王 彩綜述 魏素菊審校

機體免疫系統(tǒng)通過免疫監(jiān)視功能，識別和清除包括腫瘤、微生物等“非己”成分，維持機體的穩(wěn)定。惡性腫瘤在機體內(nèi)往往表現(xiàn)出免疫逃逸的特殊狀態(tài)，與機體抗腫瘤的免疫效應(yīng)之間形成一對此消彼長的矛盾關(guān)系。近些年研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)可通過抑制激活的 T 細(xì)胞功能，影響機體抗腫瘤免疫作用，在維持自身免疫耐受性中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤免疫逃逸關(guān)系密切[1]。機體的細(xì)胞免疫受抑是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要原因。許多腫瘤患者的外周血和腫瘤組織中的Treg細(xì)胞比例升高，往往提示著預(yù)后不良[2]。因此，近年來通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的數(shù)量或功能來增強機體抗腫瘤免疫成為腫瘤免疫治療的焦點。本文就CD4+CD25+Treg細(xì)胞的生物學(xué)特征、免疫抑制機制及其在腫瘤免疫中的作用作一綜述。

1 CD4+CD25+Treg細(xì)胞概述

1.1 CD4+CD25+Treg細(xì)胞的分類及分子標(biāo)志

1995年，Sakaguchi等首次報道在人和小鼠的外周血中有 5%～10%的CD4+T 細(xì)胞持續(xù)高表達(dá) CD25分子，去除這群T細(xì)胞的裸鼠會發(fā)生多種自身免疫性疾病，而將去除的細(xì)胞群重新回輸，則可預(yù)防疾病的發(fā)生。這一現(xiàn)象提示CD4+CD25+T細(xì)胞有可能是維持自身免疫耐受的重要因素，對免疫功能具有調(diào)節(jié)作用,隨之產(chǎn)生了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)的概念。此后，該類細(xì)胞逐漸成為免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱點。目前認(rèn)為Treg細(xì)胞是1個異質(zhì)性群體，根據(jù)其來源和效應(yīng)機制分為兩類：天然型CD4+CD25+Foxp3+Treg(nTreg)和誘導(dǎo)性Treg(iTreg)[3]。nTreg在胸腺中產(chǎn)生，成熟后遷移至外周淋巴系統(tǒng)。它占外周血CD4+細(xì)胞的5%～10%，表達(dá)IL-2 受體的α 鏈(即CD25)，主要通過與效應(yīng)細(xì)胞之間的直接接觸介導(dǎo)免疫抑制作用，從而維持機體免疫耐受及抑制自身免疫性疾病。iTreg細(xì)胞主要由外周成熟的CD4+T細(xì)胞在特定的抗原和(或)IL-2、TGF-β 等細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為具有Treg 細(xì)胞功能特征的細(xì)胞群。iTreg可分為Tr1(CD4+CD25+/-Foxp3-IL-10highregulary1 T cells)和Th3(CD4+CD25+/-Foxp3-TGF-βhighhelper3 T cells)2種亞群，分別主要通過分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫抑制功能。除上述兩大類Treg細(xì)胞外，CD8+CD28-Treg、CD3+CD4-CD8-Treg和外周血天然殺傷 T 細(xì)胞等[4]其他一些Treg 細(xì)胞也逐漸被人們所認(rèn)知。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞可表達(dá)多種分子，如抑制性共刺激分子 CTLA-4、腫瘤壞死因子受體超家族成員GITR、Toll 樣受體4、趨化因子受體CCR4、程序性死亡受體1、淋巴細(xì)胞抗原復(fù)合體6等。其中某些分子曾作為Treg細(xì)胞的常用標(biāo)記，但由于它們同時也表達(dá)于活化的效應(yīng)性淋巴細(xì)胞表面,因此這些分子的表達(dá)缺乏特異性。

叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員Foxp3是目前人CD4+CD25+Treg細(xì)胞比較特異的形態(tài)和功能性指標(biāo)，在Treg細(xì)胞的發(fā)育、分化和成熟以及功能維持方面起著重要作用，被認(rèn)為是CD4+CD25+Treg細(xì)胞的最敏感標(biāo)記[5]。Foxp3在Treg細(xì)胞的組成性表達(dá)是該細(xì)胞亞群發(fā)揮功能的前提。人類同源基因 Foxp3的突變可引起X染色體性聯(lián)綜合征。然而，F(xiàn)oxp3是細(xì)胞核產(chǎn)物，不在細(xì)胞表面表達(dá)，因此不能直接單獨作為Treg細(xì)胞的選擇性標(biāo)記。

大多數(shù)人類CD4+T 細(xì)胞可表達(dá) CD127分子(IL-7受體的一條鏈)。研究顯示，CD4+CD25+Treg細(xì)胞低表達(dá) CD127分子，并且CD127 與 Foxp3 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。聯(lián)合應(yīng)用CD25 和 CD127可得到高純度的 Treg 細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)CD49d與Foxp3的表達(dá)也呈負(fù)相關(guān)，CD49d與CD127 聯(lián)合檢測有助于得到高純度的Treg 細(xì)胞。

1.2 CD4+CD25+Treg細(xì)胞的免疫功能特性

CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能特征。前者表現(xiàn)為對IL-2單獨刺激或CD3單抗和CD28單抗聯(lián)合作用呈低反應(yīng)狀態(tài)，也不分泌IL-2，但在高濃度IL-2或抗CD28單抗刺激下并經(jīng)T 細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)信號，CD4+CD25+Treg細(xì)胞可活化并增殖；后者表現(xiàn)在經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激活化后能抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和增殖，并且這種免疫抑制性不具有MHC限制性，即為非抗原特異性，能夠抑制同種同型或同種異型T細(xì)胞的增殖。

2 CD4+CD25+Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制機制

Treg細(xì)胞對效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制作用可以通過細(xì)胞接觸和分泌細(xì)胞因子方式實現(xiàn)。隨著對參與Treg細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活動的效應(yīng)分子研究的逐步深入，依據(jù)分子特性及功能的不同，可將 Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制機制概括為4種基本途徑。

2.1 依賴抑制性細(xì)胞因子的途徑

nTreg細(xì)胞分泌多種免疫抑制性細(xì)胞因子，其中轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-10被認(rèn)為是介導(dǎo)Treg細(xì)胞免疫抑制的關(guān)鍵因子。TGF-β 對機體多種免疫細(xì)胞的生長、分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。它可抑制IL-1和IL-2的分泌，進(jìn)而抑制T細(xì)胞增殖。Frimpong-Boateng 等[6]發(fā)現(xiàn)，Treg 細(xì)胞可通過分泌 TGF-β 抑制NK細(xì)胞的殺傷功能。此外，TGF-β可抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)共刺激分子[7]，從而抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。IL-10可以抑制單核細(xì)胞、NK細(xì)胞的活化及Th1細(xì)胞合成IL-2等細(xì)胞因子，抑制DC和巨噬細(xì)胞 MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)及降低抗原提呈作用，從而起到免疫抑制的功能。Miriam 等[8]證實黑色素瘤組織中的IL-10能降低特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)的靈敏性，并抑制瘤抗原提呈。此外，Treg細(xì)胞可高表達(dá)CD25(IL-2受體的α鏈)，競爭性結(jié)合T細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子IL-2，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖分化。同時Treg 細(xì)胞結(jié)合 IL-2后又可促進(jìn)自身增殖分化，進(jìn)一步增強對效應(yīng) T 細(xì)胞的免疫抑制作用[9]。纖維蛋白原樣蛋白2(fibrinogenfi-like protein 2，F(xiàn)GL2)是Treg細(xì)胞的另一種重要的抑制因子，可通過FcγRⅡb受體介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)，被認(rèn)為是Treg細(xì)胞發(fā)揮功能的標(biāo)記[10]。靶向去除小鼠中的FGL2，會導(dǎo)致DC、T、B細(xì)胞的免疫反應(yīng)增強和自免性腎病的發(fā)生。

2.2 破壞細(xì)胞代謝的途徑

Treg細(xì)胞可破壞效應(yīng)靶細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)、代謝途徑及信號傳導(dǎo)通路，繼而抑制其免疫反應(yīng)。第二信使cAMP則參與了該過程。Treg細(xì)胞通過縫隙連接將cAMP直接導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過消耗 IL-2誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。Treg細(xì)胞也可通過增強腺苷酸依賴的信號傳導(dǎo)，間接提高靶細(xì)胞內(nèi)cAMP水平。此外，Treg可通過CD39和CD73水解ATP酶，提高細(xì)胞微環(huán)境中腺苷酸水平，進(jìn)而活化效應(yīng)細(xì)胞上腺苷酸受體A2A，產(chǎn)生免疫抑制作用[11]。腺嘌呤二核苷酸(NAD)可影響Treg細(xì)胞表型和功能，它可通過細(xì)胞溶解或非溶解的方式釋放入胞外，通過ADP糖基化活化P2X7受體，繼而介導(dǎo)T細(xì)胞死亡。

2.3 溶解細(xì)胞的途徑

Treg細(xì)胞可通過釋放顆粒酶A/B、穿孔素或通過TRAIL-DR5(腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體-死亡受體-5)途徑直接殺傷效應(yīng)細(xì)胞，起到免疫抑制作用。人源CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞在抗CD3和CD46抗體共同作用下活化,可誘導(dǎo)表達(dá)顆粒酶 A(granzyme A)，通過穿孔素依賴機制去除活化的 CD4+和CD8+T細(xì)胞，CD14+單核細(xì)胞和成熟及未成熟的DC。此外，靶細(xì)胞可通過過表達(dá)顆粒酶特異性抑制劑，抵抗細(xì)胞死亡。Suzan等[12]發(fā)現(xiàn)在體外試驗中，去除顆粒酶B的Treg細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞擴增的抑制作用減弱。人源和鼠源Treg細(xì)胞可高表達(dá)溶細(xì)胞半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-1表達(dá)不足的鼠源Treg細(xì)胞在體外試驗中顯示免疫抑制功能受損。

2.4 調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞(APC)功能的途徑

Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制還可通過調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞的功能間接實現(xiàn)，其中某些抑制性膜相關(guān)分子在該途徑中發(fā)揮重要作用。最具代表性的就是細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)，它也是Treg 表達(dá)的重要分子標(biāo)記，可與DC表面的CD80和CD86共同作用，誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞(DC為主)產(chǎn)生吲哚-2，3-加雙氧酶(IDO)，該酶可降解細(xì)胞代謝必需的色氨酸，色氨酸缺失會抑制 T 細(xì)胞活化，從而導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡。此外，CTLA-4還可通過與B細(xì)胞、T細(xì)胞、DC和巨噬細(xì)胞上的配體B-7結(jié)合，抑制靶細(xì)胞的活化與增殖。Wing 等研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4 誘導(dǎo)缺陷的荷瘤小鼠可發(fā)生全身性淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生顯著的抗腫瘤免疫反應(yīng)，引起腫瘤消退。

有研究發(fā)現(xiàn)另一種膜相關(guān)抑制因子，即淋巴細(xì)胞活化基因-3(lymphocyte activationgene-3，LAG-3/CD233)。它是表達(dá)于Treg細(xì)胞上的跨膜蛋白，也是CD4分子相關(guān)黏附蛋白，可與抗原遞呈細(xì)胞的MHCⅡ結(jié)合。當(dāng)Treg和DC相互作用時，LAG-3與MHCⅡ結(jié)合后會誘導(dǎo)免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)介導(dǎo)的抑制信號通路，產(chǎn)生負(fù)向信號，繼而抑制DC成熟，下調(diào)其免疫激活的能力。體內(nèi)外試驗均顯示應(yīng)用LAG-3抗體可阻斷Treg細(xì)胞抑制功能。然而LAG-3缺失小鼠未發(fā)生自免性疾病。

3 CD4+CD25+Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的分布及意義

CD4+CD25+Treg細(xì)胞以其獨特的免疫抑制作用，影響機體抗腫瘤免疫，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，并進(jìn)一步影響腫瘤的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。很多證據(jù)表明在肺癌、乳腺癌、宮頸癌及腎癌等不同惡性腫瘤患者的外周血、腫瘤局部及腫瘤浸潤淋巴結(jié)中，CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例增高，并顯示出與疾病進(jìn)程及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Shah等[13]證實腫瘤局部浸潤CD4+Fox3+Treg細(xì)胞比例較高的宮頸鱗癌患者，其5年生存率顯著降低。Shen等[14]發(fā)現(xiàn)胃癌患者中，瘤內(nèi)Fox3+Treg細(xì)胞比例增高者的總生存期相對縮短。Mahmoud等[15]報道乳腺癌患者外周血及癌組織中可檢測到Treg細(xì)胞比例增高。同時，單因素分析顯示瘤內(nèi)及癌旁基質(zhì)中Fox3+Treg細(xì)胞數(shù)目與乳腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Bachy等[16]發(fā)現(xiàn)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)患者外周血Treg細(xì)胞水平升高，化療后未完全緩解組Treg細(xì)胞水平比完全緩解組高。Lin等[17]報道瘤內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞比例與肝細(xì)胞癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。Liotta等[18]研究證實在腎細(xì)胞癌患者的腫瘤浸潤淋巴結(jié)和外周血中Treg細(xì)胞數(shù)均上升，且前者升高顯著，并與預(yù)后不良相關(guān)。Kang等[19]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)對于腎透明細(xì)胞癌患者，腫瘤浸潤淋巴結(jié)中增高的Treg細(xì)胞可作為總生存率的獨立預(yù)測指標(biāo)之一，并與增高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率和降低的無復(fù)發(fā)生存率密切相關(guān)。Shimizu等[20]報道腫瘤浸潤Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)目與淋巴結(jié)陰性非小細(xì)胞肺癌患者的無復(fù)發(fā)生存率呈負(fù)相關(guān)。上述眾多研究結(jié)果表明Treg細(xì)胞在多種實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的微環(huán)境中普遍增高，并且與腫瘤轉(zhuǎn)歸及預(yù)后有密切關(guān)系。

腫瘤微環(huán)境中CD4+CD25+Treg細(xì)胞積聚的具體機制仍不明確，可能與以下因素有關(guān)：①腫瘤細(xì)胞可通過分泌IL-10、IL-2和TGF-β等因子誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞擴增，并誘導(dǎo)CD4+CD25-Treg向CD4+CD25+Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化；②腫瘤細(xì)胞分泌的CCL22可與CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)的CCR4(趨化因子CCL22受體)相結(jié)合，繼而使Treg細(xì)胞在腫瘤局部富集；③抗原遞呈細(xì)胞可通過腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)一步擴增CD4+CD25+Treg 細(xì)胞；④在由Fas-Fasl介導(dǎo)的凋亡中，CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T細(xì)胞存在敏感性上的差異，腫瘤通過分泌細(xì)胞因子選擇性地誘導(dǎo) CD4+CD25-T細(xì)胞凋亡[21]。

腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用已被廣泛認(rèn)可。然而與上述研究結(jié)果有所不同的是，腫瘤局部積聚Foxp3+Treg細(xì)胞，并非總與預(yù)后不良相關(guān)。某些腫瘤，尤其是結(jié)直腸癌，局部Foxp3+Tregs的比例與預(yù)后呈正相關(guān)。Salama等發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤組織中Foxp3+Treg細(xì)胞比例較高的結(jié)直腸癌患者，其生存期相對延長。這一發(fā)現(xiàn)已被Frey等[22]證實。Bron等[23]報道在口咽癌、口腔鱗癌患者和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的頭頸部鱗癌患者中，腫瘤浸潤Foxp3+Treg細(xì)胞普遍增多，并與延長的總生存期相關(guān)。Lee等[24]研究發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌患者的腫瘤局部積聚的Foxp3+Treg細(xì)胞與其延長的生存期密切相關(guān)。在典型的霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤中高水平的Treg細(xì)胞可改善患者生存率[25]。對于這些研究結(jié)果，不排除某些腫瘤的預(yù)后可能更多的是與激活的CD4+或CD8+T細(xì)胞相關(guān)，并非僅是Foxp3+Treg細(xì)胞。然而，現(xiàn)有研究尚未能對此做出合理解釋。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為Treg細(xì)胞能抑制機體抗腫瘤免疫，促進(jìn)腫瘤發(fā)展。腫瘤微環(huán)境中Treg水平的升高往往提示預(yù)后不良。

4 CD4+CD25+Treg細(xì)胞與腫瘤免疫治療

腫瘤的免疫治療已成為繼手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療之后又一種重要的治療手段。最近的研究[26]表明Treg細(xì)胞在腫瘤治療中的作用是復(fù)雜多樣的。盡管如此，體內(nèi)清除Treg細(xì)胞可提高機體抗腫瘤免疫能力，這一觀點被普遍接受。眾所周知，低劑量的環(huán)磷酰胺具有免疫調(diào)節(jié)特性，大量的腫瘤動物模型實驗顯示，應(yīng)用環(huán)磷酰胺去除Treg細(xì)胞，可促進(jìn)效應(yīng)性T細(xì)胞功能的恢復(fù)。但有研究證實此法對腫瘤患者的免疫治療效果欠佳。目前去除Treg細(xì)胞的方法包括抗CD25單克隆抗體、咪喹莫特、弗達(dá)拉濱、抗-CTLA-4 單克隆抗體、Toll 樣受體配體等。Pedroza-Gonzalez等[27]研究表明對于原發(fā)性肝癌或結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移癌患者，應(yīng)用可溶性GITR配體(GITRL)能在一定程度上阻礙腫瘤浸潤Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。由于CD25、CTLA-4等并非Treg 細(xì)胞所特有，因此，去除Treg細(xì)胞聯(lián)合其他免疫治療(如瘤苗、化療藥物、過繼性輸入TIL細(xì)胞等)也許是最佳的臨床選擇。Rech等[28]證實聯(lián)合應(yīng)用抗CD25單抗和瘤苗可顯著、持久地降低轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者體內(nèi)的Treg細(xì)胞數(shù)目。Duraiswamy等[29]研究顯示靶向抑制PD-1/PD-L1信號通路可在增強效應(yīng)性T細(xì)胞功能的同時，抑制Treg細(xì)胞功能，并提出聯(lián)合應(yīng)用抗PD-1、抗CTLA-4抗體及瘤苗可有效抑制腫瘤，但需進(jìn)一步的臨床試驗證實?？笴TLA-4抗體Ipilimumab已于2011年先后被FDA、歐盟委員會批準(zhǔn)用于黑色素瘤患者的治療。PD-1、PD-L1阻斷抗體已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗。

然而，由于Treg細(xì)胞在腫瘤治療中的作用并非完全明了，Treg細(xì)胞的清除也許是把雙刃劍。一項研究[30]顯示，對于未接受過化療的結(jié)腸癌患者，腫瘤微環(huán)境高表達(dá)Foxp3+Treg細(xì)胞組比低表達(dá)組在總生存期及無疾病進(jìn)展生存期方面，具有顯著優(yōu)勢。因此，在抗腫瘤免疫治療中，是選擇清除還是擴增Treg細(xì)胞則尤為重要，相關(guān)的臨床實驗在進(jìn)一步研究中。

總之，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫功能密切相關(guān)。Treg細(xì)胞可能控制著效應(yīng)性細(xì)胞的活化和增殖，具有抑制免疫應(yīng)答的作用，與腫瘤免疫逃逸關(guān)系密切。有關(guān)腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的水平對腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及預(yù)后影響的報道不一，其具體作用機制有待于進(jìn)一步研究。目前去除Treg細(xì)胞是抗腫瘤免疫治療的主要手段，進(jìn)一步探索Treg細(xì)胞對腫瘤免疫功能影響的細(xì)胞及分子作用機制，將可能為臨床治療提供新的思路。

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