王金昌，鄭國華，傅筱沖

(江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌330096)

化學(xué)肥料的長期低效施用，會造成土壤中某些礦質(zhì)元素的過度積累和土壤理化性質(zhì)的變化，而且會引起環(huán)境污染，影響人類健康。研究人員發(fā)現(xiàn)植物根際促生細菌(plant growth promoting rhizohacteria，PGPR)能夠極大的減少這些化學(xué)肥料的利用。本實驗分離篩選到一株能解鉀又能解磷的路德維希腸桿菌，并對其促生性能進行試驗。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

鉀細菌分離培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g，Na2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4· 2H20 0.2 g，CaCO35.0 g，瓊脂15.0 g，鉀長石粉(200目)2.5 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2。

有機磷培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，NaCl 0.3 g，MgS04·7H2O 0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03g，CaCO35 g，瓊脂15～18 g，pH 7.0～7.5，(NH4)2SO40.5 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，酵母膏0.4 g，卵磷脂2 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 樣品采集

菜園土壤。

1.3 分離篩選方法

樣品+無菌水，梯度稀釋，涂布在鉀細菌分離培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)，挑取產(chǎn)生明顯溶解圈的單菌落，純化后保存。

1.4 上清液速效鉀測定

準(zhǔn)確稱取0.5 g鉀礦粉到95 mL解鉀培養(yǎng)基(無鉀)中，121℃滅菌20 min，待測菌懸液以5%的接種量接入搖瓶菌種，每個菌種做3個平行，同時設(shè)無接種對照37℃，160 rpm/min培養(yǎng)25 d，離心培養(yǎng)液，吸取4 mL離心上清液，利用火焰分光光度計法測鉀。

1.5 平板檢測分離到的細菌的解磷能力

用滅菌牙簽挑取菌株的單菌落點植于有機磷平板上，將平板倒置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長情況及透明圈產(chǎn)生情況。

1.6 有機磷液體培養(yǎng)中解磷能力測定

待測菌懸液以5%的接種量接種到有機磷液體培養(yǎng)基，置30℃，160 rpm/min振蕩培養(yǎng)5 d后，離心取2 mL上清液，采用K2S2O4消解，磷鉗藍比色法測定上清液磷含量。

1.7 菌種鑒定

細菌16S rDNA鑒定:收集LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)的菌體，采用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌的總DNA。利用16S rDNA通用引物進行PCR，PCR產(chǎn)物純化后和pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取重組質(zhì)粒進行測序，得到16S rDNA部分序列。16S rDNA序列通過BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行序列分析和同源性比對。

1.8 空心菜盆栽施肥實驗

當(dāng)菜子發(fā)芽后長到5～6寸，6片小葉(自發(fā)不帶土移栽菜秧20顆，分為2組。第1組加分離篩選到的活菌液2 mL/砵，第2組加死分離篩選到的死菌液(高壓滅菌)2 mL/砵。每天早晚各澆1次水，第10 d施尿素濃度5 μg/mL，用量:100 mL/砵。第87 d收菜，洗掉泥土，晾干稱重。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 分離篩選結(jié)果

本實驗分離篩選到一株能分解鉀礦石的細菌K3，見圖1。

圖1 分解鉀礦石的細菌K3菌落圖

2.2 速效鉀產(chǎn)生能力分析

將K3菌株以5%的接種量接入搖瓶菌種，每個菌種做3個平行，同時設(shè)無接種對照37℃，160 r/min培養(yǎng)25 d，離心培養(yǎng)液，吸取4 mL離心上清液，利用火焰分光光度計法測鉀。結(jié)果接種培養(yǎng)液中速效鉀增加百分比為36%。

2.3 分離細菌的解磷能力的檢測結(jié)果

K3菌株能明顯的產(chǎn)生溶磷圈，溶圈直徑達到了8 mm，D/d值為4，見圖2。

圖2 K3菌株產(chǎn)生的溶磷圈圖

2.4 K3菌株在有機磷液體培養(yǎng)基中解磷能力測定

用磷鉗藍比色法測定磷含量，K3菌株在原培養(yǎng)中磷含量為9.352 2 μg/mL，在有機磷液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，上清液的含磷量為3.164 5 μg/mL，解磷率達66.2%，解磷能力顯著。

2.5 菌種鑒定

收集LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)的菌體，采用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌的總DNA。通用引物 7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')進行PCR，PCR程序設(shè)定為預(yù)變性94℃5 mim，94℃ 30 s，55℃ 35 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)，延伸8 min，PCR產(chǎn)物結(jié)果見圖3。PCR產(chǎn)物純化后和pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取重組質(zhì)粒進行測序，測序得到16S rDNA部分序列，共 1 534 bp，提交 Gen-Bank，登錄號為KF770841。將 K3菌株的16S rDNA序列通過BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行序列分析和同源性比對，該菌株序列與腸桿菌屬中的路德維希腸桿菌同源性達97%。

2.6 空心菜盆栽施肥結(jié)果

空心菜盆栽施肥實驗結(jié)果見表1。從表1可見，活菌液有明顯的促進空心菜生長的能力。

圖3 PCR擴增K3菌株16S rDNA產(chǎn)物圖

表1 空心菜盆栽施肥實驗結(jié)果

3 討論

PGPR為植物提供N、P、K等肥料。土壤中的磷總量并不少，但土壤中95%以上的磷為無效形式，植物很難直接吸收利用。土壤中存在眾多的微生物能將植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)。具有這種能力的微生物稱為解磷菌或溶磷菌(Phosphate solubilizing microorganisms，PSM)。Gulati等發(fā)現(xiàn)不動桿菌BIHB 723會分泌葡萄糖、草酸、2-酮基葡萄糖、乳酸、蘋果酸和蟻酸來溶解磷酸三鈣和巖石中的磷［1］。并且不動桿菌BIHB 723既能溶解無機磷又能溶解有機磷，拌種能促進豌豆、鷹嘴豆、玉米、大麥生長［2］。我國約有60%的耕地缺鉀，耕地速效鉀含量正以每年(2～3)×106的速度下降，造成土壤中氮、磷、鉀3種元素比例失調(diào)，影響了農(nóng)業(yè)的發(fā)展。利用化學(xué)鉀肥補鉀是我國農(nóng)業(yè)中普遍使用并且見效較快的土壤速效鉀補充方法，但造成了土壤結(jié)構(gòu)破壞、有機質(zhì)含量下降，且污染嚴(yán)重、成本高。解鉀菌是從土壤中分離出的一種能分化鋁硅酸鹽和磷灰石類礦物的細菌，促進難溶性的鉀、磷、硅、鎂等養(yǎng)分元素轉(zhuǎn)化成可溶性養(yǎng)分，增加土壤中速效養(yǎng)分的含量，能作為微生物肥料，促進作物生長發(fā)育，提高產(chǎn)量［3］。土壤芽孢桿菌NBT是鉀釋放菌株，在K－缺乏土壤盆栽試驗研究發(fā)現(xiàn)它能促進棉花和葡萄生長，在棉花和葡萄土壤中添加難溶的K礦石粉，結(jié)果土壤鉀含量增加了30%和26%，細菌接種也導(dǎo)致地上植物氮、磷的含量提高［4］。

本實驗成功分離篩選到一株耐熱的既能解鉀又能解磷的路德維希腸桿菌，發(fā)現(xiàn)它也能促進空心菜的生長。龔鳳娟等從杜仲中也分離到路德維希腸桿菌，發(fā)現(xiàn)它具有1-羧基-1-氨基環(huán)丙烷(1-aminocy-clopropane-1-carboxylate，ACC)脫氨酶活性，ACC脫氨酶能裂解乙烯前體ACC，從而降低植物激素乙烯的水平，進而抑制乙烯對植物的三重反應(yīng)，促進植物根和莖伸長、生長，提高養(yǎng)分吸收和光捕獲面積，增加植物干物質(zhì)積累，而且擴增的根部組織能增強植物對根際微生物分泌或分解的促生物質(zhì)和土壤養(yǎng)分的有效利用［5］。趙現(xiàn)偉等還發(fā)現(xiàn)路德維希腸桿菌具有聯(lián)合固氮作用［6］。

本實驗篩選到的路德維希腸桿菌，既能解鉀又能解磷，可用于開發(fā)微生物肥料。

［1］ Arvind G，Vyas P，Sharma N，et al.Organic acid production and plant growth promotion as a function of phosphate solubilization by Acinetobacter rhizosphaerae strain BIHB 723 isolated from the cold deserts of the trans-Himalayas［J］.Achives of Microbiology，2010，192(11):975－983.

［2］ Arvind G，Vyas P，Rahi P，et al.Plant growth-Promoting and rhizosphere-competent acinetobacter rhizosphaerae strain BIHB 723 from the cold deserts of the himalayas［J］.Current Microbiology，2009，58(4):371－377.

［3］ 周毅峰，羅云霞，劉華中.解鉀菌的篩選［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009，3(27):285－288.

［4］ Sheng X F.Growth promotion and increased potassium uptake of cotton and rape by a potassium releasing strain of Bacillus edaphicus［J］.Soil Biology and Biochemistry，2005，37(10):1918－1922.

［5］ 龔鳳娟，恩特馬克·布拉提白，張宇鳳，等.具有ACC脫氨酶活性的杜仲內(nèi)生細菌的分離鑒定及其抗菌活［J］.微生物學(xué)通報，2011，38(10):1526－1532.

［6］ 趙現(xiàn)偉，Chaudhary Hassan Japed，何玉梅，等.先鋒牧草－香根草聯(lián)合固氮菌多樣性［J］.微生物學(xué)報，2009，49(11):1430－1437.