表達(dá)的mRNAs數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)途徑分析，明確差異表達(dá)的mRNAs數(shù)據(jù)主要富集分布于哪些生物學(xué)途徑。構(gòu)建編碼基因和非編碼基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（the coding-non-coding gene co-expression network），直觀顯示 lncRNAs和 mRNAs之間的相關(guān)性。在 lncRNAs和 mRNAs共表 達(dá)基礎(chǔ) 上預(yù) 測(cè) lncRNAs的 可能調(diào)控靶點(diǎn)。Cis-預(yù)測(cè)尋找基因組位置在 10 kb 之內(nèi)的 lncRNA-mRNA 對(duì)，Trans-預(yù)測(cè)對(duì)lncRNA 和mRNA序列進(jìn)行比對(duì)，篩選序列相似的 lncRNA-mRNA 對(duì)。1.3.3 定量 PCR：以年齡匹配的 20 例 AIS 患者和 20 例正常女性為研究對(duì)象，選取差異表達(dá)較明顯的、靶基因預(yù)測(cè)顯示可能參與 AIS 發(fā)病的 lncRNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。

2 μg 總 RNA 去除 DNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。實(shí)時(shí)定 量 PCR 采 用 20 μl反 應(yīng) 體 系 ，包 括 SYBR Premix（10 μl）、正向引物（0.4 μl）、反向引物（0.4 μl）、cDNA模板（1 μl）、雙蒸水（8.2 μl）。定量 PCR 所用引物由北 京 Inventrogen 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成（ 表 1）。94℃反應(yīng) 5 min；變性和擴(kuò)增和延伸，94℃反應(yīng) 30 s，58℃反應(yīng) 30 s，72℃反 應(yīng) 40 s，共 40 個(gè)循 環(huán) ；72℃反應(yīng)7 min。采用△△cycle threshold（△ △ Ct）方 法 進(jìn) 行定量分析[13]。每樣本重復(fù) 3 次，基因平均拷貝數(shù)經(jīng)管家基 因 3-磷 酸 甘 油 醛 脫 氫 酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）的 拷 貝 數(shù) 校 正 。 計(jì) 算2-△△Ct值，即為實(shí)驗(yàn)組的目的基因表達(dá)量是對(duì)照組表達(dá)量的百分?jǐn)?shù)，大于200%為表達(dá)上調(diào)，小于50%為表達(dá)下調(diào)。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物

2 結(jié)果

2.1 芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 差異表達(dá) lncRNAs 和 mRNAs：采用 Agilent human lncRNA+mRNAArray V3.0 檢測(cè)，AIS 患者有 139條 lncRNAs差異表達(dá)。其中上調(diào)的 lncRNAs 120 條，下 調(diào) 的 lncRNAs 19 條 。 差 異 表 達(dá) 的 mRNAs 共 546條，上調(diào)表達(dá) mRNAs 512 條，下調(diào)表達(dá)的 lncRNA 34條 。 上 調(diào) 、下 調(diào) 倍 數(shù) 最 明 顯 的 10 條 lncRNAs 和mRNAs分別見表2和表3。通過分層群聚圖可直觀的看到 AIS 組與 NC 組 lncRNAs與 mRNAs的差異表達(dá)（圖1A和圖1B）。從紅色到綠色，顏色越深差異表達(dá)越明顯。

2.1.2 GO、Pathway 分析：GO 功能分類注釋得出 ，差 異表達(dá)的mRNAs參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA剪切、凋亡、細(xì)胞周期過程、生物學(xué)周期過程等過程。Pathway 分 析 顯示，差異表達(dá) mRNAs在 細(xì) 胞黏附分子、造血細(xì)胞、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、結(jié)直腸癌、Wnt信號(hào)通路等方面功能的基因有顯著地變化。

2.1.3 CNC 網(wǎng) 絡(luò) 圖 ：相 關(guān) 性 分 析 發(fā) 現(xiàn) ，共 64 對(duì) lncRNAs-lncRNAs相關(guān)性 、280 對(duì) lncRNAs-mRNAs相關(guān)性根據(jù)基因之間的相關(guān)性，構(gòu)建CNC網(wǎng)絡(luò)圖。圖2顯 示 的 AIS 患 者 降 低 表 達(dá) 最 多 的 lncRNA p1842 的CNC 網(wǎng) 絡(luò) 圖 。 p1842 同 時(shí) 與 8 條 lncRNAs 和 13 條mRNAs具有相關(guān)性。

2.1.4 lncRNAs的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：經(jīng)過Cis-和Trans-預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) ，7 條 lncRNAs（uc002ddj.1,uc021tnw.,uc021zdc.1, HIT000067310,ENST00000577528.1,ENST0000060-2322.1,TCONS_00001429）可 能調(diào) 控 5 條 mRNAs的表達(dá)（表4）。

2.2 定量PCR

選取靶基因可能參與運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)發(fā)育的lncRNAs（ENST00000602322.1 和 HIT000067310）以及差異表達(dá) 最 多 的 lncRNAs（ENST00000440778.1、TCONS_ 00028768 和 ENST00000414894.1）用 定 量 PCR 對(duì) 基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，4條lncRNAs在擴(kuò)大樣本中得到較好的驗(yàn)證，qPCR的結(jié)果與芯片數(shù)據(jù)趨勢(shì)基本一致（圖3），1條lncRNA的基因芯片結(jié)果未能在擴(kuò)大樣本中得到驗(yàn)證。

3 討論

人類基因組中只有不到2%的序列編碼蛋白質(zhì)，除去大約7%的非轉(zhuǎn)錄區(qū)，其余91%的基因組序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼 RNA[14]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)研究的不斷深入，現(xiàn)在越來越多的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（1ncRNAs）被鑒定出來，并成為病因?qū)W研究和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中一個(gè)全新的熱點(diǎn)。現(xiàn)有研究表明，lncRNAs的表達(dá)紊亂與多種人類重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11,15-17]，對(duì) lncRNAs 的 深 入 研 究 對(duì) 于推動(dòng)人們對(duì)生命現(xiàn)象的重新闡釋具有重大意義。本研究揭示了 AIS 疾病中的 lncRNAs表達(dá)輪廓，對(duì)于進(jìn)一步研究和探討AIS的發(fā)病機(jī)制具有重要的作用和意義。

表2 與正常對(duì)照組比較，AIS組差異表達(dá)前 10 位 lncRNAs

表3 與正常對(duì)照組比較，AIS 組差異表達(dá)前10位的mRNAs

基因轉(zhuǎn)錄是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的生物學(xué)過程。lncRNAs作為細(xì)胞中的重要調(diào)控因子，也參與了基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此研究中的ENST00000602322.1位于11 號(hào) 染 色 體 長(zhǎng) 臂 上 ，緊 鄰 Pcf11（Protein 1/Cleavage Factor 1）。Pcf11 的編碼蛋白參與 pre-mRNA 剪切[18]，在調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始、延長(zhǎng)以及mRNA的從核內(nèi)向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[19-21]。Pcf11 在轉(zhuǎn)錄和 pre-mRNA 剪切中的作用主要是通過與 RNA 聚合酶 II的 C 端 結(jié) 構(gòu)域（RNA polymerase Ⅱ C-terminal domain（Poly Ⅱ CTD）和多聚腺苷酸因子結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的[22,23]。Poly Ⅱ CTD 的磷酸化狀態(tài)直接影響 Pcf11 與RNA 聚合酶Ⅱ的結(jié)合，lncRNAs作為順式調(diào)控因子間接影響 Pcf11 和 pre-mRNA 的結(jié)合[24,25]。鑒于 Pcf11在調(diào)控轉(zhuǎn)錄和mRNA剪切過程中的重要作用，差異表 達(dá) 的 Pcf11 可 能 參 與 了 AIS 發(fā) 病 及 發(fā) 展 。ENST00000602322.1對(duì) Pcf11 轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控機(jī)制也需要在將來研究中進(jìn)一步確認(rèn)。

定量 PCR 結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，4 條 lncRNAs的表達(dá)趨勢(shì)完全一致，只是qPCR結(jié)果較芯片數(shù)據(jù)的差異倍數(shù)有所減小。1條 lncRNAs的芯片數(shù)據(jù)未能在大樣本中得到驗(yàn)證，原因可能是芯片檢測(cè)的偶然誤差，也可能是由于樣本的個(gè)體特征差異引起。部分lncRNAs的群體表達(dá)特征還需要大樣本人群來驗(yàn)證。ENST00000440778.1 在 AIS 組和 NC 組間的差異僅為 FC=2.17，芯片數(shù)據(jù)與 qPCR 結(jié)果有一定的差距，原因可能是用于芯片檢測(cè)的樣本不能很好的代表人群中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)輪廓。

圖 1 差異表達(dá)的 lncRNAs（左圖）和 mRNAs（右圖）分層群聚圖

圖 2 p1842的 CNC網(wǎng)絡(luò)圖三角形代表lncRNA，圓形代表mRNA

表 4 lncRNAs及其 mRNAs預(yù)測(cè)靶點(diǎn)信息

圖3 定量PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果

在組織分化和發(fā)育過程中，lncRNAs的表達(dá)具有時(shí)間特異性和空間特異性[26]。lncRNAs較 mRNAs具有更高的特異性，還具有易于檢測(cè)的特性，采用普通PCR 即可完成[27,28]。因此，該研究發(fā)現(xiàn)的 AIS 患者特異性表達(dá)的 lncRNAs對(duì)于將來發(fā)掘 AIS 患者的特異性診斷和預(yù)后標(biāo)記具有重要的指導(dǎo)意義。

我們的研究也具有局限性：①研究發(fā)現(xiàn)了大量AIS 患者 差 異表 達(dá)的 lncRNAs，這些 差 異表 達(dá)的 lncRNAs 可 能 參 與 了 AIS 的 發(fā) 病 。 但 是 ，缺 乏 lncRNAs的更詳細(xì)信息以及它們?cè)?AIS發(fā)病中的確切機(jī)制。②用于芯片檢測(cè)的樣本每組僅有4對(duì)，可能會(huì)遺漏一些信息，降低了篩選生物標(biāo)記的準(zhǔn)確性。③此 研 究 標(biāo)本取自外周血，差 異 表 達(dá)的 lncRNAs還需要在骨骼肌肉系統(tǒng)中進(jìn)一步驗(yàn)證。但是，獲取正常青少年的骨骼肌肉具有相當(dāng)大的難度。因此，將經(jīng)外周血篩查發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的 lncRNAs與 AIS 患者骨骼肌肉系統(tǒng)中的表達(dá)狀況進(jìn)行比對(duì)，可能進(jìn)一步 縮小 AIS 發(fā) 病相 關(guān) lncRNAs的篩 選范圍 ，該 研 究為進(jìn)一步探討 lncRNAs在 AIS 發(fā)病機(jī)制中的作用打下了基礎(chǔ)。

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Study on expression of long non-coding RNAin adolescent idiopathic scoliosis

LIU Xiaoyang,QIU Guixing,WENG Xisheng,WU Zhihong,YU Bin,WANG Yipeng*

(Department of Orthopedic Surgery,Peking Union Medical College Hospital,ChineseAcademy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Beijing 100730,China)

idiopathic scoliosis;adolescent;long non-coding RNA

*通信作者：王以朋，E-mail:ypwang133@163.com