王建舫

（北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

雞致病性大腸桿菌的分離鑒定

王建舫

（北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

無(wú)菌采取病死雞腦、肝臟、脾臟和腎臟接種于麥康凱瓊脂平板，分離出特征性的大腸桿菌菌落，經(jīng)生化和血清型鑒定，鑒定出該分離菌為腸埃希氏菌1型，血清型為O78，但與O92血清型有很高的交叉。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：該分離菌株對(duì)頭孢拉定、頭孢噻吩和頭孢氨芐有耐藥性，而對(duì)頭孢曲松中度敏感，對(duì)卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星敏感。致病力試驗(yàn)顯示：腿部肌肉注射的雛雞全部死亡，腹腔注射的雛雞部分死亡，其他雞只健康存活。

大腸桿菌；血清型；耐藥性；致病力

雞大腸桿菌病是由致病血清型大腸桿菌引起雞的細(xì)菌性傳染病，臨床上可表現(xiàn)為急性敗血癥、氣囊炎、肝周炎、心包炎、卵黃性腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、眼炎、關(guān)節(jié)炎、臍炎、肉芽腫以及肺炎等，最常見(jiàn)的是急性敗血癥和卵黃性腹膜炎[1]。各品種和日齡的雞均可感染，但是肉仔雞最易感。為控制大腸桿菌在肉仔雞群中的傳播，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)送檢的病、死肉雛雞進(jìn)行了病原的分離鑒定，并對(duì)分離菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和致病力試驗(yàn)，為有效防制該雞場(chǎng)的大腸桿菌病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2012年11月河北某肉種雞場(chǎng)送檢的疑似大腸桿菌病的3日齡病死雞，至送檢時(shí)已損失7%。

1.2 剖檢癥狀

趾部和頭部部分雞輕微發(fā)紺，外觀(guān)不見(jiàn)明顯脫水，肝臟黃棕色，稍腫大，質(zhì)軟，多色彩。脾臟4/6紫紅，少血，腎臟4/6出血，臍帶部位有出血點(diǎn)。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無(wú)菌采取病死雞的腦、肝臟、脾臟和腎臟，接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h，然后挑取玫瑰紅色、圓形、隆起、光滑濕潤(rùn)邊緣整齊的單個(gè)菌落分別接種于麥康凱瓊脂平板和營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18h[2]。培養(yǎng)好的麥康凱瓊脂平板放于4℃冰箱備用。

1.4 細(xì)菌學(xué)形態(tài)觀(guān)察

培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯抹片，革蘭氏染色后鏡檢。

1.5 細(xì)菌的鑒定

生化實(shí)驗(yàn)由農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心用法國(guó)梅里埃生化鑒定卡進(jìn)行。血清型分型由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和本實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)行。

1.6 藥敏試驗(yàn)

挑取玫瑰紅色、圓形、隆起、光滑濕潤(rùn)邊緣整齊的單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)。待菌液OD600值達(dá)到0.25[3]時(shí)，用無(wú)菌棉拭子蘸取菌液，于管壁上擠去多余液體，涂布整個(gè)MH瓊脂表面，反復(fù)涂布幾次，每次將平面旋轉(zhuǎn)60度，保證涂布均勻。蓋上平皿室溫下放置5min，使培養(yǎng)基表面的水分吸收掉，用無(wú)菌眼科鑷子將含卡那霉素、頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢曲松、慶大霉素、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的藥敏紙片貼于平皿上，每個(gè)平皿貼5種藥敏紙片，紙片與紙片中心距離不得小于24mm。紙片貼好后15min內(nèi)，將平皿倒放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)20h。結(jié)果判斷依據(jù)《紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)（第四版）》進(jìn)行。

1.7 致病力試驗(yàn)

1.7.1 菌液制備

將分離菌接種于3ml營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)3～4h，使其細(xì)菌數(shù)達(dá)到2*108CFU/ml，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 動(dòng)物試驗(yàn)

（如下表所示）1日齡健康肉雞36只，隨機(jī)分成A、B、C、D四個(gè)大組，每個(gè)大組又隨機(jī)分為1、2、3三個(gè)小組，其中4個(gè)1組按不同的接種途徑接種細(xì)菌菌液100ul，接種劑量為2*107CFU；同樣2組也按不同的接種途徑接種細(xì)菌菌液100ul，接種劑量為2*106CFU；3組接種100ul滅菌生理鹽水作為對(duì)照。隔離飼養(yǎng)。死亡雞只死后立即剖檢，未死雞只6天全部剖檢，所有的雞無(wú)菌采取腦、肝臟、脾臟和腎臟，接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h。

2 結(jié)果

2.1 病死雞的病理剖檢變化

外觀(guān)不見(jiàn)明顯脫水，腦內(nèi)未見(jiàn)明顯變化，肝臟黃棕色，稍腫大，質(zhì)軟，多色彩。脾臟4/6紫紅，少血，腎臟4/6出血；部分雞有“三炎”癥狀。

2.2 細(xì)菌分離

在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上37℃培養(yǎng)18h后，形成中等大小，圓形微凸起，表面光滑濕潤(rùn)，淺灰色半透明大菌落。在麥康凱瓊脂平板上7℃培養(yǎng)18h后，形成玫瑰紅色、圓形、隆起、光滑濕潤(rùn)邊緣整齊的大菌落。

2.3 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀(guān)察

取病死雞腦、肝臟、脾臟和腎臟等組織培養(yǎng)物涂片染色鏡檢，均可見(jiàn)兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，偶爾有2～3個(gè)連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。

2.4 細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.4.1 生化試驗(yàn)結(jié)果

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，此次分離的大腸桿菌對(duì)硝基-苯-β-D-吡喃半乳糖苷酶、賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、葡萄糖、色氨酸顯示陽(yáng)性，檸檬酸鈉、苯丙氨酸鹽、丙二酸、七葉靈、阿東醇、纖維二糖、丙酮酸鹽、細(xì)胞色素氧化酶顯示陰性結(jié)果。根據(jù)法國(guó)梅里埃生化鑒定編碼冊(cè)，本實(shí)驗(yàn)室分離的細(xì)菌符合大腸埃希氏菌1型的特征。

2.4.2 血清型試驗(yàn)

血清型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：此次分離的大腸桿菌能夠與O78和O92單因子血清進(jìn)行玻板凝集，試管凝集反應(yīng)的凝集價(jià)分別為640和320，故判斷該大腸桿菌的血清型為O78。

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：頭孢拉定、頭孢噻吩和頭孢氨芐沒(méi)有抑菌圈，該分離菌株對(duì)這三種藥物有耐藥性，而對(duì)頭孢曲松中度敏感，對(duì)卡那霉素、慶大霉素、氨芐西林、氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星敏感。建議該場(chǎng)慎用頭孢類(lèi)和青霉素類(lèi)藥物，輪換使用卡那霉素和慶大霉素等氨基糖苷類(lèi)和喹諾酮類(lèi)藥物。

2.6 致病力試驗(yàn)

A1組雛雞48h內(nèi)全部死亡，A2組雛雞在72h內(nèi)全部死亡，C1組66h有1只死亡，C1組其他雛雞和其他組雛雞健康存活。剖檢：死亡雞肝臟黃棕色，稍腫大，質(zhì)軟，多色彩，脾臟紫紅，少血，腎臟出血，有“三炎”癥狀，與發(fā)病病死病理變化相似。其他雛雞沒(méi)有明顯的臨床癥狀。所有的雞無(wú)菌采取腦、肝臟、脾臟和腎臟，接種于麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h，結(jié)果顯示：死亡雞只的組織培養(yǎng)物均長(zhǎng)出玫瑰紅色、圓形、隆起、光滑濕潤(rùn)邊緣整齊的大菌落，未死雞的組織培養(yǎng)物均未長(zhǎng)菌。

3 小結(jié)與討論

（1）致病性大腸桿菌廣泛存在于患病雞，隱性感染雞的體內(nèi)和外界環(huán)境中，易感雞群可通過(guò)飼料飲水經(jīng)消化道傳播。通風(fēng)不良、密度過(guò)大、應(yīng)激、環(huán)境衛(wèi)生較差、飼料營(yíng)養(yǎng)部全及某些疫苗的免疫接種等都可促進(jìn)本病的發(fā)生。該場(chǎng)的種雞由國(guó)外空運(yùn)而來(lái)，進(jìn)雞后34h開(kāi)始發(fā)病死亡，但是同一棟的4欄中只有2欄發(fā)病，另外2欄未見(jiàn)異常。懷疑是在運(yùn)輸途中由于運(yùn)輸工具消毒不徹底或者該場(chǎng)的器具消毒不徹底造成了致病性大腸桿菌經(jīng)臍帶進(jìn)入雛雞體內(nèi)而發(fā)生的感染。

（2）在藥敏試驗(yàn)結(jié)果的指導(dǎo)下，該場(chǎng)于4日齡應(yīng)用敏感性藥物，9日齡時(shí)死亡基本控制住，說(shuō)明我們的耐藥性試驗(yàn)對(duì)于生產(chǎn)上臨床用藥起到了指導(dǎo)作用。

（3）大腸桿菌臨床分離菌株通過(guò)不同的途徑和不同的劑量接種雛雞，結(jié)果顯示：在腿部肌肉、口服、腹腔注射和滴鼻四種途徑接種途徑中，腿部肌肉注射的致病性最強(qiáng)，腹腔注射次之，而口服和滴鼻無(wú)可見(jiàn)的致病性癥狀，也沒(méi)有分離到接種菌，可能是由于致病菌沒(méi)有進(jìn)入機(jī)體或者是由于多數(shù)細(xì)菌從消化道和呼吸道道排除體外，從而使實(shí)際進(jìn)入機(jī)體的細(xì)菌量大大減少而使機(jī)體耐過(guò)。

[1] 吳清民.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2001：156-161.

[2] 曹澍澤.獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M].北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992.

[3] F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓等，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M].科學(xué)出版社，1998：6-7.

2.6 杜絕污染，合理用藥

畜禽尿、便等污物要按規(guī)定達(dá)標(biāo)后排放，嚴(yán)禁對(duì)環(huán)境造成污染。對(duì)病死畜要按有關(guān)規(guī)定處理，不得隨意丟棄、宰殺或處理。發(fā)病時(shí)切忌隨意用藥，以防影響疫病防治效果和畜禽產(chǎn)品質(zhì)量。

2.7 全面培訓(xùn)，科學(xué)飼養(yǎng)

對(duì)養(yǎng)殖戶(hù)要開(kāi)展技術(shù)培訓(xùn)，使他們盡快掌握畜禽飼養(yǎng)管理技術(shù)，做到戶(hù)戶(hù)科學(xué)養(yǎng)殖，從而提高養(yǎng)殖技術(shù)水平，擴(kuò)增養(yǎng)殖小區(qū)建設(shè)的實(shí)效。

2.8 加強(qiáng)管理，完善制度

養(yǎng)殖小區(qū)由于養(yǎng)殖密度高，必須加強(qiáng)統(tǒng)一管理并建立相應(yīng)的制度。如小區(qū)人員和物品出入管理制度、獸藥、疫苗購(gòu)進(jìn)使用登記管理制度等。

在庭院式經(jīng)營(yíng)弊端出現(xiàn)后，人們選擇了養(yǎng)殖小區(qū)，它以“小農(nóng)戶(hù)、大群體”的畜牧業(yè)新型組織形式出現(xiàn)，進(jìn)行著畜禽養(yǎng)殖的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化生產(chǎn)。而構(gòu)筑養(yǎng)殖小區(qū)的“生物安全”屏障，則是解決畜牧業(yè)發(fā)展瓶頸問(wèn)題的重要途徑，也是實(shí)現(xiàn)動(dòng)物安全生產(chǎn)及其產(chǎn)品質(zhì)量安全衛(wèi)生的必然選擇，同時(shí)可以加速推進(jìn)畜牧業(yè)規(guī)?；?、規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和安全化生產(chǎn)的進(jìn)程。