蘇紅艷張馨穎李 博陳 曼王習(xí)文夏志平

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春 130118；2.軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130118；3.軍事獸醫(yī)、研究所，吉林長春 130118）

液相芯片技術(shù)及其在傳染病檢測的應(yīng)用

蘇紅艷1張馨穎1李 博2陳 曼2王習(xí)文2夏志平*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春 130118；2.軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130118；3.軍事獸醫(yī)、研究所，吉林長春 130118）

液相芯片技術(shù)，又稱流式熒光技術(shù)、懸浮式點陣技術(shù)或微球依賴的懸浮點陣技術(shù)，是基于美國Luminex公司研制的多功能流式點陣儀，它實現(xiàn)了多種技術(shù)的有機(jī)整合，如計算機(jī)運算、編碼微球、應(yīng)用流體學(xué)、激光技術(shù)及高速數(shù)字信號處理，其主要特點在于靈敏度和檢測特異性較高。該技術(shù)在抗原抗體檢測、核酸研究、受體和配體識別分析、酶學(xué)分析及免疫分析等研究中得到了廣泛應(yīng)用。

1 液相芯片技術(shù)的原理

Luminex xMAP 系統(tǒng)所使用的5.6μm 聚苯乙烯微球具有大小均一的特點，按照嚴(yán)格的比例在每個微球的制作過程中精確摻入了熒光染料，并且為兩種不同的紅色分類，每種染料的濃度有10種，按照這兩種紅色分類熒光的不同比例，可以分為100種微球，確保了一個光譜地址對應(yīng)一個微球。每個微球表面能夠進(jìn)行不同的反應(yīng)，從而能夠同時在一個反應(yīng)管里進(jìn)行，并且其不同反應(yīng)能夠檢測出100種。在報告分子上第3種熒光素偶聯(lián)能夠定量發(fā)生在微球表面的反應(yīng)。通過 Luminex100TM分析儀的兩束激光快速液流傳送微球排成單列。當(dāng)紅色二極管激光（635 nm/10mW）能夠?qū)ξ⑶蛑械姆诸悷晒馊玖袭a(chǎn)生不同程度的影響時，此時便可以確定被測物的定性；如果釔鋁石榴石激光（532nm/13mW）能夠有效激發(fā)微球表面上的報告熒光素，此時便可以確定被測物的定量。最后將上述實驗組采集的數(shù)據(jù)經(jīng)計算機(jī)處理分析后可直接生成判斷結(jié)果。

2 液相蛋白芯片技術(shù)在傳染病檢測中的應(yīng)用

“三明治夾心”免疫測定法是液相蛋白芯片的基本原理，與酶聯(lián)免疫測定法相類似。在待檢物的抗體的情況下，則比較簡單，這主要由于抗體具有Fc段和Fab段，針對Fab段，在微球上可與它的抗原共價結(jié)合，而針對Fc段，報告分子為熒光素所標(biāo)記的二抗即可。在待檢物為抗原的情況下，則要求該抗原的抗原表位至少要有兩個，在微球上先與待檢物的一種抗體實現(xiàn)共價結(jié)合，針對待檢物再加入標(biāo)記有熒光素的另一抗原表位的抗體，以此實現(xiàn)雙抗夾心反應(yīng)。

2.1 病毒性傳染病病原體的檢測

目前，在傳染性疾病診斷領(lǐng)域研究方面，國內(nèi)外已有許多的研究報道。對于傳染病檢測的反應(yīng)原理，液相蛋白芯片技術(shù)類似于ELISA法。在建立反應(yīng)體系中可以自行制備探針交聯(lián)微球，分析時也可以使用種類繁多的商品化試劑盒，有利于促進(jìn)科研工作的發(fā)展。吳亞玲等建立的液相芯片法利用雙抗體夾心法原理檢測人血清中的乙型肝炎病毒表面抗原.

因HBsAg可以分為不同的亞型，其主要是根據(jù)血清學(xué)特性進(jìn)分類，所以在實驗中進(jìn)行包被時我們主要采用的單克隆抗體有4種，有利于反應(yīng)不同亞型，從而能有效提高檢測的敏感性。但實際上對于陽性標(biāo)本經(jīng)過每一種單克隆抗體都無法檢測出，由于單克隆抗體的來源不同而檢測出的陽性率具有一定差異性，但相互之間能夠?qū)崿F(xiàn)互補。

2.2 病毒性傳染病抗體的檢測

Steve等建立并評估了牛皰疹病毒1，牛副流感3、牛病毒性腹瀉）和牛呼吸道合胞體病毒的抗體的液相芯片多重分析聯(lián)合檢測。姚麗等建立一種高效的人乳頭狀瘤細(xì)胞病毒血清學(xué)檢測方法，重組質(zhì)粒表達(dá)HPV16/18E6和E7蛋白，同微球偶聯(lián)后作為抗原，應(yīng)用Luminex系統(tǒng)檢測宮頸癌患者血清中的相應(yīng)抗體。楊永莉等分別建立鼠疫耶爾森菌、結(jié)核分支桿菌、流感病毒、SARS病毒及禽流感病毒等發(fā)熱病原抗體的液相蛋白芯片定量檢測方法，比較液相蛋白芯片方法與生物素-親和素系統(tǒng)方法的檢測能力。

3 液相基因芯片在傳染病檢測中的應(yīng)用

核酸分子雜交為液相基因芯片的基本原理，首先氨基化修飾核酸探針，微球表面的羧基與探針分子修飾后的氨基能實現(xiàn)共價結(jié)合，從而在微球表面實現(xiàn)交聯(lián)，在待檢核酸通過熒光標(biāo)記和PCR擴(kuò)增后，能夠與微球上的探針實現(xiàn)雜交反應(yīng)。在設(shè)計擴(kuò)增引物時，擴(kuò)增長度應(yīng)控制在100～300bp之間，從而在微球上能夠減少因雜交反應(yīng)而產(chǎn)生的位阻效應(yīng)，這樣對雜交反應(yīng)更有利。有相關(guān)學(xué)者雜交時采用400～1200bp的擴(kuò)增片斷，取得了較好的效果。這表明目的片段的二級結(jié)構(gòu)和基因序列決定著雜交效率。為了進(jìn)一步提高檢測效率，可使液相基因芯片結(jié)合多重PCR技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)同時在一個反應(yīng)管中進(jìn)行多項核酸檢測。

張萬菊等在198份臨床標(biāo)本經(jīng)VIDRL多重 PCR 方法和多指標(biāo)同步分析液態(tài)芯片技術(shù)-呼吸道病毒檢測試劑盒方法對甲型流感病毒、乙型流感、腺病毒、呼吸道合胞病毒、細(xì)小 RNA 病毒、副流感病毒、人偏肺病毒（hMPV）檢測，總陽性率和符合率分別為：38.89%、45.45%和72.22%。xRVP 方法除能檢測上述常見呼吸道病原體外，還能同時將部分病原體進(jìn)行分型，例如：Flu A 可檢測 H1、H3 和 H5 型，呼吸道合胞病毒可分出A和B型，副流感病毒可分出4個型別，冠狀病毒可檢測出冠狀病毒 NL63、229E、OC43、HKU1和 SARS-CoV。郭喜玲等運用液相芯片技術(shù)對甲型流感病毒的NP基因、乙型流感病毒的HA基因以及高致病性禽流感病毒的H5、N1基因同時進(jìn)行檢測，病毒核酸的最低檢出量為1pg，檢測特異性高。詹愛軍等建立可檢測新城疫病毒的液相芯片快速檢測技術(shù)。崔侖標(biāo)等在研究中利用液相芯片技術(shù)，對于腸道病毒通用的V P1、EV71和CAV16的基因、5’UTR基因的液相芯片制備都能夠識別。該芯片檢測方法不但能夠?qū)A V16、EV71與其它類型的腸道病毒感染進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，還可以對存在的腸道病毒進(jìn)行檢測。黨倩麗等的研究是在LuminexTM100技術(shù)平臺上開發(fā)對人乳頭瘤病毒基因分型的檢測和定量分析。胡瑞等根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的小腸結(jié)腸炎那爾森氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、產(chǎn)氣芙膜梭菌、鼠疫鄧爾森氏菌基因序列建立了液相基因芯片聯(lián)合檢測技術(shù)。