李瑤瑤，彭登科，董新姣

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州325035)

0 引言

微生物絮凝劑(MBF)，是由微生物產(chǎn)生的可使液體中不易沉降的固體懸浮顆粒、菌體細(xì)胞及膠體顆粒等凝聚沉淀的特殊高分子物質(zhì)，主要成分有糖蛋白、胞外多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和核酸等。微生物絮凝劑具有易生物降解，適用范圍廣，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，用量小，無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)的無機(jī)與有機(jī)高分子絮凝劑相比具有更廣泛的應(yīng)用前景。由于MBF不僅克服了無機(jī)和有機(jī)絮凝劑在使用安全和環(huán)境污染方面的問題，且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，所以MBF取代大部分傳統(tǒng)的無機(jī)高分子和合成有機(jī)高分子絮凝劑將成為一種趨勢(shì)［1～5］。但微生物絮凝劑目前存在生產(chǎn)條件較復(fù)雜、成本偏高等不足之處，其研究尚處于實(shí)驗(yàn)室階段。如何降低微生物絮凝劑成本，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者也曾利用淀粉廢水、味精廢水和豆制品廢水作為廉價(jià)替代培養(yǎng)基進(jìn)行微生物絮凝菌的培養(yǎng)，但研究報(bào)道還不多［6～8］。

本研究以高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌WN-2為研究對(duì)象，采用醬油廢水為培養(yǎng)基，利用高嶺土懸浮液對(duì)所產(chǎn)微生物絮凝劑進(jìn)行絮凝率測(cè)定，考察了各種條件如外加碳源、氮源、無機(jī)鹽、培養(yǎng)時(shí)間、pH值等因素對(duì)絮凝率的影響，優(yōu)化了培養(yǎng)條件，以期為高效微生物的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌由本實(shí)驗(yàn)室從溫州調(diào)味品有限公司活性污泥分離、篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖20.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，磷酸氫二鉀5.0 g，硫酸銨0.2 g，氯化鈉0.1 g，尿素0.5 g，酵母膏0.5 g，硫酸鎂0.2 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.5～8.5。

保藏培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH =7.0～7.2。

醬油廢水培養(yǎng)基取自海螺集團(tuán)生產(chǎn)醬油后所產(chǎn)生的醬油廢水。COD值為89 398.72 mg/L，NHN為90.2 mg/L，TN為102.8 mg/L，TP為3.7 mg/L，pH=5.27，其為車間的沖冼水和生產(chǎn)老抽時(shí)產(chǎn)生的廢糖蜜水混合在一起，主要成分為多糖，因此COD含量高。經(jīng)抽濾后，用于菌株的廉價(jià)培養(yǎng)。

1.1.3 高嶺土懸濁液 在100 mL量筒中加入80 mL蒸餾水，0.4 g高嶺土(化學(xué)純，平均粒度4.5 μm)，5 mL 1%CaCl2溶液，2 mL上清液待測(cè)樣品，再加蒸餾水至100 mL，制成4 g/L的高嶺土懸濁液(每次測(cè)定絮凝率時(shí)當(dāng)場(chǎng)配制)。

1.2 方法

1.2.1 絮凝率的測(cè)定 絮凝效果用絮凝率來表征。在100 mL量筒中加入80 mL蒸餾水，0.4 g高嶺土(化學(xué)純，平均粒度4.5 μm)，5 mL 1% CaCl2溶液，2 mL上清液待測(cè)樣品(取0.5 mL接種到50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，35℃，160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72 h后，將所得的培養(yǎng)液在10 000 r/min下離心15 min，得上清液)，再加蒸餾水至100 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0，然后倒入150 mL燒杯，放在磁力攪拌器上快速攪拌1 min，慢速攪拌3 min，靜置10 min，以吸管吸取一定深度的上清液于紫外可見分光光度計(jì)550 nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)以不加含絮凝劑的上清液作對(duì)照實(shí)驗(yàn)并用以下公式計(jì)算其絮凝率:

式中，A為對(duì)照上清液在550 nm處的吸光度，B為樣品上清液在550 nm處的吸光度。

1.2.2 不同廢水濃度對(duì)絮凝率的影響 將醬油廢水稀釋為原水的1/2、1/4、1/8后，將WN-2菌投入到培養(yǎng)基中，置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測(cè)定其絮凝率和COD，考察不同廢水濃度對(duì)絮凝率的影響。

1.2.3 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn) 采用單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，分別外加碳源、氮源、無機(jī)鹽、改變培養(yǎng)基中初始pH、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度選出絮凝菌在各種單因子改變時(shí)最優(yōu)條件。

不同外加碳源:分別加入各種碳源、葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖，質(zhì)量濃度為2 g/L，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測(cè)定其絮凝率，考察不同外加碳源對(duì)絮凝率的影響。

不同外加氮源:分別加入各種氮源、硝酸鉀、氯化銨、牛肉膏、蛋白胨，質(zhì)量濃度為3 g/L，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測(cè)定其絮凝率，考察不同外加氮源對(duì)絮凝率的影響。

不同外加無機(jī)鹽:分別加入各種無機(jī)鹽、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣，質(zhì)量濃度為0.2 g/L，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測(cè)其絮凝率，考察不同外加無機(jī)鹽對(duì)絮凝率的影響。

初始pH的選擇:pH值分別調(diào)至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測(cè)定其絮凝率，考察不同培養(yǎng)基初始pH值對(duì)絮凝率的影響。

培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的選擇:調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速分別為120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min，接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別測(cè)定其絮凝率，考察不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)絮凝率的影響。

培養(yǎng)時(shí)間的選擇:接種后置于160 r/min，30℃條件下培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h后，測(cè)定絮凝率，考察不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝率的影響，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同廢水濃度對(duì)絮凝率的影響

將醬油廢水進(jìn)行不同濃度稀釋，考察不同廢水濃度對(duì)絮凝率的影響其結(jié)果見表1。

表1 醬油廢水濃度對(duì)絮凝率的影響

由表1可見，最合適的配方為將醬油廢水稀釋為原來的1/4。醬油廢水本身的COD濃度太高，如原水的樣品和將原水稀釋為1/2的樣品，絮凝率分別為0%和43.90%。這是因?yàn)橛捎贑OD太高時(shí)，微生物的生長(zhǎng)受一定的抑制，而且培養(yǎng)基的濃度過高，廢水中的雜質(zhì)也影響絮凝效果;但將醬油廢水稀釋為原來的1/8時(shí)，因?yàn)镃OD的濃度太低，此時(shí)培養(yǎng)基中的碳源不足，菌生長(zhǎng)量?jī)H為4 031 mg/L，影響絮凝效果，絮凝率僅為48.91%。最合適的配方為將醬油廢水稀釋為原來的1/4，此時(shí)培養(yǎng)基的COD為23148 mg/L，絮凝率為77.44%，相比前2種廢水，由于其營(yíng)養(yǎng)豐富，只需原液濃度的1/4，即可滿足菌生長(zhǎng)的要求。而醬油廢水中COD之所以高，是因?yàn)檐囬g的沖冼水和生產(chǎn)老抽時(shí)產(chǎn)生的廢糖蜜水混合在一起，主要成分為多糖，因此COD含量高。其中COD的測(cè)定重鉻酸鉀法。

2.2 絮凝劑產(chǎn)生菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 不同外加碳源對(duì)絮凝率的影響 不同外加碳源對(duì)絮凝率的影響，結(jié)果如表2。

表2 不同碳源對(duì)絮凝率的影響

由表2可知，沒有外加碳源，直接利用醬油廢水作為培養(yǎng)基時(shí)，絮凝率為82.0%，加入葡萄糖，蔗糖和果糖均能促進(jìn)絮凝劑產(chǎn)生菌菌體生長(zhǎng)和絮凝劑合成，加入葡萄糖時(shí)的絮凝率最高，絮凝率為84.3%。但綜合總體數(shù)據(jù)看，外加碳源后，對(duì)絮凝率的提高不明顯，可能的原因是醬油廢水含有豐富的碳源，其中碳源的量足以滿足菌株的生長(zhǎng)，因此可不必外加碳源。

2.2.2 不同外加氮源對(duì)絮凝率的影響 不同外加氮源對(duì)絮凝率的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同氮源對(duì)絮凝率的影響

由表3可知，在沒有外加氮源的情況下，絮凝率為82.0%;外加硝酸鉀、氯化銨、牛肉膏、蛋白胨，絮凝率分別為82.1%、78.3%、83.1%、82.8%。從絮凝率來看，各種外加氮源條件下對(duì)絮凝率的提高不大，由此說明該醬油廢水含有較多的氮源，已滿足菌株的生長(zhǎng)需求，可不必外加氮源。

2.2.3 不同外加無機(jī)鹽對(duì)絮凝率的影響 不同外加無機(jī)鹽對(duì)絮凝率的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，在不外加無機(jī)鹽的時(shí)絮凝率為82.0%，外加磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣時(shí)，絮凝率分別為83.4%、81.3%、84.2%、87.1%，說明外加無機(jī)鹽對(duì)醬油廢水的絮凝率都有所增加，且在添加氯化鈣的情況下，對(duì)醬油廢水的絮凝率增加較多。

2.2.4 不同培養(yǎng)基初始pH值對(duì)絮凝率的影響pH值對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝具有很大的影響，太高或太低的pH值都不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)和絮凝劑的產(chǎn)生。一方面pH值過低或過高都會(huì)引起微生物表面電荷的改變，從而不利于細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收;另一方面過高或過低的pH值使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化，從而影響其生物活性。不同培養(yǎng)基初始pH值對(duì)絮凝率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，初始pH為6.0～8.0范圍內(nèi)具有較高的絮凝率，pH為7.0時(shí)最高絮凝率達(dá)81.1%。

圖1 不同初始pH對(duì)絮凝率的影響

2.2.5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝率的影響 不同培養(yǎng)溫度對(duì)絮凝率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度小于30℃時(shí)，WN-2菌所產(chǎn)絮凝劑的絮凝率隨溫度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)培養(yǎng)溫度30℃時(shí)絮凝率最高，絮凝率為80.2%。繼續(xù)升高培養(yǎng)溫度，絮凝率隨溫度升高而下降。這是由于微生物生命活動(dòng)和物質(zhì)代謝都與溫度密切相關(guān)，溫度過高或過低都會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性，從而影響絮凝劑的絮凝率。

圖2 不同溫度對(duì)絮凝率的影響

2.2.6 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)絮凝率的影響 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)絮凝率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，搖床轉(zhuǎn)速在整個(gè)范圍內(nèi)對(duì)絮凝率影響并不大，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速小于160 r/min時(shí)，隨著搖床轉(zhuǎn)速增加絮凝率增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min之后，絮凝率趨緩而下降，但仍具有較高的絮凝率，最佳搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

圖3 轉(zhuǎn)速對(duì)絮凝率的影響

2.2.7 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝率的影響 微生物絮凝劑的生產(chǎn)與菌株培養(yǎng)時(shí)間有密切關(guān)系，不同培養(yǎng)時(shí)間下，菌株表現(xiàn)出不同的絮凝率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，WN-2在培養(yǎng)時(shí)間36 h達(dá)到最高絮凝率80.6%。在剛接種到發(fā)酵培養(yǎng)液的一段時(shí)間內(nèi)，由于菌株由生長(zhǎng)的遲緩期到對(duì)數(shù)期，其生長(zhǎng)代謝逐漸旺盛，絮凝率也隨之提高，WN-2在培養(yǎng)時(shí)間24 h后，絮凝率趨于平緩并開始下降，可能是由于體系中解絮凝率酶的產(chǎn)生或生長(zhǎng)后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡所致［9］。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)絮凝率的影響

2.2.8 最佳培養(yǎng)條件下的絮凝率 將以上單因素實(shí)驗(yàn)所獲得WN-2菌株的最佳絮凝條件進(jìn)行組合，在最佳條件下將WN-2菌接入醬油廢水培養(yǎng)基內(nèi)并對(duì)高嶺土懸濁液進(jìn)行絮凝實(shí)驗(yàn)，測(cè)得其絮凝率為93.6%，由此可見，在最佳的絮凝條件下，菌株WN-2具有較強(qiáng)的絮凝能力。

表5 微生物產(chǎn)絮凝劑的最優(yōu)培養(yǎng)條件

3 結(jié)論

(1)通過單因素條件試驗(yàn)得出WN-2對(duì)高嶺土懸濁液的最佳絮凝條件為:最佳外加無機(jī)鹽為氯化鈣，濃度為0.2 g/L;最佳培養(yǎng)時(shí)間為36 h;最佳pH為7.0;最佳培養(yǎng)溫度為30℃;最佳搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。在最佳培養(yǎng)條件下，測(cè)得其絮凝率為93.6%。

(2)醬油廢水中，外加氮源和外加碳源對(duì)微生物產(chǎn)絮凝劑的絮凝率影響均不大，表明該廢水中含有較為豐富的碳源和氮源，可以滿足微生物的生長(zhǎng)需求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用醬油廢水作為替代培養(yǎng)基可以實(shí)行廢物的資源化利用。

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